一种在植株水平上删除转基因水稻标记基因的方法
【专利摘要】本发明提供了一种在植株水平上高效率删除转基因水稻标记基因的方法，属于植物基因工程领域。本发明创建了一种水稻化学诱导型高效分子删除系统。利用这一系统转化水稻愈伤组织，获得转基因水稻植株；进一步种植转基因植株，获得自交结实种子；在种子萌发阶段，通过化学诱导处理，启动高效特异性位点重组系统，介导转基因水稻基因组中选择标记基因的删除。利用本发明的方法可以高效率培育无选择标记转基因水稻。
【专利说明】一种在植株水平上删除转基因水稻标记基因的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种在植株水平上高效率删除转基因水稻标记基因的方法。
【背景技术】
[0002]植物基因工程的发展，让人们能够将外源基因转入到受体植物体内，实现定向改良植物相关性状的目标。在现有植物遗传转化阶段，应用选择标记基因是一种常规基础手段。这些标记基因主要有抗生素抗性基因或除草剂抗性基因等，其能够使转化细胞表达抗生素抗性或除草剂抗性的产物，从而在选择压下继续成活，最终分化成转化植株(Dale，etal.1991.Proc Natl Acad Sci USA.88: 10558-10562)。
[0003]长期以来，选择标记基因及其产物是否会对环境或人类健康产生影响，引起了人们广泛关注。为解决可能因选择标记引起的安全问题，一些科学家采用了较为安全的基因作为选择标记，如6-磷酸甘露糖异构酶基因ipmi )、木糖异构酶基因UyJA )等。但这种替换策略仍未能完全消除人们对选择标记基因的安全性疑虑。从根本上讲，彻底删除转基因植物中的选择标记基因，培育无选择标记的转基因植物，才是解决选择标记安全性顾虑的最根本策略。
[0004]无选择标记转基因植物的研究和培育已成为国际上植物基因工程领域的一个趋势。在水稻系统中，位点特异性重组系统介导法是培育无选择标记转基因植株的主要方法之一(Sreekala, et al.2005.Plant Cell Rep.24: 86-94 ;赵艳等，2011，中国水稻科学，25:580-586)。但目前应用于水稻中的分子删除系统效率比较低，且需要在组织培养阶段进行诱导处理，不利于规模化 操作。鉴于此，本发明利用化学诱导表达XVE系统(Zuo，etal.2000.Plant J.24: 265-273)控制Cre重组酶表达，同时采用改进型位点特异识别序列 loxP-FRT(Luo, et al.2007.Plant Biotechnol J.5: 263-274)，其能够更高效介导位点特异性重组。在此基础上，首次建立了一个在植株水平上高效率删除转基因水稻标记基因的方法。这一方法避免了常规策略需要在组培阶段进行诱导处理的局限性，尤其适合大规模培育无选择标记转基因水稻。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是提供一种利用化学诱导型位点特异性重组系统在植株水平上高效率删除转基因水稻选择标记基因的方法，同时也提供一种化学诱导型位点特异性高效重组系统的新型水稻遗传转化载体。这一方法避免了常规策略需要在组培阶段进行诱导处理的局限性，尤其适合大规模培育无选择标记转基因水稻。该载体中，选择标记基因位于两个同向位点特异性识别序列之间，目的基因结构位于两个位点特异性识别序列之外。在本发明所述原载体中，位点特异性识别序列是1xP-FRT融合序列，原载体可以用于组装其它高效位点特异性重组酶识别序列；原载体中选择标记基因为潮霉素抗性基因如?，原载体可以用于组装其它选择标记基因；原载体中目标基因为报告基因，原载体可以用于组装其它有应用价值的基因，包括抗虫基因、抗病基因、抗除草剂基因、抗逆基因、抗衰老基因、品质功能改良基因以及由上述基因组成的融合或多价基因。
[0006]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:包括以下步骤:
a.构建化学诱导型位点特异性重组系统的水稻转化载体，其中选择标记基因位于两个同向位点特异性识别序列之间，目的基因结构位于两个位点特异性识别序列之外；
b.利用该转化载体，通过农杆菌介导方法，转化水稻愈伤组织，筛选、分化产生转基因水稻植株；
c.种植转基因水稻植株，收获自交结实种子；
d.浸种、催芽过程中，经过化学诱导处理所收获种子，诱导位点特异性识别序列产生重组，介导选择标记基因发生删除；
