广谱复合微生物杀菌剂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种广谱复合微生物杀菌剂及其制备方法，它由以下3种微生物组成原复合孢子粉：苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）GSICC32807、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus?amyloliquefaciens?）GSICC32826和寡雄腐霉（Pythiumoligandrum）GSICC61615。将两种细菌孢子粉和一种真菌孢子粉按照1:1:1的重量比混合，从而制成广谱复合微生物杀菌剂产品。本发明提供的广谱复合微生物杀菌剂产品能迅速定植到植物根围，通过与病原菌竞争侵染位点、重寄生作用、分泌生长素和促进植物营养吸收等作用，显著预防、拮抗并杀灭多种作物微生物病害；同时具有促进生作物长、提高产量和改善品质的功效。
【专利说明】广谱复合微生物杀菌剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物农药【技术领域】，涉及一种广谱复合微生物杀菌剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]全球由于农作物病虫害导致的经济损失巨大，化学农药对病虫害的防治和农业生产的发展起到了巨大的推动作用，但是人类对其不加节制的滥用，造成环境污染不断加重，人畜中毒频繁发生，也使害虫抗药性增强。因此，开发使用高效、广谱的环保型生物农药，对于农业的可持续发展、保障人类健康和食品安全、维护生态环境和生物多样性都具有重要意义。国家中长期科技发展纲要中，“环保型农药创制和生态农业”被列为农业发展重点领域，“开发环保型农药创制关键技术”是其优先主题，也是国家十二五科技发展规划中现代农业技术研究中的前沿技术。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种广谱复合微生物杀菌剂，以解决现有杀菌剂使环境污染不断加重、人畜中毒频繁发生，使害虫抗药性增强的问题。
[0004]本发明的另一个目的是提供该复合微生物杀菌剂的制备方法。
[0005]本发明技术方案如下:
一种广谱复合微生物杀菌剂，它由以下3种微生物组成原复合孢子粉:苏云金芽抱杆菌{Bacillus thuringi ensi s ) GSICC 32807、解淀粉芽抱杆菌{Bacillusamyloli quefaci ens ) GSICC 32826 和寡雄腐霉應)GSICC 61615。
[0006]这3株菌种均从甘肃省工业微生物菌种保藏中心(GSMSC)够得。
[0007]为了更好地实现本发明，广谱复合微生物杀菌剂还含有以下成分，营养物、润湿剂、分散剂、载体材料，各物质的重量配比为:
原复合孢子粉3%、5%-10%的营养物、5%的润湿剂、15%的分散剂、67%-72%的载体材料，其中营养物为硝酸铵、磷酸二氢钾和腐植酸钾微量元素螯合剂的混合物，润湿剂为十二烷基硫酸钠，分散剂为木质素磺酸钙和亚甲基双萘磺酸钠的混合物，载体材料为高岭土、硅藻土或膨润土。所述硝酸铵、磷酸二氢钾和腐植酸钾微量元素螯合剂的质量比为5.415:2.32:10，所述木质素磺酸钙和亚甲基双萘磺酸钠的质量比为1:1。
[0008]一种广谱复合微生物杀菌剂的制备方法，其特征在于它由下列步骤组成:
O菌种活化
由于菌种长时间保藏于4°C菌种库中，因此在使用前要进行复活。取权利要求1中3株菌种进行斜面培养，在室温放置1-2天后，分别转接到试管进行斜面培养，在25-28°C温度下菌种复活培养基中培养3天，得到活化菌种；
2)两种细菌孢子粉的制备`
