一种水栎组织培养繁殖方法
【专利摘要】本发明公开了一种水栎新品种组织培养繁殖方法，包括选材、消毒处理、试管芽苗培养、壮苗培养、增殖培养、生根培养、移栽、成活一系列操作；在体胚诱导、增殖、成熟、萌发培养的培养基中进行培养。本发明具有繁殖系数高，繁殖时间不受季节限制，取材对母体伤害小，无病虫害困扰，在水栎苗木生产及科研中均具有重要的应用价值。
【专利说明】一种水栋组织培养繁殖方法【技术领域】
[0001]本发明涉及水栎的繁育方法，具体地说是涉及水栎的组织培养方法。
【背景技术】
[0002]水栎iQuercus /?办ra)为壳斗科栎属树种，原产美国东南部，主要分布于美国东南部的亚热带海岸平原及密西西比河中下游冲积平原区，在低地及海拔450米处均有分布，喜阳，适应性强，对土壤要求不严，既耐干旱瘠薄，又较耐水湿，抗寒，是优良的用材和绿化景观树种。然而由于水栎在我国的引种时间较短，且开花结果实较迟，结实大小年现象明显，种子来源少，扦插及嫁接的成活率均很低，对种苗的大量繁育带来了困难。组织培养技术是目前林业生物技术的主要内容之一，其主要用途是林木的大规模繁殖和分子育种。该技术的优点在于繁殖效率高，占用空间小，不受季节及外界环境的限制，需要母体材料少，能够在短期内提供大量优质苗木。
【发明内容】
[0003]发明目的:本发明的目的是针对水栎现有繁殖技术较为陈旧的问题，提供一种水栎良种的组织培养方法，其目的在于提高其繁殖系数以适应其引种推广及园林应用的需求。
[0004]技术方案:本发明提供的一种水栎组织培养繁殖方法，其操作步骤包括如下:
(1)选材:于十月末在引种的十年生水栎树上采集种子，采用水浸法除去坏种子，将选出的种子置于沙、蔬菜颗粒肥、芦苇炭、草碳混合物的基质中培养，取水栎种子繁育的优良实生幼苗嫩茎为接种材料；
(2)消毒处理:将幼苗嫩茎进行消毒处理；
(3)试管芽苗培养:在无菌条件下，将步骤(2)中消毒后的外植体剪去接触消毒液的伤口，留f 2cm带芽茎段接种在启动培养基中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，其中光照强度为1600-25001χ，每日光照时间为16小时，温度为(25±2)°C，湿度为50%~65%，培养22~25天，分化长成试管芽苗；
(4)壮苗培养:由于初代诱导的小苗因受顽拗现象的影响直接增殖极易枯死，因此先进行壮苗培养，将步骤(3)中获得的试管芽苗，剪切带有1~2个腋芽的茎段或顶芽后，在超净的工作台上及无菌条件下，接种于经消毒的含有壮苗培养基的玻璃培养瓶中，在光照强度为1600-25001χ，每日光照时间为16小时，温度为(25±2) °C，湿度为50%~65%的条件下，进行壮苗培养，15^18天后进入下一步骤；
(5)增殖培养:将从步骤(4)中长成的试管芽苗，剪切带有广2个腋芽的茎段或顶芽后，在超净的工作台上及无菌条件下，转接于经消毒的含有增殖培养基的玻璃培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，在光照强度为1600-25001χ，每日光照时间为16小时，温度为(25±2) °C，湿度为50%~65%的条件下，对芽苗进行增殖培养，15~18天后增殖系数为2.45~4 ；(6)生根培养:将步骤(5)中获得的试管苗，去掉基部组织和部分叶片，留3~4片叶片，于无菌条件下接种于经消毒的含有生根培养基的玻璃培养瓶中，在光照强度为1600-25001χ，每日光照时间为16小时，温度为(25±2) °C，湿度为50%~65%的条件下，进行生根培养15天后转至不含激素的WPM培养基中继续培养；15~20天后生根率达50% ；
