专利名称：喜树内生真菌的抗植物病原菌发酵液的制备方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，涉及一种发酵培养方法，具体涉及喜树内生真菌的抗菌发酵液的制备方法。
背景技术：
在化学农药大量使用的今天，带来了诸多弊端，如环境污染日益严峻、病害虫抗性显著提高、人畜安全受到威胁等，由此产生的生态问题层出不穷，且目前公众对保障食品安全的呼声越来越高。因此开发安全高效绿色环保的新型农药迫在眉睫。微生物农药由于发酵工艺简单、成本相对低廉、不易使病虫害产生抗性、对人畜和环境温和而成为开发新型生物农药中的热点。而作为微生物之一的植物内生真菌(Endophytic fungi)在开发新型农药方面具有极为广阔的前景而备受瞩目。所谓植物内生真菌(Endophytic fungi)是指与宿主植物具有协同进化作用且与宿主植物已经形成互惠共生关系的一类真菌。植物内生真菌(Endophytic fungi)与宿主植物的互惠共生关系表现为:宿主植物产生的光合产物可为内生真菌提供营养；内生真菌产生的代谢产物可以刺激宿主植物的生长发育，同时可以提高植物的抗逆性。因此，植物内生真菌的代谢产物为发现新化合物、筛选新药物等，提供丰富的原料和广阔的空间，因此植物内生真菌已成为多领域多学科的研究热点。尊饿{Camptothecaac應ZaaieO为拱桐科喜树属 iPamptotheca)，在我国分布较多，是中国特有树种。喜树因从体内提取出具有抗癌的生物碱和抗逆转录病毒而备受关注；在有关喜树内生真菌的报道也已见诸报端，但主要集中在生物碱和内生真菌对抗癌和抗逆转录病毒和抗菌活性的研究。目前的研究表明在喜树中存在具有较强的抗植物病原菌活性的内生真菌。因此，研究喜树内生真菌对新时期农药的的研发和使用具有理论和实际上的参考价值。
发明内容
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本发明的目的在于提供一种具有较强的抑制植物病原真菌活性的喜树内生真菌抗植物病原菌发酵液的制备方法。本发明所述的喜树内生真菌命名为球毛壳(Chaetomium globosum ),保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期2013年3月08日，保藏编号为CGMCC N0.7291。本发明所述的喜树内生真菌系从中国安徽省安徽农业大学校园内的喜树iCamptotheca acuminate、植物活体中分离得到的。本发明喜树内生真菌抗植物病原菌发酵液的具体发酵制备操作步骤如下:
(1)菌种活化
在无菌条件下，将喜树内生真菌G4的菌种，转接于已灭菌的马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板中，置培养箱内温度28°C ± I °C，恒温培养7天，得到活化菌种；
(2)发酵培养用无菌打孔器，将活化菌种打成直径为6mm菌碟，接种3块菌碟于含有IOOml液体培养基的250ml三角摇瓶内，恒温摇床培养，摇床转速160转/分，温度28°C ± 1°C，培养7天，得到喜树内生真菌G4发酵液；过滤除去菌丝体，过0.22微米过滤器，即得到喜树内生真菌G4的抗植物病原菌发酵液；
发酵培养特征:培养第I天，菌体为少量白色的细丝和菌丝球，菌丝球体积较小；培养第3天，出现大量白色的小菌丝球；培养第5天，白色菌丝球继续增多，并且体积变大；培养第7天，出现大量白色的菌丝球，体积也变大；
所述马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基:马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、蒸馏水I
升;
所述液体培养基:麦芽浸粉25g、蒸馏水I升，pH自然。本发明通过对球毛壳菌G4的发酵产物的抗菌试验发现，该菌对苹果腐烂植物病原真菌(fytospora mandshurica)等具有较为明显的抑制菌丝生长作用。本发明利用植物内生真菌资源，以求获得抗植物病原真菌病害的新型农用抗生素。本发明所述喜树内生真菌抗植物病原菌发酵产物的抗菌试验如下:
1.植物病原真菌:
苹果腐烂病菌 ifytospora afltfeAtfrica)，葡萄灰霉病菌cinerea ),
褐纹病菌 iPhomopsis vexans ),率炭疽病菌{Gloelsporium fruc tigenum)，梨黑星病菌{Venturia，番爺才古萎病菌{Fusarium oxysporum f.sp.Lycopersici)；
2.病原微生物的培养
用接种环挑取少量病原菌的斜面培养物分别接入马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板活化，在(28± I) °C恒温箱中培养5天；
3.G4菌发酵液对病原菌菌丝生长抑制测定
在无菌条件下，取喜树内生真菌G4的抗植物病原菌发酵液10毫升，和灭过菌的处于融化状态的90毫升的马铃薯葡萄糖琼脂，按照1:9的比例混合均匀，分别各取15毫升倒在直径为9厘米无菌培养皿内制成平板，冷却后在每个培养基平面放入I个供试病原菌菌饼(直径为6毫米)，菌饼的菌丝面贴在培养基表面，将平板置于28±1°C培养72小时。采用十字交叉法测定菌落生长直径，用下述公式计算抑制率:
权利要求
1.喜树内生真菌的抗植物病原菌发酵液的制备方法，其特征在于所述喜树内生真菌为喜树内生真菌G4，喜树内生真菌G4命名为球毛壳菌G4 (.Chaetomium globosum G4)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期2013年3月8日，保藏编号为CGMCC No. 7291 ； 具体发酵制备操作步骤如下 (1)菌种活化 在无菌条件下，将喜树内生真菌G4的菌种，转接于已灭菌的马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板中，置培养箱内温度28°C ± I °C，恒温培养7天，得到活化菌种； (2)发酵培养 用无菌打孔器，将活化菌种打成直径为6mm菌碟，接种3块菌碟于含有IOOml液体培养基的250ml三角摇瓶内，恒温摇床培养，摇床转速160转/分，温度28°C ± 1°C，培养7天，得到喜树内生真菌G4发酵液；过滤除去菌丝体，过O. 22微米过滤器，即得到喜树内生真菌G4的抗植物病原菌发酵液； 发酵培养特征培养第I天，菌体为少量白色的细丝和菌丝球，菌丝球体积较小；培养第3天，出现大量白色的小菌丝球；培养第5天，白色菌丝球继续增多，并且体积变大；培养第7天，出现大量白色的菌丝球，体积也变大； 所述马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、蒸馏水I升; 所述液体培养基麦芽浸粉25g、蒸馏水I升，pH自然。
全文摘要
本发明涉及喜树内生真菌的抗植物病原菌发酵液的制备方法。所述喜树内生真菌命名为球毛壳G4，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期2013年3月8日，保藏编号为CGMCC No.7291；该方法包括以下操作步骤1.菌株活化，2.发酵培养，得到喜树内生真菌G4发酵液，发酵液为黑色；喜树内生真菌G4发酵液在无菌条件下过滤除去菌丝体，过0.22微米过滤器，即得到喜树内生真菌G4的抗植物病原菌发酵液。本发明明确了具有抗菌活性的球毛壳菌G4菌株的抗菌发酵液的制备方法，通过对球毛壳菌G4发酵液的抗菌试验，发现该菌发酵液对苹果腐烂病菌等植物病原菌具有较为显著的抑制菌丝生长作用。
文档编号A01P3/00GK103255065SQ201310138658
公开日2013年8月21日 申请日期2013年4月22日 优先权日2013年4月22日
发明者花日茂, 曾现银, 柏钰, 徐庆庆, 操海群, 吴祥为 申请人:安徽农业大学