烟草隐性抗PVY基因eIF4E-1及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开烟草隐性抗PVY基因eIF4E-1及其应用，包含eIF4E-1基因编码区的DNA片段，该DNA片段由特异性引物对引物4E-1F（SEQIDNo.3）和引物4E-1R（SEQIDNo.4）通过PCR扩增得到；首先得到烟草抗PVY基因eIF4E-1编码区的核苷酸序SEQIDNO.1，及其编码的蛋白质的氨基酸序列SEQIDNO.2，所述的eIF4E-1基因为隐性抗病基因，将eIF4E-1基因通过常规育种手段使感病烟草eIF4E-1基因丢失，得到非转基因抗病烟草，利用eIF4E-1基因构建干涉载体质粒，并转化到感病烟草，抑制感病烟草eIF4E-1基因的表达，获得抗病性明显增强的转基因烟草，本发明对于培育抗PVY属病毒病烟草具有重大应用前景。
【专利说明】烟草隐性抗PVY基因elF4E-1及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种烟草抗PVY基因eIF4E_l及其应用。
【背景技术】
[0002]马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)能侵染34个属170多种植物，对茄科作物(如:烟草、马铃薯、辣椒、番茄等)危害较重。PVY侵染烟草的病害又称为烟草脉斑病，是一种世界性的流行病害，由于缺乏抗病主栽品种和综合防治措施难以落实，在我国烟区危害严重。PVY的侵染可使烟草产量减少7%-18%，产值减少11%-80%。1989年，烟草脉斑病导致加拿大烟草业直接经济损失达100万美元。1993年脉斑病在我国山东烟区开始流行，到1998年成为第一大烟草病害。PVY在河南、陕西、黑龙江、辽宁、安徽、贵州和云南的局部烟区的危害严重，给烟叶生产带来较大损失。
[0003]选育抗PVY的烟草品种是防治该病最经济有效的方法。美国G.Koellent对栽培种Virgin A的变种Virgin A Mutant (VAM)的研究后发现VAM的PVY的抗性主要是由隐性单基因(va)控制的，对PVY的多个株系、特别是坏死株系具有抗性。Noguchis S.等对VAM遗传位点的研究后发现VAM对PVY的抗性是由于大段染色体缺失造成的。这个发现与VAM来源于X-射线突变体相吻合。VAM对PVY抗性的分子机理目前并不清楚。
[0004]美国、欧盟和日本应用VAM其他类似的高抗抗源，选育出抗PVY的白肋烟品种TN86、TN90和烤烟品种NC55、NC102。由于抗病基因的连锁累赘或品种的生态适用性等原因，上述烤烟品种在我国的推广种植面积不大。在我国通过常规育种获得抗PVY烟草的鲜有报道。在辣椒和番爺中发现隐性抗PVY基因。辣椒pvr隐性等位基因(pvrl、pvr2、pvr5)编码的蛋白(eIF4E)能与 PVY的VPg相互作用，抑制病毒复制和移动。在番茄中，突变后的eIF4E蛋白(缺失第2第3个外显子部分)能够提供番茄PVY的抗性。烟草、辣椒和番茄同属茄科作物，感染相同的病毒PVY。有文献报道烟草中同样存在eIF4E基因。因此，推测烟草中的eIF4E基因与感PVY相关，但烟草中的隐性抗PVY基因未见文献报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是分离克隆烟草品种TN86中缺失的一个有生物学功能的感PVY基因(隐性抗PVY基因)eIF4E-l编码区(SEQ ID N0.1)。
[0006]本发明的另一个目的是提供上述抗PVY基因所编码的蛋白质氨基酸序列(SEQ IDN0.2)。
[0007]本发明的另一个目的是提供用于扩增上述抗PVY基因的特异性引物对SEQ IDN0.3 和 SEQ ID N0.4，其特征在于:SEQ ID N0.3 的核苷酸序列为 CGCGGATCCATGGCAGAGGAAGCTGAGAAATT, SEQ ID N0.4 的核苷酸序列为 GCTAGAGCTCCTATACTGTATAACGATTCTTGG。
[0008]4E-1F:CGCGGATCCATGGCAGAGGAAGCTGAGAAATT (SEQ ID N0.3)；
[0009]4E-1R:GCTAGAGCTCCTATACTGTATAACGATTCTTGG (SEQ ID N0.4)。