e.种植并检测经处理萌发的幼苗，进一步分子检测转基因结构的重组行为，获得选择标记基因被删除的转基因水稻幼苗。
[0007]本发明的有益效果:
本发明创建了一种水稻化学诱导型高效分子删除系统。采用改进型高效位点特异识别序列，其可以显著提高化学诱导删除选择标记基因的效率。
[0008]本发明通过长期摸索和条件优化，首次建立了一个在植株水平上高效率删除转基因水稻标记基因的方法。利用本发明方法，可以采用常规遗传转化方法，培育转基因水稻植株，然后在对所获得转基因植株自交结实获得的种子进行浸种、催芽时，进行化学诱导处理，启动高效位点特异性重组，删除水稻中的选择标记基因。这一方法方便、简单，不需要在组织培养条件下进行诱导处理，能应用于规模化培育无选择标记转基因水稻。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1，利用本发明删除转基因水稻选择标记基因的流程图。
[0010]图2，载体pUH结构示意图，其中，LB、RB为T-DNA的左右边界；pUbi表示玉米泛素基因启动子(maize ubiqu itin promoter) ;1οχΡ表示cre/loxP系统的位点特异性识别序列；XVE fusion protein表不XVE融合转录因子系统；pea rbcs E9 terminator表不大豆rbcs基因终止子；Pnos表示章鱼碱合成酶基因启动子；hpt表示选择标记潮霉素抗性基因；Tnos表示章鱼碱合成酶基因终止子；LexA-35S-promoter表示LexA结合位点与35S基本启动子的融合启动子；cre-1nt表示具有内含子结构的Cre重组酶基因。
[0011]图3，载体pUXNH结构示意图，其中，LB、RB为T-DNA的左右边界；pUbi表示玉米泛素基因启动子(maize ubiquitin promoter) ;1οχΡ表示cre/loxP系统的位点特异性识别序列；XVE fusion protein表不XVE融合转录因子系统；pea rbcs E9 terminator表不大豆rbcs基因终止子；hpt表示选择标记潮霉素抗性基因；Tnos表示章鱼碱合成酶基因终止子；LexA-35S-promoter表示LexA结合位点与35S基本启动子的融合启动子；cre_int表示具有内含子结构的Cre重组酶基因。
[0012]图4，载体pUXSHCL结构示意图，其中，LB、RB为T-DNA的左右边界；pUbi表示玉米泛素基因启动子(maize ubiquitin promoter) ;1οχΡ表示cre/loxP系统的位点特异性识别序列；XVE fusion protein表不XVE融合转录因子系统；pea rbcs E9 terminator表不大豆rbcs基因终止子；35S promoter表示花椰菜花叶病毒35S启动子；hpt表示选择标记潮霉素抗性基因；Tnos表不章鱼碱合成酶基因终止子；LexA-35S_promoter表不LexA结合位点与35S基本启动子的融合启动子；cre-1nt表示具有内含子结构的Cre重组酶基因。
[0013]图5，载体pUXSHCLF结构示意图，其中，LB、RB为T-DNA的左右边界；pUbi表示玉米泛素基因启动子(maize ubiquitin promoter) ;1οχΡ表示cre/loxP系统的位点特异性识别序列；FRT表示FLP/FRT系统的位点特异性识别序列；XVE fusion protein表示XVE融合转录因子系统；pea rbcs E9 terminator表不大豆rbcs基因终止子；35S promoter表示花椰菜花叶病毒35S启动子；hpt表示选择标记潮霉素抗性基因；Tnos表示章鱼碱合成酶基因终止子；LexA-35S-pr0m0ter表示LexA结合位点与35S基本启动子的融合启动子；cre-1nt表示具有内含子结构的Cre重组酶基因。
[0014]图6，载体pUXSHCLF-GUS结构示意图，其中，LB、RB为T-DNA的左右边界；pUbi表示玉米泛素基因启动子(maize ubiquitin promoter) ;1οχΡ表示cre/loxP系统的位点特异性识别序列；FRT表示FLP/FRT系统的位点特异性识别序列；XVE fusion protein表示XVE融合转录因子系统；pea rbcs E9 terminator表示大豆rbcs基因终止子；35Spromoter表示花椰菜花叶病毒35S启动子；hpt表示选择标记潮霉素抗性基因；Tnos表示章鱼碱合成酶基因终止子；LexA-35S-pr0m0ter表示LexA结合位点与35S基本启动子的融合启动子；cre-1nt表示具有内含子结构的Cre重组酶基因；Gus表示β -葡萄糖酸苷酶(β -glucuronidase)基因。
