专利名称：一种微生物发酵生产蛋白饲料的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体地说，涉及一种利用微生物发酵生产蛋白饲料的方法。
背景技术：
随着养殖业的快速发展，我国蛋白饲料短缺、人畜争粮的矛盾日益突出。利用微生物对秸杆、玉米芯进行生物转化，以此生产高蛋白菌体饲料已成为人们解决上述问题的重要手段之一。然而，由于单菌种存在酶系不全的缺陷，因此按照传统方法无法大规模降解秸杆、玉米芯中的纤维素、半纤维素以及木质素。为解决上述问题，目前通常采用多菌种混合发酵的方法生产蛋白饲料。如CN102178034B公开的一种生产高蛋白饲料的方法，就是利用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌和米曲霉多菌种进行混合发酵的。其具体方法包括以下步骤①将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌和米曲霉分别用平板培养基在33-36°C条件下培养48-72小时；②将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌和米曲霉分别进行扩大培养；③将扩大培养的菌株按照一定的比例混合后加入相应的培养基中培养得到复合菌液；④将玉米浆加入相应的水解酶，发酵；⑤在发酵后的混合液中加入营养液、复合菌液，通气、发酵；⑥所得玉米浆发酵液喷在麸皮或豆柏上，搅拌、烘干由此制得高蛋白饲料。从上述方案可以看出，多菌种混合发酵生产蛋白饲料的工艺方法步骤繁琐，制备成本高。为简化生产工艺，也有人采用热带假丝酵母、产朊假丝酵母或黑曲霉进行单一菌种发酵，但效果最好的黑曲霉，其产品中粗蛋白质量分数仅能达到22%。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物发酵生产高品质蛋白饲料的方法，该方法步骤简单、成本低廉。为实现本发明目的，本发明提供了一种蛋白饲料的生产方法:该方法以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YPH499-sptl5_20为发酵菌种，接入种子培养基进行培养，得到种子培养液；然后将此种子培养液转接于发酵培养基，在25-35°C下，180-220r/min振荡发酵24-72h，固液分离，收集固体，得到所述蛋白饲料；所述酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) YPH499-sptl5_20,其保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号是CGMCC N0.7194，保藏日期是2013年I月23日；本发明所述酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YPH499-sptl5_20 的构建方法如下:克隆单倍体酿酒酵母BY4742基因组的起始转录因子sptl5，得到正确的转录因子sptl5基因，以其为模板进行突变。通过改进的易错PCR条件来获得较高的突变率，获得转录因子sptl5基因突变库，利用穿梭质粒pYX212构建的T载体简单高效地转化突变库在不能以木糖为唯一碳源发酵的酿酒酵母YPH499中表达，获得能够利用纤维素水解液的重组酿酒酵母 YPH44-sptl5-20。所述发酵培养基，其配方以质量体积比浓度计为:尿素0.05-0.15%，硫铵0.05-0.15%, KH2PO40.12-0.2%, MgSO4.7Η200.04-0.06%，酵母膏 0.05-0.15%，其余为玉米芯水解液；该配方的优选组成为:尿素0.1%，硫铵0.1%，KH2PO40.16%，MgSO4.7Η200.05%，酵母膏0.1%，其余为玉米芯水解液；该发酵培养基的pH值范围为3-11 ；所述玉米芯水解液，其制备方法如下:将玉米芯粉碎后烘干至恒重，得到玉米芯颗粒；将上述玉米芯颗粒加入到质量体积比浓度为1-3%的无机酸水溶液中，于100-120°c下水解0.5-1.5h ;所述玉米芯颗粒与无机酸水溶液的质量体比为1: 10-20。上述制备方法所采用的无机酸可以选择HC1、H2SO4, H3PO4中任意一种；其中，优选HCl。上述生产方法所采用的发酵培养基，其pH值优选5-7。