[0010]本发明的目的通过如下技术方案实现:[0011 ] 烟草隐性抗PVY基因eIF4E_l，其特征是，包含eIF4E_l基因编码区的DNA片段，该DNA片段由特异性引物对引物4E-1F (SEQ ID N0.3)和引物4E-1R (SEQ ID N0.4)通过PCR扩增得到；该DNA片段缺失或该片段编码蛋白的缺失能赋予烟草对马铃薯Y病毒(Potatovirus Y)所引起的病害的感病性丧失；该DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0012]所述eIF4E_l基因编码区的DNA片段如SEQ ID N0.1所示的序列表，或者基本相当于SEQ ID N0.1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID N0.1所示的亚片段。
[0013]所述的SEQ ID N0.1核苷酸序列为:
[0014]ATGGCAGAGGAAGCTGAGAAATTGCGGGTAGATGAAGTAGAAGTAGTCGACGATGGACCTGAAGAAGGAGAAATTGTGGATGAATCTGATGATACGGCGTCGTATTTGGGCAAAGAAATCAAACCTAAGCATCCATTAGAGAATTCTTGGACTTTTTGGTTTGATAATCCTATGGCTAAATCTAGACAAGCTGCTTGGGGCAGTTCCCTTCGCGAACTTTACACTTTTTCCACTGTCGAAGATTTTTGGGGTGTTTACAATAATATCAACCACCCAAGCAAGTTAGTTGTGGGAGCAGACTTTCATTGTTTTAAGCATAAAATTGAGCCAAAGTGGGAAGATCCTGTATGTGCGAATGGAGGGAATTGGACAATGAGCTTTAGTAAGGGTAAATCTGATACCAGCTGGCTATACACGCTGCTGGCAATGATTGGACATCAATTCGATCATGGAGAGGAAATTTGTGGAGCAGTAGTTAGCGTCCGAAATAAGGGGGATAAAATAGCTTTATGGACCAAGAATGCTGCAAATGAAACAGCTCAGGTTAGCATTGGTAAGCAATGGAAGGAGTTTCTGGATTACAGCAACTCGATTGGCTTCATATTTCATGACGACTCAATGAGGCTCGGCAGAG GTGCCAAGAATCGTTATACAGTATAGo
[0015]所述的其编码蛋白质的氨基酸序列SEQ ID N0.2为:
[0016]MAEEAEKLRVDEVEVVDDGPEEGEIVDESDDTASYLGKEIKPKHPLENSWTFWFDNPMAKSRQAAWGSSLRELYTFSTVEDFWGVYNNINHPSKLVVGADFHCFKHKIEPKWEDPVCANGGNffTMSFSKGKSDTSffLYTLLAMIGHQFDHGEEICGAVVSVRNKGDKIALWTKNAANETAQVSIGKQWKEFLDYSNSIGFIFHDDSMRLGRGAKNRYTVo
[0017]所述的抗PVY基因的特异性引物对SEQ ID N0.3的核苷酸序列为CGCGGATCCATGGCAGAGGAAGCTGAGAAATT, SEQ ID N0.4 的核苷酸序列为 GCTAGAGCTCCTATACTGTATAACGATTCTTGG0
[0018]分离克隆烟草品种TN86中缺失的一个有生物学功能的隐性抗PVY基因，过表达eIF4E-l基因编码区的DNA片段使抗PVY的烟草品种TN86表现为感病，表明为烟草感PVY基因，也就是烟草隐性抗PVY基因。
[0019]烟草隐性抗PVY基因eIF4E_l的应用，首先得到烟草抗PVY基因eIF4E_l编码区的核苷酸序SEQ ID N0.1，及其编码的蛋白质的氨基酸序列SEQ ID N0.2，所述的eIF4E_l基因为隐性抗病基因，将eIF4E-l基因通过常规育种手段使感病烟草eIF4E-l基因丢失，得到非转基因抗病烟草，利用eIF4E-l基因构建干涉载体质粒，并转化到感病烟草，抑制感病烟草eIF4E-l基因的表达，获得抗病性明显增强的转基因烟草。