[0015]图7，经诱导处理的Tl转基因水稻植株PCR检测电泳图谱，其中，M:DNA marker ；CK:非转基因对照植株；pUXSHCLF-GUS:质粒DNA对照；22_4、35-2、42_9:经诱导处理后Tl转基因水稻植株；P1/P2、P3/P4、P1/P4:不同引物组合。
[0016]图8，经诱导处理的Tl转基因水稻植株基因组中特异性识别序列测序结果，其中，A:基于载体pUXSHCLF-GUS预测的重组后7ο耶//^T位点序列；Β:实际测序获得的转基因水稻植株基因组中重组后位点序列；结果显示实际测序结果与预期序列
完全一致。
[0017]图9，T1代水稻植株⑶S表达检测，其中，从左到右，依次为根、茎、叶、颖花等的⑶S染色结果。经诱导处理的T1代水稻植株各组织部位可观察到明显⑶S表达。
【具体实施方式】
[0018]【实施例1】植物表达载体构建
以载体 PUH-GFP2 (Sreekala, et al.2005.Plant Cell Rep.24: 86-94)为骨架，EcoRY/Spel双酶切去除两个酶切位点间的cre-Tnos_loxP-gfp片段；以pUH_GFP2质粒DNA 为模板，利用特异性引物 UH-GFP-F: 5' -ACTGATATCTCACGTACTGACGG-3'，UH-GFP-R:5' -AGTACTAGTGAAGATCTATAACTTCG-3'进行扩增，获得^boRV-cre-Tnos-loxp-^el 片段；Ecom/Spel双酶切PCR扩增片段，与双酶切的pUH_GFP2骨架片段连接，重组获得携带XVE和Cre/loxP系统的通用载体pUH (图2)。
[0019]pUH载体中，其选择标记潮霉素抗性基因由基因启动子(Pnos)控制，其在单子叶植物水稻中的表达水平偏弱，导致载体的遗传转化效率偏低。以Smal/Aatll双酶切载体pUH,去除两个酶切位点间的XVE-pea rbcs_E9 terminator-Pnos片段；以pUH质粒DNA为模板，利用特异性引物UH-F: 5' -ATTCCCCGGGTCCGGGATTTAC-3'，UH-R: 5' -GACGTCCCAACATGGTGGTCAGITTC-3 '进行扩增，获得 5}?a1-XVE-pea rbcs E9terminator-fet\\~Aatil 片段 'Smal/AatW 双酶切 PCR扩增片段，与SrZnalMatn 双酶切的PUH骨架片段连接，重组获得携带去除Pnos片段的中间载体pUXNH(图3)。Bstll/Aatll双酶切载体PCAMBIA-1300，获得CaMV35S启动子片段，插入到pUXNH的fciXI/Aaill位点中，形成载体pUXSHCL (图4)。
[0020]为提高位点特异性重组系统效率，进一步对pUXSHCL系统进行改造。以Sacll/Spel双酶切载体pUXSHCL,去除两个酶切位点间的hpt-Tnos-LexA mini35Spromoter-cre-1nt-Tnos-loxP片段；以pUXSHCL质粒DNA为模板，利用特异性引物CL-F:5' -tccgcggctccgggcgtatatgc-3' ， CL-R: 5' -TACTAGTGAAGATCTGAAGTTCCTATTCCGAAGAAGTATAGGAACTTCCTGAATAACTTCGTA-3'进行扩增，获得 fecI1-hpt-Tnos-LexA mini35S promoter-cre-1nt-Tnos-loxP-FRT-^el 片段双酶切 PCR 扩增片段，与 SacII/Spe I双酶切的pUXSHCL骨架片段连接，重组获得中间载体pUXSHCL_DFRT，其下游的1xP序列被替换成1xP-FRT序列。
