CrylAc基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了Cry1Ac基因及其在培育抗棉红铃虫和/或棉铃虫棉花品种中的应用。该基因的转基因品系对于靶标害虫的矫正死亡率极显著高于转基因抗虫棉花品种GK19。
【专利说明】CryIAc基因及其应用
【技术领域】[0001]本发明属于分子生物学领域，具体是涉及CrylAc基因及其在制备抗虫转基因棉花中的应用。
【背景技术】
[0002]中国是世界上最大的棉花生产国，自1997年种植转Bt基因棉花以来，现全国年种植面积已达550万hm2,在全世界居第二位,仅次于印度[1]。根据中棉所、全国优质棉科技服务项目组2007年对全国16个产棉省(市区)的调查结果，全国棉花播种品种471个，其中转基因抗虫棉157个，占全部品种的33.3%，其播种面积占总播种面积的66.1% [2]。但值得注意的是，在这些转基因棉花品种中，除少数品种外为转CrylA+CpTI双价抗虫棉外，绝大多数品种都为转单价Bt基因棉。而且在157个转基因抗虫棉品种中，除了其中4个为美国引进品种，其他几乎所有品种的基因来源高度集中，几乎都是CryIA基因。按照目前公认的Bt毒蛋白基因分类方法，根据其毒蛋白的氨基酸序列的同源性、抗原性及杀虫范围，可以将其Bt基因分Cryl、CryII, CryIII, CryIV, CryV及CryVI几个大类，其中其CryI又可以分为 CryIA(a) >CryIA(b) >CryIA(c) >CryIB>CryIC 等 10 几中，但 CryI 和 CryIII 应用最广[3’4]。按照科学规律，单价抗虫棉在大田生产上一般只能安全应用8~10年[5’6]，而转基因抗虫棉在中国种植时间已达10多年，棉铃虫对Bt基因耐受性逐年增加，现在抗性风险已越来越大。因此，当前我国棉花生产急需转新型抗虫基因、转多价基因及转基因抗虫与常规形态抗虫相结合的抗虫棉花新品种。本项目构建的双价基因CryVA(a)和CryVA(b)基因均属于CryV型Bt基因，为棉花生产应用的新型抗虫基因，该类型基因具有兼抗鳞翅目抗虫和鞘翅目抗虫的特性M，这将扩大抗虫棉的抗虫谱，减少棉铃虫的抗性风险的产生。
[0003]通过构建新型双价抗虫基因，利用已有的优良种质资源，结合常规育种方法，选育高产、优质、多抗的新型转基因棉花新品种(系)，实现扩展抗虫谱，增强抗虫性，改变抗虫基因单一性目标，对减轻棉铃虫危害、延缓或防止抗性棉铃虫的产生，减少环境污染，提高棉花产量和品质，增加棉农收入等方面具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0004]本发明一方面涉及一种CrylAc基因，其具有与SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列或者其互补序列至少99%同源性的核苷酸序列，优选为具有100%同源性。
[0005]本发明另一方面还涉及上述CrylAc基因在培育抗棉红铃虫和/或棉铃虫棉花品种中的应用。
【具体实施方式】:
[0006]CrylAc 基因序列:
[0007]根据棉花对遗传密码子的偏好，同时根据CrylAc的氨基酸序列，设计出SEQ IDN0.1所示的CrylAc基因，在NCBI进行Blast比对，未发现高度同源序列。[0008]ATGGACAACAACCCAAACATCAACGAATGCATTCCATACAACTGCTTGAGTAACCCAGAAGTTGAAGTACTTGGTGGAGAACGCATTGAAACCGGTTACACTCCCATCGACATCTCCTTGTCCTTGACACAGTTTCTGCTCAGCGAGTTCGTGCCAGGTGCTGGGTTCGTTCTCGGACTAGTTGACATCATCTGGGGTATCTTTGGTCCATCTCAATGGGATGCATTCCTGGTGCAAATTGAGCAGTTGATCAACCAGAGGATCGAAGAGTTCGCCAGGAACCAGGCCATCTCTAGGTTGGAAGGATTGAGCAATCTCTACCAAATCTATGCAGAGAGCTTCAGAGAGTGGGAAGCCGATCCTACTAACCCAGCTCTCCGCGAGGAAATGCGTATTCAATTCAACGACATGAACAGCGCCTTGACCACAGCTATCCCATTGTTCGCAGTCCAGAACTACCAAGTTCCTCTCTTGTCCGTGTACGTTCAAGCAGCTAATCTTCACCTCAGCGTGCTTCGAGACGTTAGCGTGTTTGGGCAAAGGTGGGGATTCGATGCTGCAACCATCAATAGCCGTTACAACGACCTTACTAGGCTGATTGGAAACTACACCGACCACGCTGTTCGTTGGTACAACACTGGCTTGGAGCGTGTCTGGGGTCCTGATTCTAGAGATTGGATTAGATACAACCAGTTCAGGAGAGAATTGACCCTCACAGTTTTGGACATTGTGTCTCTCTTCCCGAACTATGACTCCAGAACCTACCCTATCCGTACAGTGTCCCAACTTACCAGAGAAATCTATACTAACCCAGTTCTTGAGAACTTCGACGGTAGCTTCCGTGGTTCTGCCCAAGGTATCGAAGGCTCCATCAGGAGCCCACACTTGATGGACATCTTGAACAGCATAACTATCTACACCGATGCTCACAGAGGAGAGTATTACTGGTCTGGACACCAGATCATGGCCTCTCCAGTTGGATTCAGCGGGCCCGAGTTTACCTTTCCTCTCTATGGAACTATGGGAAACGCCGCTCCACAACAACGTATCGTTGCTCAACTAGGTCAGGGTGTCTACAGAACCTTGTCTTCCACCTTGTACAGAAGACCCTTCAATATCGGTATCAACAACCAGCAACTTTCCGTTCTTGACGGAACAGAGTTCGCCTATGGAACCTCTTCTAACTTGCCATCCGCTGTTTACAGAAAGAGCGGAACCGTTGATTCCTTGGACGAAATCCCACCACAGAACAACAATGTGCCACCCAGGCAAGGATTCTCCCACAGGTTGAGCCACGTGTCCATGTTCCGTTCCGGATTCAGCAACAGTTCCGTGAGCATCATCAGAGCTCCTATGTTCTCTTGGATACATCGTAGTGCTGAGTTCAACAACATCATCGCATCCGATAGTATTACTCAAATCCCTGCAGTGAAGGGAAACTTTCTCTTCAACGGTTCTGTCATTTCAGGACCAGGATTCACTGGTGGAGACCTCGTTAGACTCAACAGCAGTGGAAATAACATTCAGAATAGAGGGTATATTGAAGTTCCAATTCACTTCCCATCCACATCTACCAGATATAGAGTTCGTGTGAGGTATGCTTCTGTGACCCCTATTCACCTCAACGTTAATTGGGGTAATTCATCCATCTTCTCCAATACAGTTCCAGCTACAGCTACCTCCTTGGATAATCTCCAATCCAGCGATTTCGGTTACTTTGAAAGTGCCAATGCTTTTACATCTTCACTCGGTAACATCGTGGGTGTTAGAAACTTTAGTGGGACTGCAGGAGTGATTATCGACAGATTCGAGTTCATTCCAGTTACTGCAACACTCGAGGCTGAGTACAATCTTTAA`[0009]使用takala公司的PRIIOl-AN作为表达载体，通过酶切(酶切位点为合成时在两端加入，分别为Hindlll+SphI)组合把11(1111+3?111将07认(3基因序列整合到表达载体上。
[0010]Cry5b基因的PCR检测
[0011]从转CrylAa基因棉花品系中提取总DNA，利用特异引物进行PCR扩增，以未转化材料为阴性对照，以携带有目的片段的质粒为阳性对照。结果表明，各样品都有特异性条带，与质粒的阳性对照条带大小相同，约为700bp，而阴性对照没有扩增条带，扩增结果与预期的结果相一致。所检测的转CrylAa基因棉花植株的PCR结果呈阳性，可以初步证明Cry5基因已经整合到棉花基因组中。
[0012]RT-PCR 检测
[0013]RT-PCR结果表明，CrylAa在RNA水平上得到了表达。
[0014]ffestern-blot 分析
[0015]根据特异肽段序列CNPNQPCKDDLDRV合成CrylAa蛋白特异抗体，采用TCA-丙酮沉淀法提取转CrylAa基因棉花品系JX0010，JX0020叶片蛋白质，进行Western blot分析。结果从蛋白水平证实，CryIAa基因已经在转基因品系JX0010，JX0020中能表达杀虫毒蛋白。[0016]CrylAa基因的时空表达
[0017]利用合成的CrylAa基因表达毒蛋白特异抗体，采用ELISA方法，对转基因品系JX0010和JX0020各个器官、不同时期的毒蛋白表达量进行了测定。从表中可以看出，JX0010的CryIAa毒蛋白表达较JX0020都要高，时间分布以蕾期表达最高，空间分布以叶片为最闻。
[0018]表1 CrylAa毒蛋白Elisa检测
[0019]
【权利要求】
1.CryIAc基因，其具有与SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列或者其互补序列至少99%同源性的核苷酸序列，优选为具有100%同源性。
2.权利要求1所述的 CrylAc基因在培育抗棉红铃虫和/或棉铃虫棉花品种中的应用。
【文档编号】A01H5/00GK103525834SQ201310145046
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年4月25日 优先权日:2013年4月25日
【发明者】王峰, 陈金湘, 周仲华, 刘海荷, 张秋平 申请人:湖南农业大学