将活化好的苏云金芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌两种菌株分别接种到一级液体种子培养基中，在28-30°C温度、转速为180转/分的摇床上培养；然后转接到二级种子摇瓶中，在28-30°C温度、转速为180转/分的摇床上培养；再转接到细菌发酵罐培养基中，在28-30°C温度、转速为180转/分的摇床上培养；将细菌发酵罐培养基的菌种输送到生产罐中，在28-30°C温度、转速为180转/分的摇床上培养，发酵2-3天，得到液体细菌悬浮液；两种细菌悬浮液经过浓缩低温干燥后，制备成孢子粉，含有效活菌数> 100亿个/克；
3)真菌孢子粉的制备
将活化好的寡雄腐霉斜面培养菌株，接种到一级液体种子培养基中，在25-28°C温度、转速为200转/分的摇床上培养，发酵2-3天；然后转接到二级种子摇瓶中，在25-28°C温度、转速为200转/分的摇床上培养，发酵2-3天，再转接到细菌发酵罐培养基中，在25-28°C温度、转速为200转/分的摇床上培养，发酵2-3天；将细菌发酵罐培养基的菌种接种到固体发酵培养基中，发酵3-5天，形成大量孢子，将产生孢子的固体发酵培养基浸润在无菌水中，制备孢子悬液，然后将真菌孢子悬液浓缩、低温干燥，制成真菌孢子粉，孢子数≥ IX IO9 个/g;
4)复合微生物杀菌剂产品制备
将步骤2和3得到的三种孢子粉按1:1:1的比例混合均匀后，为原复合孢子粉；按照以下比例制成复合微生物杀菌剂产品，原复合孢子粉3%，配合5%-10%的营养物，5%的润湿剂，15%的分散剂，65%-75%的载体材料。
[0009]该复合微生物杀菌剂产品中:苏云金芽孢杆菌有效活菌数> IX IO9个/g，解淀粉芽孢杆菌有效活菌数> IXIO9个/g，寡雄腐霉孢子数> I X IO7个/g的广谱复合微生物杀菌剂。
[0010]为了更好地实现本发明，步骤2和步骤3中苏云金芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌及寡雄腐霉斜面培养菌株的接种量为5%-10%。步骤2中苏云金芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌两种菌株的发酵时间为2天。
[0011]为了更好地实现本发明，步骤I中菌种复活培养基配方:马铃薯20%，葡萄糖2%，牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂1.5%，具体制作:取一定量的马铃薯，去皮、切成块煮沸30min，然后用200目纱布过滤，再加入上述其他原料补足水，补足水，待琼脂溶化后分装试管，121°C灭菌30min。
[0012]为了更好地实现本发明，步骤2中液体种子培养基配方:马铃薯20%，葡萄糖2%，牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，具体制作:取200g去皮的马铃薯，切成块煮沸30min，然后用200目纱布过滤，再加入上述其他原料补足水，121°C灭菌30min。
[0013]为了更好地实现本发明，步骤2和3中的细菌发酵罐培养基组成及质量含量为:糖蜜3-5%，牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，硫酸镁0.05%,磷酸二氢钾0.05%,硝酸钾
0.1%，加水补足，pH值为6.8-7.4。
[0014]为了更好地实现本发明，步骤2中固体发酵培养基配方:豆饼5%，玉米粉10%，麸皮50%，秸杆粉35%，其中固体物料与水分的质量比为3:2。
[0015]本发明菌剂的使用方法可沟施、穴施、毒土、浸种、蘸根、喷施、灌根。
[0016]本发明菌剂的机理如下:
苏云金芽孢杆菌{Bacillus thuringi ens is、简称Bt,是目前产量最大、使用最广泛的鳞翅目虫害生物防治剂。 但Bt的防治效果受环境影响较大，速效性差、易产生抗性、生态位小等缺点，影响Bt产品规模化推广应用。解淀粉芽孢杆菌{Bacillus amyloli quefaci ens)是一株与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，对真菌引起的稻瘟病、纹枯病、枯萎病和灰霉病等病害均有防治效果。但由于解淀粉芽孢杆菌在土壤中受温度和湿度影响较大，且生态位小，因此对作物真菌病害的防治效果有限，制约该菌株的生产应用。[0017]寡雄腐霉是腐霉属的一个种，目前已鉴定腐霉属有200多种，大多数都是植物的致病菌，但是寡雄腐霉却是很多植物的生防菌。因为寡雄腐霉属于腐霉属，所以对很多植物有广谱的寄生性，寄生后能明显提高植物的抗病性。研究表明，寡雄腐霉对西红柿、土豆、水稻、黄瓜和葡萄等植物的细菌和真菌病害防治发挥很好的作用。寡雄腐霉细胞壁蛋白拟隐地蛋白(CWPs)可作用于LeATL6泛素蛋白连接酶E3诱导防御反应。还有研究发现寡雄腐霉在防治西红柿细菌性枯萎病时，对墨绿酸信号具有依赖性。可见寡雄腐霉通过增强植物自身的防御系统来实现生防作用，因此对植物的产品和质量具有安全性，而且寡雄腐霉为真菌生物防治剂，容易培养、繁殖快、生态位大，适合生物防治剂的开发。
[0018]作物的病虫害多数是有害虫咬噬后，为病原菌提供入侵机会而引起的综合病害。本发明根据其致病性特点，利用苏云金芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和寡雄腐霉协同性的效果，有针对性的开发具有杀虫和防治微生物病害的广谱复合微生物杀菌剂产品，使本发明产品解决现有杀菌剂使环境污染不断加重、人畜中毒频繁发生，使害虫抗药性增强的问题。本发明提供的广谱复合微生物杀菌剂产品能迅速定植到植物根围，通过与病原菌竞争侵染位点、重寄生作用、分泌生长素和促进植物营养吸收等作用，显著预防、拮抗并杀灭多种作物微生物病害；同时具有促进生作物长、提高产量和改善品质的功效。
[0019]本发明所选用的微生物菌种均是农业部授权的植物有益微生物，经复配制成广谱复合微生物杀菌剂产品，具有以下优点:
1、本发明的微生物种类搭配合理，苏云金芽孢杆菌能防止鳞翅目虫害，减少害虫咬噬为病原菌入侵提供的“便利通道”;解淀粉芽孢杆菌分泌耐高温抗菌物质、蛋白酶和生长素等，对病害防治发挥一定的生防促生作用，但其生态位小、易受环境因素影响；而寡雄腐霉对解淀粉芽孢杆菌的功能进一步补充，其生态位大，容易繁殖，寄主广泛。三者结合对病虫害防治具有高效、广谱的作用。
[0020]2、本发明的广谱微生物杀菌剂在营养物质和载体材料选择上，充分考虑到细菌和真菌对营养物质的需求以及微生物之间的拮抗、协同效应。本发明复合微生物菌剂制备方法简便可行，有效孢子数含量高，微生物存活时间长，产品稳定。
[0021]3、本发明产品使用简便，不但能防止虫害、细菌和真菌引起的病害，而且还能促进作物生长、提高作物产量和品质，是现代有机农业的绿色伴侣。
【具体实施方式】
[0022]首先从甘肃省工业微生物菌种保藏中心(GSMSC)获取上述3支菌种的斜面培养。由于菌种长时间保藏于4°C菌种库中，因此在使用前要进行复活。具体复活方法:从保藏中心取到以上菌种，在室温放置1-2天后，分别转接到试管斜面培养，25-28°C培养3天，就得到活化菌种。
[0023]IL菌种复活培养基配方:马铃薯200g，葡萄糖20g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g。具体制作:取200g去皮的马铃薯，切成块煮沸30min，然后用200目纱布过滤，再加入上述其他原料，待琼脂溶化后补足水至1L，分装试管，121°C灭菌30min。
[0024]实施例1
I)两种细菌孢子粉的制备
将活化好的苏云金芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌两种斜面培养菌株，按照5%的接种量分别接种到500mL —级液体种子培养基中，28-30°C、转速180转/分的摇床上培养，发酵2天。然后转接到二级种子摇瓶中，在28-30°C、转速180转/分的摇床上培养，发酵2天。再转接到50L细菌发酵罐培养基中，温度28-30°C，转速180转/分，发酵2天。将细菌发酵罐培养基的菌种输送到500L生产罐中，温度28-30°C，转速180转/分，发酵3天，可以得到液体细菌悬浮液。两种细菌悬浮液经过浓缩低温干燥后，制备成孢子粉，苏云金芽孢杆菌含有效活菌数100亿个/克；解淀粉芽孢杆菌含有效活菌数108亿个/克。