[0021]以pUXSHCL质粒DNA为模板，利用特异性引物CL-F2:5' -tgggcccggtagttctacttctgt-3' , CL-R2: 5' -tacgcgtcggcggcatacctgtct-3'进行扩增，获得々?a1-Ubi promoter-LoxP_XVE-#7wI 片段,克隆到 pMD 18-T Vector (宝生物工程有限公司，大连)中，获得中间载体pMD-UFL ;人工合成DNA片段:5' -ctgcaggaattcgataaacctaataacttcgtatagcatacattatacgaagttattcaggaagttcctatactttctagagaataggaacttcggaataggaacttcgaattaaatccgggcggaatgaaagcgttaacggccaggcaacaagaggtgtttgatctcatccgtgatcacatcagccagacaggtatgccgccgacgcgtgaggatcc-3 ' , PstI/BamEI 双酶切，插入载体pMD-UFL的位点之间，再经々7al/#7wl双酶切后，插入载体pUXSHCL_DFRT的如位点之间，形成载体pUXSHCLF，其与原始pUXSHCL (图5)相比，上下游的序列被替换成1xP-FRT序列。
[0022]以 pUb1-⑶S (Chen, et al.2009， Plant Physiol.150: 1111-1121)质粒 DNA 为模板，利用特异性引物 GUS-F: 5 ' -gactagtatgttacgtcctgtag, GUS-R:5' -gactagtcattgtttgcctccctg 进行扩增，经酶切，插入载体 pUXSHCLF 的位点之，获得携带位W报告基因的植物表达载体pUXSHCLF-GUS (图6，线性结构见图1)。
[0023]【实施例2】转基因水稻培育
采用电击法将实施例1所构建植物表达载体pUXSHCLF-GUS转化到根癌农杆菌LBA4404中。
[0024]采用农杆菌介导方法(Hiei, et al.Plant J.1994.6: 271-282)培育转基因水稻植株。选择生长良好的水稻品种日本晴愈伤组织作受体，以转化pUXSHCLF-GUS的LBA4404培养液侵染水稻愈伤组织，25°C暗培养3天，进一步在含羧苄青霉素250 mg l-1和hygromycin 50 mg l-1的筛选培养基(NB培养基+ 2，4 - D 2 mg l-1 +羧节青霉素250mg l-1 + hygromycin 50 mg l-1)? 28 °C暗培养进行筛选。每次筛选20 d左右,共筛选2-3次。
[0025]将筛选获得的抗性愈伤组织转移至分化培养基(NB培养基+ KT 10 mg l-1 + NAA
0.4 mg l-1)上，28 °C光培养20-30 d，分化获得小苗，经过生根筛选(生根培养基为:1/2 MS无机盐+ MS有机成分+ hygromycin 30 mg 1_1)28 °C，移栽于温室内。利用pUXSHCLF-GUS转化水稻愈伤组织，共获得了 14个独立的阳性转基因株系。
[0026]【实施例3】转基因水稻种植及T1代种子化学诱导处理
在温室中种植转基因水稻Ttl代植株，按常规管理，至植株开花结实，成熟期按单株收获自交结实种子。
[0027]转基因水稻种子置于37 ° C恒温箱约7 d至完全干燥，进一步去除种子外壳，置培养皿中，以含20 μΜ β-雌二醇(溶解于DMS0)的无菌水浸种及催芽，对照组加入等量DMSO的无菌水浸种及催芽，室温处理3d后，水稻萌芽或移栽至温室培养土中。
[0028]【实施例4】T1代水稻植株分子检测
CTAB法提取Tl代水稻植株叶片基因组DNA，过程如下:取100 mg水稻叶片在液氮中磨成粉末，然后转移至1.5 ml离心管中。加入600 μ I预热1.5 X CTAB缓冲液，65 °C温浴45mirio取出离心管,冷却至室温后加入600 μ I氯仿:异戍醇(24:1)混合均匀，10，000 rpm离心10 min，转移上清液置新离心管中。加入2/3体积的异丙醇混合均匀，5，000 rpm离心30 S，倒掉上清液，以75%乙醇洗涤一遍，去清液后室温下吹干DNA。加入100 μ I ddH20溶解DNA，供PCR检测。
[0029]根据PUXSHCFL~GUS载体的序列，设计了特异性引物Pl:5 ' -ggttgggcggtcgttcattcgttc-3 ' , P2: 5'-ctcgtcaattccaagggcatcggt-3' , P3:5' -gatagtgaaacaggggcaatgg-3' , P4: 5' -caacgctgatcaattccacagttttcg-3'。其中 P1/P2 组合对应pUb1-loxP-FRT-XVE (图1)的一个 981 bp 片段，P3/P4 组合对应