(7)移栽、成活:将步骤(6)中获得的生根瓶苗，取出洗净，移栽到含有泥炭和黄心土的基质中，其中泥炭与黄心土的体积比为1:1，然后浇透水，用塑料薄膜覆盖容器口，保持温度25~30 V，相对湿度75%~85%，培养30~35天，新叶完全展开，移栽成活率在80%~83%。
[0005]进一步地，所述步骤(2)中的消毒处理过程包括:选取的外植体剪切成3~4cm长的小段，用洗衣粉溶液浸泡5 min,自来水冲洗10次，转入超净工作台，放入无菌烧杯中，用70%的酒精进行表面消毒30 S，无菌水冲洗3次，再用浓度为0.1%的升汞溶液消毒4.5分钟，最后用无菌水冲洗6次。
[0006]进一步地，所述步骤(1)中的沙、蔬菜颗粒肥、芦苇炭、草碳混合物体积比为4:1:1:10
[0007]进一步地，所述步骤(7)中的泥炭与黄心土的体积比为1:1-1.5。
[0008]进一步地，所述步骤(3)中的启动培养基配方为:WPM基本培养基、0.01 mg.02mg.T1NAAJOg.L-1蔗糖、6.5 g.L-1卡拉胶；所述启动培养基的pH值控制在
5.7~5.8。
[0009]进一步地，所述步骤(5)中的壮苗培养基配方为:WPM基本培养基、0.01mg.02 mg.L^1NAA,0.5 mg.L-1 玉米素、30g.L-1 蔗糖、6.5 g.L-1 卡拉胶；所述壮苗培养基配方PH值控制在5.7~5.8。
[0010]进一步地，所述步骤(6)的增殖培养基配方为:WPM基本培养基、0.lmg.0.02 mg.LlAA、30g.L-1蔗糖、6.5 g.L-1卡拉胶；增殖培养基pH值控制在5.7~5.8。
[0011]进一步地，所述步骤(7)中的生根培养基配方为:WPM基本培养基、1.5mg.L-1IBA,30g.L—1蔗糖、6.5 g.L—1卡拉胶，所述生根培养基的pH值为5.7~5.8。
[0012]进一步地，所述的WPM基本培养基即木本植物组织培养基的具体配方如下: 硝酸铵 NH4N03400 mg/L
硝酸钙 Ca (NO3) 2.4H20556 mg/L
氯化钙 CaCl2.2H2096 mg/L
硫酸镁 MgSO4.7H20370 mg/L
磷酸二氢钾 KH2PO4170 mg/L
硫酸钾 K2S04990 mg/L
乙二胺四乙酸二钠Na2.EDTA 37.3 mg/L 硫酸亚铁 FeSO4.7H2027.8 mg/L
硫酸锰 MnSO4.H2O22.3 mg/L
硫酸锌 ZnSO4.7H208.6 mg/L
硼酸 H3BO36.2 mg/L
钥酸钠 Na2MoO4.2H200.25 mg/L
硫酸铜 CuSO4.5H200.025 mg/L
氯化钴 CoCl2.620.025 mg/L肌醇 C6H12O6.2H20100 mg/L
甘氨酸 NH2.CH2.COOH 2 mg/L 盐酸硫胺素 C12H17ClOS.2HC1 I mg/L 盐酸吡唆醇 C8HltlNO5P0.5 mg/L
烟酸 NC5H4COOH0.5 mg/L 。
[0013]有益效果:本发明相对于现有技术而言具有以下优点:
(I)本发明所述的一种水栎组织培养方法相对于播种繁殖和其他无性繁殖而言，通过适当的操作和适宜的培养基，具有操作简便、节约占地空间，繁殖时间不受季节限制，其萌发率高，达到90%以上。
[0014](2)本发明取材对母体无伤害，无病虫害困扰，繁殖系数高，能够保持原植株的优良性状的优点，在水栎苗木生产及科研中均具有重要的应用价值。
[0015](3)本发明与常规组培繁殖方法相比，由于初代诱导的水栎小苗因受顽拗现象的影响直接增殖极易枯死，本法在操作中将壮苗培养提前一步骤，在增殖诱导之前进行，有效保证了增殖成活率和增值系数。