[0025]2)真菌孢子粉的制备
将活化好的寡雄腐霉斜面培养菌株，按照5%的接种量分别接种到500mL —级液体种子培养基中，25-28°C、转速200转/分的摇床上培养，发酵2天。然后转接到二级种子摇瓶中，在25-28°C、转速200转/分的摇床上培养，发酵2天。再转接到50L细菌发酵罐培养基中，温度25-28°C，转速200转/分，发酵2天。将细菌发酵罐培养基的菌种接种到固体发酵培养基中，发酵3天即可形成大量孢子。将产孢的固体发酵培养基浸润在无菌水中，制备孢子悬液，然后将真菌孢子悬液进一步浓缩、低温干燥，制成真菌孢子粉，孢子数为1.5X109个/g°
[0026]3)复合微生物杀菌剂产品制备
三种孢子粉按1:1:1的比例混合均匀后为原复合孢子粉。复合微生物杀菌剂产品中含有原复合孢子粉3%，营养物5%，5%的润湿剂，15%的分散剂，载体材料72%。其中营养物是硝酸铵、磷酸二氢钾和腐植酸钾微量元素螯合剂按照5.415:2.32:10的质量比例混合而成；润湿剂为十二烷基硫酸钠；分散剂为木质素磺酸钙和亚甲基双萘磺酸钠1:1的质量比混合物；载体材料主要是高岭土、硅藻土或膨润土。按照其比例复配即可得到苏云金芽孢杆菌有效活菌数1.2 X IO9个/g，解淀粉芽孢杆菌有效活菌数1.2 X IO9个/g，寡雄腐霉孢子数
5.6 X IO7个/g的广谱复合微生物杀菌剂。
[0027]实施例2
I)两种细菌孢子粉的制备
将活化好的苏云金芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌两种斜面培养菌株，按照8%的接种量分别接种到500mL —级液体种子培养基中，28-30°C、转速180转/分的摇床上培养，发酵2天。然后转接到二级种子摇瓶中，在28-30°C、转速180转/分的摇床上培养，发酵2天。再转接到50L细菌发酵罐培养基中 ，温度28-30°C，转速180转/分，发酵2天。将细菌发酵罐培养基的菌种输送到500L生产罐中，温度28-30°C，转速180转/分，发酵3天，可以得到液体细菌悬浮液。两种细菌悬浮液经过浓缩低温干燥后，制备成孢子粉，苏云金芽孢杆菌含有效活菌数110亿个/克；解淀粉芽孢杆菌含有效活菌数112亿个/克。
[0028]2)真菌孢子粉的制备
将活化好的寡雄腐霉斜面培养菌株，按照8%的接种量分别接种到500mL —级液体种子培养基中，25-28°C、转速200转/分的摇床上培养，发酵2天。然后转接到二级种子摇瓶中，在25-28°C、转速200转/分的摇床上培养，发酵2天。再转接到50L细菌发酵罐培养基中，温度25-28°C，转速200转/分，发酵2天。将细菌发酵罐培养基的菌种接种到固体发酵培养基中，发酵3天即可形成大量孢子。将产孢的固体发酵培养基浸润在无菌水中，制备孢子悬液，然后将真菌孢子悬液进一步浓缩、低温干燥，制成真菌孢子粉，孢子数为2.0 X IO9个/g°
[0029]3)复合微生物杀菌剂产品制备
三种孢子粉按1:1:1的比例混合均匀后为原复合孢子粉。复合微生物杀菌剂产品中含有原复合孢子粉3%，营养物10%，5%的润湿剂，15%的分散剂，载体材料67%。其中营养物是硝酸铵、磷酸二氢钾和腐植酸钾微量元素螯合剂按照5.415:2.32:10的质量比例混合而成；润湿剂为十二烷基硫酸钠；分散剂为木质素磺酸钙和亚甲基双萘磺酸钠1:1的质量比混合物；载体材料主要是高岭土、硅藻土或膨润土。按照其比例复配即可得到苏云金芽孢杆菌有效活菌数1.8 X IO9个/g，解淀粉芽孢杆菌有效活菌数1.5 X IO9个/g，寡雄腐霉孢子数6 X IO7个/g的广谱复合微生物杀菌剂。
[0030]实施例3
I)两种细菌孢子粉的制备