(图1)的一个678片段，P1/P4组合对应两个同向位点发生重组删除后形成的pUb1-1oxP-FRT-GUS结构(图1) 的一个626片段。PCR反应体系为25 μ L，含有模板DNA 50ng, 2 X Reaction Mix 12.5 μ L (含 MgCl2、dNTP 等)，10 μ M 引物 F9-F 和 F9-R 各 I μ L，
0.5U Golden DNA Polymerase (2.5 U/12.5 μ L，TIANGEN 生物技术公司)，ddH20 补齐至 25μ L0 反应条件为:94°C 5min,94°C 30S,58°C 30S,72°C 30S，共 30 个循环，最后 72°C延伸8 min。扩增产物在1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
[0030]PCR扩增结果显示，在5个株系共104个经过诱导处理的植株中，102个植株(98%)能够检测出P1/P4对应的626片段(表1)，表明在这些植株中，在种子吸胀、胚萌动、发芽过程中，以β -雌二醇进行诱导，能够启动位点特异性重组系统，介导两个同向1xP-FRT I点发生删除重组；在102个植株中，有79个植株能够同时检测出Ρ1/Ρ2对应的981片段或Ρ3/Ρ4对应的678片段(表1 )，说明在这些植株组织中，特异性重组行为存在着嵌合体现象，即部分细胞基因组中的两个同向1xP-FRT位Λ间DNA片段未完全删除；其余23个植株(占总检测群体的22%)仅检测出Ρ1/Ρ4扩增片段，而检测不到Ρ1/Ρ2或Ρ3/Ρ4片段，说明在这些植株中，两个同向位点间选择标记基因如?及其它相关DNA片段已被完全删除(表1，图7)。
[0031]进一步从1.0%的琼脂糖凝胶中回收Ρ1/Ρ4的扩增片段，并对回收DNA样品进行测序(英韦创津生物科技有限公司，广州)。测序结果如图8，显示Ubiquitin启动子与1xP-FRT位点相连，随后是GUS编码序列，与预期重组结构的序列完全一致，进一步证实原载体中位于两个同向位点间的选择标记基因如?及其它相关DNA片段已被精确删除。
[0032]表1化学诱导处理后T1代转基因水稻植株PCR检测结果统计
【权利要求】
1.一种在植株水平上删除转基因水稻标记基因的方法，其特征在于:包括以下步骤: a.构建化学诱导型位点特异性重组系统的水稻转化载体，其中选择标记基因位于两个同向位点特异性识别序列之间，目的基因结构位于两个位点特异性识别序列之外； b.利用该转化载体，通过农杆菌介导方法，转化水稻愈伤组织，筛选、分化产生转基因水稻植株； c.种植转基因水稻植株，收获自交结实种子； d.浸种、催芽过程中，经过化学诱导处理所收获种子，诱导位点特异性识别序列产生重组，介导选择标记基因发生删除； e.种植并检测经处理萌发的幼苗，进一步分子检测转基因结构的重组行为，获得选择标记基因被删除的转基因水稻幼苗。
2.根据权利要求1所述的在植株水平上删除转基因水稻标记基因的方法，其特征在于:原载体中选择标记基因为潮霉素抗性基因如?，原载体可以用于组装其它选择标记基因。
3.根据权利要求1所述的在植株水平上删除转基因水稻标记基因的方法，其特征在于:原载体中位点特异性识别序列是1xP-FRT融合序列，原载体可以用于组装其它高效位点特异性重组酶识别序列。
4.根据权利要求1所述的在植株水平上删除转基因水稻标记基因的方法，其特征在于:原载体中目标基因为报告基因，原载体可以用于组装其它有应用价值的基因。
5.如权利要求4所述的有应用价值的基因，其特征在于:有应用价值的基因指抗虫基因、抗病基因、抗除草剂基因、抗逆基因、抗衰老基因、品质功能改良基因以及由上述基因组成的融合或多价基因。
6.如权利要求1所述的在植株水平上删除转基因水稻标记基因的方法，其特征在于:水稻是指籼稻和粳稻。
【文档编号】A01H5/00GK103589750SQ201310560710
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月13日 优先权日:2013年11月13日
【发明者】王 锋, 陈松彪, 陈在杰, 程倩倩, 陈子强, 胡昌泉, 林艳, 田大刚, 颜静宛 申请人:福建省农业科学院生物技术研究所