上述生产方法所采用的种子培养基，其可选配方以质量体积比浓度计为:木糖4-6%,尿素 0.2-0.4%,硫铵 0.1-0.2%, KH2PO40.05-0.15%, MgSO4.7Η200.04-0.06%,酵母膏0.05-0.15%，其余为水。该配方的优选组成为:木糖5%，尿素0.3%，硫铵0.15%,KH2PO40.1%，MgSO4.7Η200.05%，酵母膏 0.1%，其余为水。上述生产方法所得种子培养液，其活菌浓度范围是5X 107-2X 108cfu/mL，优选lX108cfu/mL。该活菌浓度下的种子培养液接入发酵培养基后，菌株繁殖迅速，成活率高。接种时，可以选择8-12%的接种量，优选10%。本发明以廉价易得的玉米芯为原料，采用单一菌种发酵法制备蛋白饲料，步骤简单、成本低廉，所得产品蛋白含量高。采用本发明提供的水解条件，能够很好地将玉米芯颗粒中的半纤维素降解为木糖、将纤维素部分降解为葡萄糖，所得木糖、葡萄糖总产率高达4.2g/g玉米芯。采用本发明提供的酿酒酵母YPH499-sptl5-20，能够高效地利用玉米芯水解液中的木糖和葡萄糖，利用率分别高达85%以上。所得发酵液中，固形物含量高达8.5-8.7g/L ;经固液分离所得固体可直接作为蛋白饲料，其中粗蛋白含量高达38%以上，远高于通常蛋白饲料中20%的粗蛋白含量，具有良好的经济效益和推广前景。
具体实施例方式下面用具体实施例来进一步说明本发明的内容，但并不以任何方式意味着对本发明进行限制。下列实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。下列实施例中所采用的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) YPH499_spt 15-20,其保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号是CGMCC N0.7194，保藏日期是2013年I月23日。实施例1制备玉米芯水解液:将一定量的玉米芯粉碎成颗粒，过40目筛，烘干至恒重，得到玉米芯颗粒2kg ;将该玉米芯颗粒加入到20L质量体积比浓度为1%的H2SO4水溶液中，于100°C下水解0.5h，得到玉米芯水解液备用。制备种子培养基:分别称取木糖400g，尿素20g，硫铵10g，KH2P045g,MgSO4.7H204g，酵母膏5g，加水至10L，按照常规方法配制成种子培养基备用。制备发酵培养基:分别称取尿素5g，硫铵5g，KH2P0412g，MgSO4.7Η2048，酵母膏5g，添加上述玉米芯水解液至10L，用盐酸调节pH至3-5，按照常规方法配制成发酵培养基备用。发酵制备蛋白饲料:步骤一、将酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) YPH499-sptl5_20 接入上述种子培养基进行培养，培养至其中活菌的浓度为5X107cfu/mL，得到种子培养液；步骤二、将上述种子培养液以8%的接种量转接于上述发酵培养基，在25°C下，180r/min振荡发酵24h，固液分离，收集固体得到所述蛋白饲料85g，经微量凯氏定氮法测定其中粗蛋白的质量含量为38%。实施例2制备玉米芯水解液:将一定量的玉米芯粉碎成颗粒，过40目筛，烘干至恒重，得到玉米芯颗粒2kg ;将该玉米芯颗粒加入到40L质量体积比浓度为3%的H3PO4水溶液中，于120°C下水解1.5h，得到玉米芯水解液备用。制备种子培养基:分别称取木糖600g，尿素40g，硫铵20g，KH2P0415g,MgSO4.7H206g，酵母膏15g，加水至10L，按照常规方法配制成种子培养基备用。制备发酵培养基:分别称取尿素15g，硫铵15g，KH2P0420g, MgSO4.7H206g，酵母膏15g，添加上述玉米芯水解液至10L，用Ca(OH)2调节pH至7-11，按照常规方法配制成发酵