将活化好的苏云金芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌两种斜面培养菌株，按照10%的接种量分别接种到500mL —级液体种子培养基中，28-30°C、转速180转/分的摇床上培养，发酵2天。然后转接到二级种子摇瓶中，在28-30°C、转速180转/分的摇床上培养，发酵2天。再转接到50L细菌发酵罐培养基中，温度28-30°C，转速180转/分，发酵2天。将细菌发酵罐培养基的菌种输送到500L生产罐中，温度28-30°C，转速180转/分，发酵3天，可以得到液体细菌悬浮液。两种细菌悬浮液经过浓缩低温干燥后，制备成孢子粉，苏云金芽孢杆菌含有效活菌数113亿个/克；解淀粉芽孢杆菌含有效活菌数115亿个/克。
[0031]2)真菌孢子粉的制备
将活化好的寡雄腐霉斜面培养菌株，按照10%的接种量分别接种到500mL —级液体种子培养基中，25-28°C、转速200转/分的摇床上培养，发酵2天。然后转接到二级种子摇瓶中，在25-28°C、转速200转/分的摇床上培养，发酵2天。再转接到50L细菌发酵罐培养基中，温度25-28°C，转速200转/分，发酵2天。将细菌发酵罐培养基的菌种接种到固体发酵培养基中，发酵3天即可形成大量孢子。将产孢的固体发酵培养基浸润在无菌水中，制备孢子悬液，然后将真菌孢子悬液进一步浓缩、低温干燥，制成真菌孢子粉，孢子数为
2.2X109 个/g。
[0032]3)复合微生物杀菌剂产品制备
三种孢子粉按1:1:1的比例混合均匀后为原复合孢子粉。复合微生物杀菌剂产品中含有原复合孢子粉3%，营养物8%，5%的润湿剂，15%的分散剂，载体材料69%。其中营养物是硝酸铵、磷酸二氢钾和腐植酸钾微量元素螯合剂按照5.415:2.32:10的质量比例混合而成；润湿剂为十二烷基硫酸钠；分散剂为木质素磺酸钙和亚甲基双萘磺酸钠1:1的质量比混合物；载体材料主要是高岭土、硅藻土或膨润土。按照其比例复配即可得到苏云金芽孢杆菌有效活菌数1.52 X IO9个/g，解淀粉芽孢杆菌有效活菌数1.38 X IO9个/g，寡雄腐霉孢子数6X IO7个/g的广谱复合微生物杀菌剂。
[0033]实验结果表明:营养物的添加比例对复合微生物菌剂有效微生物数量有影响，营养物比例越高，有效微生物数量有所增加，表明营养比例含量高，营养丰富时微生物有轻微增殖情况。在本实验范围内，复合微生物杀菌剂产品含有苏云金芽孢杆菌有效活菌数> I X IO9个/g，解淀粉芽孢杆菌有效活菌数> I X IO9个/g ;寡雄腐霉孢子数> I X IO7个/go该复合微生物杀菌剂产品指标满足杀菌剂产品要求。
[0034]实施例4
I)两种细菌孢子粉的制备
将活化好的苏云金芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌两种斜面培养菌株，按照8%的接种量分别接种到500mL —级液体种子培养基中，28-30°C、转速180转/分的摇床上培养，发酵2天。然后转接到二级种子摇瓶中，在28-30°C、转速180转/分的摇床上培养，发酵2天。再转接到50L细菌发酵罐培养基中，温度28-30°C，转速180转/分，发酵2天。将细菌发酵罐培养基的菌种输送到500L生产罐中，温度28-30°C，转速180转/分，发酵I天，可以得到液体细菌悬浮液。两种细菌悬浮液经过浓缩低温干燥后，制备成孢子粉，苏云金芽孢杆菌含有效活菌数80亿个/克；解淀粉芽孢杆菌含有效活菌数96亿个/克。
[0035]2)真菌孢子粉的制备
将活化好的寡雄腐霉斜面培养菌株，按照5%的接种量分别接种到500mL —级液体种子培养基中，25-28°C、转速200转/分的摇床上培养，发酵3天。然后转接到二级种子摇瓶中，在25-28°C、转速200转/分的摇床上培养，发酵3天。再转接到50L细菌发酵罐培养基中，温度25-28°C，转速200转/分，发酵3天。将细菌发酵罐培养基的菌种接种到固体发酵培养基中，发酵5天即可形成大量孢子。将产孢的固体发酵培养基浸润在无菌水中，制备孢子悬液，然后将真菌孢子悬液进一步浓缩、低温干燥，制成真菌孢子粉，孢子数为6.4X IO9个/g°
[0036]3)复合微生物杀菌剂产品制备
