一种蛹虫草培养基及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种蛹虫草培养基，由以下含量的各组分组成：干蚕蛹粉30g/L、大米粉170g/L、磷酸二氢钾1.2g/L、磷酸二氢钠0.8g/L、牛肉膏1g/L。配制该培养基，密封、灭菌、冷却；然后接种蛹虫草菌种，菌种密度为3～5个菌球/mL，培养基与菌种体积比为50:1；培养，包括暗培养、光培养；收获子实体。使用该方法培育得到的蛹虫草制成药物，以接种有lewiss肺癌的C57小鼠为实验对象，按药物中蛹虫草给药剂量为5g/kg的标准进行给药，每日给药1次，连续10天后，检测得lewis肺癌肿瘤的抑制率为19.6%。
【专利说明】一种蛹虫草培养基及其应用
【技术领域】[0001]本发明涉及蛹虫草培养【技术领域】，具体涉及一种蛹虫草培养基，以及该蛹虫草培养基在蛹虫草培养中的应用。
【背景技术】
[0002]蛹虫草(Cordyceps militaris),又名北虫草,隶属于真菌界的子囊菌亚门、麦角菌科、虫草属。它是一种药用真菌。蛹虫草中含有糖、脂肪和蛋白质，此外，还含有多种氨基酸、微量元素和维生素。蛹虫草中的多种生理活性成分具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、保护肝脏、增强免疫力等药理作用。而其与肿瘤相关的活性物质包括虫草素、多糖、虫草酸、甾醇类、硒、类胡萝卜素、蛋白质等。
[0003]然而，目前，人工培养的蛹虫草产量有限，其营养成分含量低，质量参差不齐，无法满足人们的需要。尤其是在抗肿瘤效果方面，多采用提取其有效成分制成药物进行抗肿瘤等方面的保健，直接用蛹虫草制成药物进行抗肿瘤的效果不是很理想。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种蛹虫草培养基，使用该蛹虫草培养基培养出的蛹虫草子实体重量明显增加、营养成分含量高、制成的药物抗肿瘤效果明显。
[0005]本发明所采用的技术方案为:
[0006]一种蛹虫草培养基，由以下含量的各组分组成:
[0007]
干蚕蛹粉30 g/L；
大米粉170 g/L;
磷酸二氢钾1.2 g/L;
磷酸二氢钠0.8g/L
牛肉膏 I g/L。
[0008]该培养基的制备如下:以纯净水将KH2P04、NaH2PO4溶解、并充分混匀后再加入干蚕蛹粉、大米粉、牛肉膏混合均匀，装入培养瓶，密封，灭菌，冷却。其中灭菌条件为:121°C，
1.1Mpa 灭菌 30 ~45min。
[0009]使用上述蛹虫草培养基培养蛹虫草的方法，包括以下步骤:
[0010](I)接种:在上述蛹虫草培养基中接种蛹虫草菌种,所述蛹虫草菌种为Cordycepsmilitaris (L.) Link.、液体菌种，所述蛹虫草菌种的密度为3~5个菌球/mL，所述蛹虫草培养基与蛹虫草菌种的体积比为50:1 ；
[0011](2)培养:
[0012](a)暗培养:在温度22°C、湿度75~85%条件下避光培养3~5天，至蛹虫草菌丝长满所述蛹虫草培养基表面；[0013](b)第5~20天采用的光照培养:白天12小时日光灯光照，温度20~22°C、湿度80~85%，光照强度控制在100~150Lx ;晚上12小时闭光，温度18~20°C、湿度75~85% ;每天通风2次，早晚各一次,每次20~30分钟；
[0014](c)第21~35天采用的光照培养:白天12小时自然光加日光灯光照，温度20~22°C、湿度75%~85%，总光照强度控制在1000~1200Lx ;晚上12小时闭光，温度18~200C、湿度75~85% ;每天通风2次，早晚各一次，每次20~30分钟；
[0015]本步骤(b)、(C)中培养所用的光源均为散射光，培养过程中对培养瓶进行转瓶使光照均匀；