培养基备用。发酵制备蛋白饲料:步骤一、将酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) YPH499-sptl5_20 接入上述种子培养基进行培养，培养至其中活菌的浓度为2X108cfu/mL，得到种子培养液；步骤二、将上述种子培养液以12%的接种量转接于上述发酵培养基，在35°C下，220r/min振荡发酵72h，固液分离，收集固体得到所述蛋白饲料86g，经微量凯氏定氮法测定其中粗蛋白的质量含量为39%。实施例3制备玉米芯水解液:将一定量的玉米芯粉碎成颗粒，过40目筛，烘干至恒重，得到玉米芯颗粒2kg ;将该玉米芯颗粒加入到30L质量体积比浓度为2%的HCl水溶液中，于110°C下水解lh，得到玉米芯水解液备用。制备种子培养基:分别称取木糖500g，尿素30g，硫铵15g，KH2PO4IOg,MgSO4.7H205g，酵母膏10g，加水至10L，按照常规方法配制成种子培养基备用。制备发酵培养基:分别称取尿素10g，硫铵10g，KH2P0416g, MgSO4.7H205g，酵母膏10g，加玉米芯水解液至10L，用盐酸调节pH至5-7，按照常规方法配制成发酵培养基备用。发酵制备蛋白饲料:步骤一、将酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) YPH499-sptl5_20 接入上述种子培养基进行培养，培养至其中活菌的浓度为lX108cfu/mL，得到种子培养液；步骤二、将上述种子培养液以10%的接种量转接于上述发酵培养基，在30°C下，200r/min振荡发酵36h，固液分离，收集固体得到所述蛋白饲料87g，经微量凯氏定氮法测定其中粗蛋白的质量含量为41%。
权利要求
1.一种微生物发酵生产蛋白饲料的方法，其特征在于:将酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YPH499- sptl5_20接入种子培养基进行培养，得到种子培养液，然后转接于发酵培养基，在25-35°C下，180-220 r/min振荡发酵24_72h，固液分离，收集固体得到所述蛋白饲料； 所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YPH499_ sptl5_20,其保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号是CGMCC N0.7194，保藏日期是2013年月23日； 所述发酵培养基，其配方以质量体积比浓度计为:尿素0.05-0.15%，硫铵0.05-0.15%，KH2PO4 0.12-0.2%, MgSO4*7H20 0.04-0.06%，酵母膏 0.05-0.15%，其余为玉米芯水解液，所述发酵培养基的PH值为3-11 ； 所述玉米芯水解液，其制备方法是将玉米芯粉碎后烘干至恒重，得到玉米芯颗粒；将此玉米芯颗粒加入到质量体积比浓度为1-3%的无机酸水溶液中，于100-120°C下水解0.5-1.5h ;所述玉米芯颗粒与无机酸水溶液的质量体积比为1:10-20。
2.根据权利要求1所述微生物发酵生产蛋白饲料的方法，其特征在于:所述无机酸是HCl、H2SO4'H3PO4 中任意一种。
3.根据权利要求1或2所述微生物发酵生产蛋白饲料的方法，其特征在于:所述发酵培养基，其pH值为5-7。
4.根据权利要求1或2所述微生物发酵生产蛋白饲料的方法，其特征在于所述种子培养基，其配方以质量体积比浓度计为:木糖4-6%，尿素0.2-0.4%，硫铵0.1-0.2%，KH2PO40.05-0.15%, MgSO4.7Η20 0.04-0.06%，酵母膏 0.05-0.15%，其余为水。
5.根据权利要求4所述微生物发酵生产蛋白饲料的方法，其特征在于:所述种子培养液，其活菌浓度为5 X IO7 -2 X IO8 cfu/mL。
6.根据权利要求5所述微生物发酵生产蛋白饲料的方法，其特征在于:将所述种子培养液以8-12%的接种量接种于所述发酵培养基。
全文摘要
本发明提供了一种微生物发酵生产蛋白饲料的方法，该方法以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YPH499-spt15-20为发酵菌种，采用以玉米芯水解液为主要成分的发酵培养基，在25-35℃下，180-220r/min振荡发酵24-72h，固液分离，收集固体得到所述蛋白饲料。本发明所述方法能够制备出高品质的蛋白饲料，并且具有步骤简单、成本低廉的优势。
文档编号A23K1/00GK103082083SQ20131005572
公开日2013年5月8日 申请日期2013年2月21日 优先权日2013年2月21日
发明者刘红梅, 刘恺, 刘金, 崔哲 申请人:河北大学