【具体实施方式】
[0016]下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。
[0017]以下实例所用的基本培养基的配方如下:
芽诱导基本培养基为WPM培养基，其中，常量元素的组分和其对应的使用浓度如下:硝酸铵(NH4NO3) 400 mg/L、硝酸钙(Ca(NO3)2.4Η20) 556 mg/L、氯化钙(CaCl2.2Η20) 96 mg/L、硫酸镁(MgSO4.7H20) 370 mg/L、磷酸二氢钾(KH2PO4) 170 mg/L、硫酸钾(K2SO4) 990 mg/L ；微量元素的组分和其对应的使用浓度如下:硫酸锰(MnSO4.H2O )22.3 mg/L、硫酸锌(ZnSO4.7H20) 8.6 mg/L、硼酸(H3BO3) 6.2 mg/L、钥酸钠(Na2MoO4.2H20) 0.25 mg/L、硫酸铜(CuSO4.5Η20)0.025 mg/L、硫酸铜(CuSO4.5Η20)0.025 mg/L、氯化钴(CoCl2.62 )0.025 mg/L ；
铁盐的组分和其对应的使用浓度如下:乙二胺四乙酸二钠(Na2.EDTA) 37.3 mg/L、硫酸亚铁(FeSO4.7H20) 27.8 mg/L ；
有机成分的组分和其对应的浓度如下:肌醇100 mg/L、甘氨酸(Gly) 2 mg/L、盐酸硫胺素(VB1) I mg/L、盐酸吡哆醇(VB6) 0.5 mg/L、烟酸(VPP) 0.5 mg/L。
[0018]利用上述的基本培养基配置诱导培养基、壮苗培养基、增殖培养基及生根培养基。
[0019]其中，诱导培养基:WPM基本培养基+6-BA (0.05 mg.L—1)+ NAA (0.02 mg.L_0+ 蔗糖(30g.L-1) + 卡拉胶(6.5 g.L-1)，pH 值为 5.7~5.8。
[0020]壮苗培养基为:WPM基本培养基+6_BA(0.1 mg.L—1)+ +蔗糖(25g.L-1) +卡拉胶(6.5 g.L-1)+ 活性炭(lg.L-1)，pH 值为 5.7~5.8。
[0021]增殖培养基:WPM基本培养基+6-ΒΑ(0.1 mg.L—1)+NAA(0.02 mg.L—1) + 蔗糖(30g.L-1) + 卡拉胶(6.5 g.L-1)，pH 值为 5.7~5.8。
[0022]所述的生根培养基为:WPM基本培养基+IBA(2.5mg.L-1)+蔗糖(30g.L-1) +卡拉胶(6.5 g.L—lpH 值为 5.7~5.8。
[0023]将上述配置好的培养基注入玻璃瓶中，经高温高压消毒20分钟，待用，其中，温度为 120-125 V，压力为 1.1 KG/CM2。
[0024]本实施例选材:从美国原产地德克萨斯、田纳西、路易斯安娜和阿肯色等州引进水栎种源种子进行育苗造林试验，分别在江苏省林科院、宜兴市林场、无锡惠山森林公园等地营建种源试验林，选出树高、胸径、冠幅、分枝、抗逆性等综合性状表现优良的水栎路易斯安那种源9903号，确定为优良种源，为本发明所用材料。
[0025]一种水栎组织培养繁殖方法，包括以下步骤:
(1)选材:于十月末在引种的十年生水栎树上采集种子，采用水浸法除去坏种子，将选出的种子置于沙、蔬菜颗粒肥、芦苇炭、草碳混合物的基质中培养，所述步骤(1)中的沙、蔬菜颗粒肥、芦苇炭、草碳混 合物体积比为4:1:1:1，取水栎种子繁育的优良实生幼苗嫩茎为接种材料；
(2)消毒处理:将幼苗嫩茎进行消毒处理；