三种孢子粉按1:1:1的比例混合均匀后为原复合孢子粉。复合微生物杀菌剂产品中含有原复合孢子粉3%，营养物5%，5%的润湿剂，15%的分散剂，载体材料72%。其中营养物是硝酸铵、磷酸二氢钾和腐植酸钾微量元素螯合剂按照5.415:2.32:10的质量比例混合而成；润湿剂为十二烷基硫酸钠；分散剂为木质素磺酸钙和亚甲基双萘磺酸钠1:1的质量比混合物；载体材料主要是高岭土、硅藻土或膨润土。按照其比例复配即可得到苏云金芽孢杆菌有效活菌数1.2 X IO9个/g，解淀粉芽孢杆菌有效活菌数1.2 X IO9个/g，寡雄腐霉孢子数
5.6 X IO7个/g的广谱复合微生物杀菌剂。
[0037]实施例5
I)两种细菌孢子粉的制备
将活化好的苏云金芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌两种斜面培养菌株，按照8%的接种量分别接种到500mL —级液体种子培养基中，28-30°C、转速180转/分的摇床上培养，发酵2天。然后转接到二级种子摇瓶中，在28-30°C、转速180转/分的摇床上培养，发酵2天。再转接到50L细菌发酵罐培养基中，温度28-30°C，转速180转/分，发酵2天。将细菌发酵罐培养基的菌种输送到500L生产罐中，温度28-30°C，转速180转/分，发酵2天，可以得到液体细菌悬浮液。两种细菌悬浮液经过浓缩低温干燥后，制备成孢子粉，苏云金芽孢杆菌含有效活菌数130亿个/克；解`淀粉芽孢杆菌含有效活菌数124亿个/克。
[0038]2)真菌孢子粉的制备将活化好的寡雄腐霉斜面培养菌株，按照8%的接种量分别接种到500mL —级液体种子培养基中，25-28°C、转速200转/分的摇床上培养，发酵3天。然后转接到二级种子摇瓶中，在25-28°C、转速200转/分的摇床上培养，发酵3天。再转接到50L细菌发酵罐培养基中，温度25-28°C，转速200转/分，发酵3天。将细菌发酵罐培养基的菌种接种到固体发酵培养基中，发酵5天即可形成大量孢子。将产孢的固体发酵培养基浸润在无菌水中，制备孢子悬液，然后将真菌孢子悬液进一步浓缩、低温干燥，制成真菌孢子粉，孢子数为6.8 X IO9个/g°
[0039]3)复合微生物杀菌剂产品制备 三种孢子粉按1:1:1的比例混合均匀后为原复合孢子粉。复合微生物杀菌剂产品中含有原复合孢子粉3%，营养物10%，5%的润湿剂，15%的分散剂，载体材料67%。其中营养物是硝酸铵、磷酸二氢钾和腐植酸钾微量元素螯合剂按照5.415:2.32:10的质量比例混合而成；润湿剂为十二烷基硫酸钠；分散剂为木质素磺酸钙和亚甲基双萘磺酸钠1:1的质量比混合物；载体材料主要是高岭土、硅藻土或膨润土。按照其比例复配即可得到苏云金芽孢杆菌有效活菌数1.8 X IO9个/g，解淀粉芽孢杆菌有效活菌数1.5 X IO9个/g，寡雄腐霉孢子数
6X IO7个/g的广谱复合微生物杀菌剂。
[0040]实施例6
I)两种细菌孢子粉的制备
将活化好的苏云金芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌两种斜面培养菌株，按照8%的接种量分别接种到500mL —级液体种子培养基中，28-30°C、转速180转/分的摇床上培养，发酵2天。然后转接到二级种子摇瓶中，在28-30°C、转速180转/分的摇床上培养，发酵2天。再转接到50L细菌发酵罐培养基中，温度28-30°C，转速180转/分，发酵2天。将细菌发酵罐培养基的菌种输送到500L生产罐中，温度28-30°C，转速180转/分，发酵3天，可以得到液体细菌悬浮液。两种细菌悬浮液经过浓缩低温干燥后，制备成孢子粉，苏云金芽孢杆菌含有效活菌数108亿个/克；解淀粉芽孢杆菌含有效活菌数112亿个/克。
[0041]实验结果表明:接种量对两种孢子粉有效菌数的影响不大，发酵罐发酵时间对孢子粉有效菌数影响较大，第二天时有效活菌数最多，随着发酵时间的延长，由于细菌自溶使得有效活菌数稍微下降。因此，两种细菌孢子粉的最佳制备工艺为接种量5%_10%，发酵时间均2天最佳。
[0042]2)真菌孢子粉的制备