[0016](3)收获及再培养:将经过步骤(3)培养后培养瓶中成熟的蛹虫草子实体取出，剩余部分按照步骤(3) (c)的方法继续培养至子实体成熟；
[0017](4)干燥:将收获的蛹虫草子实体置于垫有纱布的不锈钢盘中，均匀铺开，30~37°C热风循环烘干，其水分含量控制在10%以下。
[0018]本发明以蚕蛹粉为主要原料、大米为辅料、再加上牛肉膏作为营养成分配制蛹虫草培养基，并且通过梯度实验最终确定本发明所述的培养基最优配方，然后采用特殊的培养方式:暗培养、然后不同时间段不同的光照培养方式，再加上光源米用散射光，培养过程中定时对培养瓶进行转瓶使光照均匀，即通过确定最优的蛹虫草培养基配方、从整体上优化培养方案，严格按照该方法培养得到的蛹虫草子实体经过检测，发现:产量比使用现有技术培养基及现有技术培养方法培养得到的蛹虫草子实体产量增加20% ;每Ig蛹虫草子实体中腺苷含量为15_20mg、虫草素含量为7.5-8mg、多糖含量为25_33mg,明显高于米用现有技术方法所培养得到的蛹虫草。
[0019]本发明上述方法得到的蛹虫草在制备治疗肺癌的药物中的应用，即利用本发明方法培育所得的蛹虫草进行制备治疗肺癌的药物，然后进行抗肿瘤试验，结果发现本发明方法培育所得的蛹虫草制备成的药物其抗肺癌效果显著优于目前市场上市售的蛹虫草制成的药物。以接种有Iewiss肺癌的C57小鼠为实验对象，将蛹虫草磨粉后制成药物，按药物中蛹虫草给药剂量为5g/kg的标准进行给药，每日给药I次，连续10天后，检测得lewis肺癌肿瘤的抑制率为19.6%。
【具体实施方式】
[0020]以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。
[0021]实施例1:蛹虫草培养基的配制
[0022]蛹虫草培养基为水溶液，由干蚕蛹粉、大米粉、KH2PO4 (磷酸二氢钾XNaH2PO4 (磷酸二氢钠)以及牛肉膏构成。
[0023]取如下重量的成分:干蚕蛹粉450g，大米粉2.55kg，磷酸二氢钾18g，磷酸二氢钠12g，牛肉膏15g ;加纯净水12L先把KH2P04、NaH2PCM先溶解、并充分混匀后再加入干蚕蛹粉、大米粉、牛肉膏混合均匀，得到体积为15L的培养基溶液，匀浆，分装入培养瓶，每瓶装50ml，盖好盖子，121°C，1.1Mpa灭菌30~40min，待其自然冷凝后备用。
[0024]实施例2:蛹虫草的培养
[0025]使用实施例配制的蛹虫草培养基培养蛹虫草，包括以下步骤:
[0026](I)接种:在超净台中向实施例1所配制的蛹虫草培养基的培养瓶中接种蛹虫草菌种，所述蛹虫草菌种为Cordycepsmilitaris (L.)Link.、液体菌种,所述蛹虫草菌种的密度为3~5个菌球/mL，每培养瓶Iml ；
[0027](2)培养:
[0028](a)暗培养:在温度22°C、湿度75~85%条件下避光培养3~5天，至蛹虫草菌丝长满所述蛹虫草培养基表面；
[0029](b)第5~20天采用的光照培养:白天12小时日光灯光照，温度20~22°C、湿度80~85%，光照强度控制在100~150Lx ;晚上12小时闭光，温度18~20°C、湿度75~85% ;每天通风2次，早晚各一次,每次20~30分钟；
[0030](c)第21~35天采用的光照培养:白天12小时自然光加日光灯光照，温度20~22°C、湿度75%~85%，总光照强度控制在1000~1200Lx ;晚上12小时闭光，温度18~200C、湿度75~85% ;每天通风2次，早晚各一次，每次20~30分钟；
[0031]本步骤(b)、(C)中培养所用的光源均为散射光，培养过程中定时对培养瓶进行转瓶使光照均匀；
[0032](3)收获及再培养:将经过步骤(3)培养后培养瓶中成熟的蛹虫草子实体取出，剩余部分按照步骤(3) (c)的方法继续培养至子实体成熟；