(3)试管芽苗培养:在无菌条件下，将步骤(2)中消毒后的外植体剪去接触消毒液的伤口，留f 2cm带芽茎段接种在经消毒的含有启动培养基的玻璃培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，其中光照强度为1600-25001χ，每日光照时间为16小时，温度为(25 ± 2) °C，湿度为50%~65%，培养25天，分化长成试管芽苗；
(4)壮苗培养:由于初代诱导的小苗因受顽拗现象的影响直接增殖极易枯死，因此先进行壮苗培养，将步骤(3)中获得的试管芽苗，剪切带有1~2个腋芽的茎段或顶芽后，在超净的工作台上及无菌条件下，接种于经消毒的含有壮苗培养基的玻璃培养瓶中，在光照强度为1600-25001χ，每日光照时间为16小时，温度为(25±2)°C，湿度为50%~65%的条件下，进行壮苗培养，18天后进入下一步骤；
(5)增殖培养:将从步骤(4)中长成的试管芽苗，剪切带有f2个腋芽的茎段或顶芽后，在超净的工作台上及无菌条件下，转接于经消毒的含有增殖培养基的玻璃培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，在光照强度为1600-25001χ，每日光照时间为16小时，温度为(25±2) °C，湿度为50%~65%的条件下，对芽苗进行增殖培养，增殖系数为2.45~4 ；
(6)生根培养:将步骤(5)中获得的试管苗，去掉基部组织和部分叶片，留3~4片叶片，在超净的工作台上及无菌条件下，接种于经消毒的含有生根培养基的玻璃培养瓶中，在光照强度为1600-25001χ，每日光照时间为16小时，温度为(25±2)°C，湿度为50%~65%的条件下，进行生根培养15天后转至不含激素的WPM培养基中继续培养18天后生根率在50% ；
(7)移栽、成活:将步骤(6)中获得的生根瓶苗，取出洗净，移栽到含有泥炭和黄心土的基质中，其中泥炭与黄心土的体积比为1:1，然后浇透水，用塑料薄膜覆盖容器口，保持温度25~30 V，相对湿度75%~85%，培养30~35天，新叶完全展开，移栽成活率在80%~83%。
【权利要求】
1.一种水栎组织培养繁殖方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)选材:于十月末在引种的十年生水栎树上采集种子，采用水浸法除去坏种子，将选出的种子置于沙、蔬菜颗粒肥、芦苇炭、草碳混合物的基质中培养，取水栎种子繁育的优良实生幼苗嫩茎为接种材料；所述沙、蔬菜颗粒肥、芦苇炭、草碳混合物体积比为4:1:1:1 ; (2)消毒处理:将幼苗嫩茎进行消毒处理； (3)试管芽苗培养:在无菌条件下，将步骤(2)中消毒后的外植体剪去接触消毒液的伤口，留f 2cm带芽茎段接种在经消毒的含有启动培养基的玻璃培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，湿度为50%飞5%，培养22~25天，分化长成试管芽苗；所述启动培养基配方为:WPM基本培养基、0.01 mg.L_16-BA>0.02mg.1^1NAAJOg.171 鹿糖、6.5 g.171 卡拉胶；所述启动培养基的pH值控制在5.7^5.8 ； (4)壮苗培养:将步骤(3)中获得的试管芽苗，剪切带有广2个腋芽的茎段或顶芽后，转接于经消毒的含有壮苗培养基的玻璃培养瓶中，湿度为50%~65%的条件下，进行壮苗培养，15~18天后进入下一步骤；所述壮苗培养基配方为:WPM基本培养基、0.01mg.