将活化好的寡雄腐霉斜面培养菌株，按照10%的接种量分别接种到500mL —级液体种子培养基中，25-28°C、转速200转/分的摇床上培养，发酵3天。然后转接到二级种子摇瓶中，在25-28°C、转速200转/分的摇床上培养，发酵3天。再转接到50L细菌发酵罐培养基中，温度25-28°C，转速200转/分，发酵3天。将细菌发酵罐培养基的菌种接种到固体发酵培养基中，发酵5天即可形成大量孢子。将产孢的固体发酵培养基浸润在无菌水中，制备孢子悬液，然后将真菌孢子悬液进一步浓缩、低温干燥，制成真菌孢子粉，孢子数为
6.5 X IO9 个/g。
[0043]实验结果表明:接种量对寡雄腐霉孢子数的影响不大，固体发酵培养时间对孢子数影响较大，第5天孢子数明显高于第3天，表明菌丝老化、培养基中营养物降低有利于孢子形成。因此，寡雄腐霉孢子粉的最佳制备工艺为接种量5%-10%，固体发酵培养时间5天最佳。
[0044]3)复合微生物杀菌剂产品制备
三种孢子粉按1:1:1的比例混合均匀后为原复合孢子粉。复合微生物杀菌剂产品中含有原复合孢子粉3%，营养物8%，5%的润湿剂，15%的分散剂，载体材料69%。其中营养物是硝酸铵、磷酸二氢钾和腐植酸钾微量元素螯合剂按照5.415:2.32:10的质量比例混合而成；润湿剂为十二烷基硫酸钠；分散剂为木质素磺酸钙和亚甲基双萘磺酸钠1:1的质量比混合物；载体材料主要是高岭土、硅藻土或膨润土。按照其比例复配即可得到苏云金芽孢杆菌有效活菌数1.52 X IO9个/g，解淀粉芽孢杆菌有效活菌数1.38 X IO9个/g，寡雄腐霉孢子数6X IO7个/g的广谱复合微生物杀菌剂。
[0045]实验结果表明:营养物的添加比例对复合微生物菌剂有效微生物数量有影响，营养物比例越高，有效微生物数量有所增加，表明营养比例含量高，营养丰富时微生物有轻微增殖情况。在本实验范围内，复合微生物杀菌剂产品含有苏云金芽孢杆菌有效活菌数> I X IO9个/g，解淀粉芽孢杆菌有效活菌数> I X IO9个/g ;寡雄腐霉孢子数> I X IO7个/go该复合微生物杀菌剂产品指标满足杀菌剂产品要求。
[0046]实用例1:复合微 生物杀菌剂对小麦病害防治和增产的应用效果
盆栽实验:从小麦根部分离一株病原菌，经鉴定为强雄腐霉iPythiumarrhenomanes)。对照(CK):无菌土壤基质；实验组1(P.A):添加5%。的强雄腐霉致病菌的灭菌土基质；实验组2 (P.0):添加5%。的复合微生物菌剂产品的灭菌土基质；实验组3 (P.0+P.A):共同添加
2.5%。的强雄腐霉致病菌和2.5%。的复合微生物菌剂产品的灭菌土基质。每个实验处理9个重复，分别烧IL水后,种春小麦L8275,温室培养。结果如表1:复合微生物菌剂产品的防病和促生效果。
表1:复合微生物菌削产品的防病促生效巢
【权利要求】
1.一种广谱复合微生物杀菌剂，其特征在于:它由以下3种微生物组成原复合孢子粉:苏云金芽抱杆菌thuringiensi5) GSICC 32807、解淀粉芽抱杆菌amyloliquefaciens ) GSICC 32826 和寡雄腐霉應)GSICC 61615。
2.根据权利要求1所述的广谱复合微生物杀菌剂，其特征在于:它还含有以下成分，营养物、润湿剂、分散剂、载体材料，各物质的重量配比为: 原复合孢子粉3%、5%-10%的营养物、5%的润湿剂、15%的分散剂、67%-72%的载体材料，其中营养物为硝酸铵、磷酸二氢钾和腐植酸钾微量元素螯合剂的混合物，润湿剂为十二烷基硫酸钠，分散剂为木质素磺酸钙和亚甲基双萘磺酸钠的混合物，载体材料为高岭土、硅藻土或膨润土。
3.根据权利要求2所述的广谱复合微生物杀菌剂，其特征在于:所述硝酸铵、磷酸二氢钾和腐植酸钾微量元素螯合剂的质量比为5.415:2.32:10，所述木质素磺酸钙和亚甲基双萘磺酸钠的质量比为1:1。