[0033](4)干燥:将收获的蛹虫草子实体置于垫有纱布的不锈钢盘中，均匀铺开，30~37°C热风循环烘干，其水分含量控制在10%以下。
[0034]培养中的注意事项:
[0035]A、光照时要用散射光，而不能用直射光，虫草的生长有向光性，对光照均匀的地方的瓶子要进行转瓶，使其光照均匀，子实体向上生长。
[0036]B、在培养过程中要严格控制温度和湿度，所以要严格控制好温度。在目前车间没控制温度设备的情况下，要用地面洒水来控制培养室的温度，一般一天洒水3次，但也要根据当天的气温情况来变，温度高要多洒，培养室温度超过25°C，要开空调降温。
[0037]C、每天培养室要通风换气一到两次，时间选择在早上和傍晚温度相对低的时候，每次20~30分钟。
[0038]D、接种后污染的瓶子要及时的拿出，把里面的培养基倒出重新灭菌后重新接种，不能让污染的瓶子放在培养室里培养，而造成整个培养室受杂菌的污染。
[0039]本方法培养的蛹虫草可收获两季，每瓶每次可获1.2g干重的蛹虫草，比现有技术的每瓶每次可获Ig干重的蛹虫草增加了 20%的产量。
[0040]实施例3:蛹虫草制成的药物对Iewiss肺癌的抑制试验
[0041]实施实例中所提及的荷瘤鼠为接种有Iewiss肺癌的C57。小鼠C57小鼠为普通级实验动物，雌雄兼用，购自军事医学科学院实验动物中心，实验动物质量合格证编号:SCXK-(军)2007-004。肿瘤瘤源lewis肺癌由本实验室传代保存。环磷酰胺片，铝塑包装，每片含环磷酰胺50mg、人参茎叶总皂苷50mg，天津金世制药有限公司生产，国药准字H12021006。氯化钠注射液(生理盐水)，瓶装，500mL/瓶，山东齐都药业有限公司，生产批号1D12052502,国药准字 H37020764。
[0042]1.蛹虫草子实体的粉碎
[0043]分别称取50g实施例2所得的烘干的蛹虫草子实体，放入超微破碎机中，超微粉碎6min，破碎全过程用4~10°C的水作为冷却液，确保有效成分的释放和生物活性的稳定。[0044]2.肿瘤接种
[0045]取接种肿瘤10-13天状态良好的荷瘤鼠脱臼处死，体表酒精消毒，在无菌(超净台)环境下剥离小鼠肿瘤至盛有生理盐水的无菌平皿，剪至小块，将小块肿瘤放入组织匀浆器，按体积比1:3左右加入生理盐水匀浆，匀浆液即肿瘤细胞混悬液倒入50ml无菌离心管，备用。活细胞计数I X 107/ml浓度，2ml注射器针头套在Iml注射器上，在C57小鼠腋下1.p.接种0.2ml肿瘤细胞混悬液，肿瘤细胞混悬液的制备均在无菌条件下(超净工作台中)完成。从取出肿瘤至肿瘤接种完毕在60分钟内完成 。
[0046]3.分组与给药
[0047]肿瘤细胞接种后24小时所有实验动物随机分组，依实验要求不同共分为6组，每组动物数量为10~12只不等。实验分组为:①生理盐水对照组(NS组)、②阳性药物(环磷酰胺)对照组、③~⑥分别为市售蛹虫草A制成的药物、市售蛹虫草B制成的药物、市售蛹虫草C制成的药物、本发明方法培养所得蛹虫草Z制成的药物。
[0048]4.试剂配置:
[0049]取一粒环磷酰胺片，于砚钵中磨成粉末，加入40ml生理盐水混匀，分装，三天配置一次。分别称取市售虫草A、B、C以及本方法培育虫草Z粉末1.5g,各加入4.5ml生理盐水，配制成250mg/ml的溶液制成药物,每天实验前配制。
[0050]5.给药方案:
[0051]NS组，灌胃相应容积的生理盐水；③~⑦市售蛹虫草A制成的药物、市售蛹虫草B制成的药物、市售蛹虫草C制成的药物、本发明方法培育所得蛹虫草Z制成的药物，分别灌胃给以相应剂量的溶液，给药容积均为0.4mL/20g (活性成分蛹虫草给药剂量为5g/kg);阳性药物(环磷酰胺)对照组，口服环磷酰胺25mg/kg(0.4mL/20g);各给药组每日均给药I次，连续10天。自肿瘤接种后24小时开始给药。