^-ΒΑ,Ο.02mg.L_1NAA>0.5 mg.L—1玉米素、30g.L—1鹿糖、6.5 g.L—1卡拉胶；所述壮苗培养基配方pH值控制在5.7~5.8 ； (5)增殖培养:将从步骤(4)中长成的试管芽苗，剪切带有广2个腋芽的茎段或顶芽后，转接于增殖培养基中，湿度50%~65% ;增殖培养15~20天；所述增殖培养基配方为:WPM基本培养基、0.lmg.Ll-BA、0.02 mg.L^1NAA, 30g.1 蔗糖、6.5 g.1 卡拉胶；增殖培养基pH值控制在5.7~5.8 ; (6)生根培养:将步骤(5)中获得的试管苗，去掉基部组织和部分叶片，留3~4片叶片，在无菌条件下，接种于经消毒的含有生根培养基的玻璃培养瓶中，在光照强度为1600-25001χ，每日光照时间为16小时，温度为(25±2) °C，湿度为50%~65%的条件下，进行生根培养15天后转至不含激素的WPM培养基中继续培养15~20天；所述生根培养基配方为:WPM基本培养基、1.5mg.T1IBAdOg.L—1蔗糖、6.5 g.L—1卡拉胶，所述生根培养基的pH值为 5.7~5.8 ； (7)移栽、成活:将步骤(6)中获得的生根瓶苗，取出洗净，移栽到含有泥炭和黄心土的基质中，然后浇透水，用塑料薄膜覆盖容器口，保持温度25~30 V，相对湿度75%~85%，培养30~35天。
2.根据权利要求1所述的水栎组织培养繁殖方法，其特征在于:所述步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)、步骤(6)中的培养条件为:光照强度为1600-25001χ，每日光照时间为16h，温度为(25±2)°C。
3.根据权利要求1所述的水栎组织培养繁殖方法，其特征在于:所述步骤(2)中的消毒处理过程包括:选取的外植体剪切成3~4cm长的小段，用洗衣粉溶液浸泡5 min,自来水冲洗10次，转入超净工作台，放入无菌烧杯中，用70%的酒精进行表面消毒30 S，无菌水冲洗3次，再用浓度为0.1%的升汞溶液消毒4.5分钟，最后用无菌水冲洗6次。
4.根据权利要求1或2所述的水栎组织培养繁殖方法，其特征在于:所述步骤(7)中的泥炭与黄心土的体积比为1: f 1: 1.5。
5.根据权利要求1~4所述的水栎组织培养繁殖方法，其特征在于:所述的WPM基本培养基即木本植物组织培养基的具体配方如下:硝酸铵 NH4N03400 mg/L硝酸钙 Ca (NO3) 2.4H20556 mg/L氯化钙 CaCl2.2H2096 mg/L硫酸镁 MgSO4.7H20370 mg/L磷酸二氢钾 KH2PO4170 mg/L硫酸钾 K2S04990 mg/L乙二胺四乙酸二钠Na2.EDTA 37.3 mg/L硫酸亚铁 FeSO4.7H2027.8 mg/L硫酸锰 MnSO4.H2O22.3 mg/L硫酸锌 ZnSO4.7H208.6 mg/L硼酸 H3BO36.2 mg/L钥酸钠 Na2MoO4.2H200.25 mg/L硫酸铜 CuSO4.5H200.025 mg/L氯化钴 CoCl2.6 H2O0.025 mg/L肌醇 C6H12O6.2H20100 mg/L甘氨酸 NH2.CH2.COOH2 mg/L盐酸硫胺素 C12H17ClOS.2HC1 I mg/L盐酸吡 唆醇 C8HltlNO5P0.5 mg/L烟酸 NC5H4COOH0.5 mg/L 。
【文档编号】A01H4/00GK103535280SQ201310519136
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年10月29日 优先权日:2013年10月29日
【发明者】黄利斌, 张敏, 陈智敏, 窦全琴, 董筱昀 申请人:江苏省林业科学研究院