4.权利要求1所述广谱复合微生物杀菌剂的制备方法，其特征在于它由下列步骤组成: O菌种活化 取权利要求1中3株菌种进行斜面培养，在室温放置1-2天后，分别转接到试管进行斜面培养，在25-28°C温度下菌种复活培养基中培养3天,得到活化菌种； 2)两种细菌孢子粉的制备 将活化好的苏云金芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌两种菌株分别接种到一级液体种子培养基中，在28-30°C温度、转速为180转/分的摇床上培养；然后转接到二级种子摇瓶中，在28-30°C温度、转速为180转/分的摇床上培养；再转接到细菌发酵罐培养基中，在28-30°C温度、转速为180转/分的摇床上培养；将细菌发酵罐培养基的菌种输送到生产罐中，在28-30°C温度、转速为180转/分的摇床上培养，发酵2-3天，得到液体细菌悬浮液；两种细菌悬浮液经过浓缩低温干燥后，制备成孢子粉，含有效活菌数> 100亿个/克； 3)真菌孢子粉的制备 将活化好的寡雄腐霉斜面培养菌株，接种到一级液体种子培养基中，在25-28°C温度、转速为200转/分的摇床上培养，发酵2-3天；然后转接到二级种子摇瓶中，在25-28°C温度、转速为200转/分的摇床上培养，发酵2-3天，再转接到细菌发酵罐培养基中，在25-28°C温度、转速为200转/分的摇床上培养，发酵2-3天；将细菌发酵罐培养基的菌种接种到固体发酵培养基中，发酵3-5天，形成大量孢子，将产生孢子的固体发酵培养基浸润在无菌水中，制备孢子悬液，然后将真菌孢子悬液浓缩、低温干燥，制成真菌孢子粉，孢子数≥ IX IO9 个/g; 4)复合微生物杀菌剂产品制备 将步骤2和3得到的三种孢子粉按1:1:1的比例混合均匀后，为原复合孢子粉；按照以下比例制成复合微生物杀菌剂产品，原复合孢子粉3%，配合5%-10%的营养物，5%的润湿剂，15%的分散剂，65%-75%的载体材料。
5.根据权利要求4所述的广谱复合微生物杀菌剂的制备方法，其特征在于:步骤2和步骤3中苏云金芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌及寡雄腐霉斜面培养菌株的接种量为5%-10%。
6.根据权利要求5所述的广谱复合微生物杀菌剂的制备方法，其特征在于:步骤2中苏云金芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌两种菌株的发酵时间为2天。
7.根据权利要求6所述的广谱复合微生物杀菌剂的制备方法，其特征在于:步骤I中菌种复活培养基配方:马铃薯20%，葡萄糖2%，牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂1.5%，具体制作:取一定量的马铃薯，去皮、切成块煮沸30min，然后用200目纱布过滤，再加入上述其他原料补足水，补足水，待琼脂溶化后分装试管，121°C灭菌30min。
8.根据权利要求7所述的广谱复合微生物杀菌剂的制备方法，其特征在于:步骤2中液体种子培养基配方:马铃薯20%，葡萄糖2%，牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，具体制作:取200g去皮的马铃薯，切成块煮沸30min，然后用200目纱布过滤，再加入上述其他原料补足水，121°C灭菌30min。
9.根据权利要求8所述的广谱复合微生物杀菌剂的制备方法，其特征在于:步骤2和3中的细菌发酵罐培养基组成及质量含量为:糖蜜3-5%，牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.05%，硝酸钾0.1%，加水补足，pH值为6.8-7.4。
10.根据权利要求9所述的广谱复合微生物杀菌剂的制备方法，其特征在于:步骤2中固体发酵培养基配方:豆饼5%，玉米粉10%，麸皮50%，秸杆粉35%，其中固体物料与水分的质量比为3:2。
【文档编号】A01P1/00GK103651582SQ201310423718
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】周剑平, 祝英 申请人:周剑平, 祝英