[0052]6.疗效评价
[0053]末次给药后24小时，处死动物，称取体重，解剖并取出肿瘤组织，称取肿瘤重量，以肿瘤生长抑制率来评价药物的体内抗癌效果，计算公式为:肿瘤生长抑制率=(I 一给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)X 100%。
[0054]7.数据处理
[0055]全部数据均以均值和标准差表示。统计分析，组间比较t检验。结果如表1所示。
[0056]初步抑瘤实验结果显示，市售蛹虫草A制成的药物、市售蛹虫草B制成的药物、市售蛹虫草C制成的药物、本发明方法培养所得蛹虫草Z制成的药物组小鼠lewis肺癌肿瘤的抑制率分别为:11.8%、-11.2%、-8.6%,20.6%。综合评价，本发明方法培养所得蛹虫草制成的药物对小鼠肺癌(lewis)有抑制活性，其中本发明方法培养所得蛹虫草制成的药物组与生理盐水组相比P值为0.009，差异显著，抑瘤效果相对其他市售蛹虫草制成的药物效果显著，作用肯定。
[0057]本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
[0058]表1各蛹虫草制成的药物对小鼠lewis肿瘤生长抑制作用
[0059]
【权利要求】
1.一种蛹虫草培养基，其特征在于:由以下含量的各组分组成:干蚕蛹粉30g/L;大米粉170 g/L;磷酸二氢钾1.2 g/L;磷酸二氢钠0.8g/L；牛肉膏I g/L?
2.使用权利要求1所述的蛹虫草培养基培养蛹虫草的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)接种:在蛹虫草培养基中接种蛹虫草菌种，所述蛹虫草菌种为Cordycepsmilitaris (L.) Link.、液体菌种，所述蛹虫草菌种的密度为3~5个菌球/mL，所述蛹虫草培养基与蛹虫草菌种的体积比为50:1 ； (2)培养: (a)暗培养:在温度22°C、湿度75~85%条件下避光培养3~5天，至蛹虫草菌丝长满所述蛹虫草培养基表面； (b)第5~20天采用的光照培养:白天12小时日光灯光照，温度20~22°C、湿度80~85%，光照强度控制在100~150Lx ;晚上12小时闭光，温度18~20°C、湿度75~85% ;每天通风2次，早晚各一次，每次20~30分钟； (c )第21~35天采用的光照培养:白天12小时自然光加日光灯光照，温度20~22 °C、湿度75%~85%，总光照强度控制在1000~1200Lx ;晚上12小时闭光，温度18~20°C、湿度75~85% ;每天通风2次，早晚各一次，每次20~30分钟； 本步骤(b)、(c)中培养所用的光源均为散射光，培养过程中对培养瓶进行转瓶使光照均匀； (3)收获及再培养:将经过步骤(3)培养后培养瓶中成熟的蛹虫草子实体取出，剩余部分按照步骤(3) (c)的方法继续培养至子实体成熟； (4)干燥:将收获的蛹虫草子实体置于垫有纱布的不锈钢盘中，均匀铺开，30~37°C热风循环烘干，其水分含量控制在10%以下。
3.权利要求2所述的使用权利要求1所述的蛹虫草培养基培养蛹虫草的方法培养所得的蛹虫草在制备治疗肺癌的药物中的应用，其特征在于:以接种有Iewiss肺癌的C57小鼠为实验对象，将蛹虫草磨粉、制成药物，按药物中蛹虫草给药剂量为5g/kg的标准进行给药，每日给药I次，连续10天后，检测得lewis肺癌肿瘤的抑制率为19.6%。
【文档编号】C05G1/00GK103539498SQ201310462899
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】陈剑清, 陈昊, 叶曼 申请人:台州康晶生物科技有限公司