[0020]本发明涉及分离和应用一种包含eIF4E_l基因编码区的DNA片段，该片段由引物4E-1F (SEQ ID N0.3)和引物4E-1R (SEQ ID N0.4)通过PCR扩增得到。该片段缺失或该片段编码蛋白的功能缺失能赋予烟草对马铃薯Y病毒属病毒(Potyviruses)所引起的病害的感病性丧失。其中，所述片段如序列表SEQ ID N0.1所示，或者基本相当于SEQ ID N0.1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID N0.1所示的亚片段。该DNA序列编码一种真核生物翻译起始因子(eIF4E)蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0021]根据本发明提供的eIF4E_l基因编码区序列信息(SEQ ID N0.1)，本领域技术人员可以通过以下方法容易地获得与eIF4E-l等同的基因:(1)通过基因组数据库检索获得；
(2)以eIF4E-l基因编码区片段为探针筛选烟草基因组文库或cDNA文库获得；(3)根据eIF4E-l基因编码区序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增方法从烟草的基因组、mRNA和cDNA中获得；(4)在eIF4E-l基因编码区序列的基础上用基因工程方法改造获得；(5)用化学合成的方法获得该基因。
[0022]本发明具有如下有益效果:
[0023]本发明提供的烟草PVY隐性抗性基因eIF4E_l具有重要的应用价值。通过常规育种手段使感病烟草eIF4E_l基因丢失，可以得到非转基因抗病烟草。利用eif4e_l基因构建干涉载体质粒，并转化到感病烟草，可以获得抗病性明显增强的转基因烟草。将所述的eIF4E-l基因编码区序列通过突变，可获得失活所述基因的抗病烟草材料，从而应用于生产。本发明对培育抗PVY的烟草品种具有重大应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为采用引物4E-1F和4E-1R从中烟100中PCR扩增出的eIF4E_l的编码区琼脂糖凝胶电泳图，其中:M:DNA Marker (2000bp,宝生物公司)。
[0025]图2为用于构建RNAi表达载体的eIF4E_l基因片段(194bp)PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，其中:M:IOObp DNA Marker (宝生物公司)。
[0026]图3为pK7GWIWG2_eIF4EI质粒的XbaI酶切琼脂糖凝胶电泳图，其中:泳道1:DNA marker (2000bp,宝生物公司);泳道2:pK7GWIWG2质粒；泳道3:pK7GWIWG2质粒单酶切；泳道 4:pK7GWIW G2-eIF4El 质粒；泳道 5:pK7GWIWG2-eIF4El 质粒单酶切，泳道 6:DNAmarker(λ DNA/Hind III)
[0027]图4为TN86-过表达eIF4E_l植株接种PVY后21d的症状，其中:A:左:TN86_过表达植株(TN86-35S:: eIF4E-l)，发病，表现花叶和叶脉坏死；右:TN86对照植株，未发病。B:左:TN86-过表达(TN86-35S:: eIF4E_l)植株叶片，发病，表现花叶和叶脉坏死；；右:TN86对照叶片，未发病。
[0028]图5为TN86-过表达eIF4E_l植株接种PVY后35d的症状，其中:左:TN86_过表达植株(TN86-35S:: eIF4E-l)，发病，表现花叶和叶脉坏死；右:TN86对照植株，未发病。
[0029]图6为云烟87RNAi转基因植株接种PVY后21 d的症状，其中:A:左:云烟87-RNAi植株，未发病；右:云烟87对照植株，发病，表现为花叶和叶脉坏死。B:左:云烟87-RNAi植株叶片，未发病；右:云烟87对照植株叶片，发病，表现为花叶和叶脉坏死。
【具体实施方式】
[0030]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。烟草品种TN86 (抗PVY烟草)、NC55 (抗PVY烟草)、烟草品种中烟100 (感PVY烟草)和烟草品种云烟87 (感PVY烟草):为商业种植烟草品种，公众可以从云南省烟草农业科学研究院获得。
[0031]实施例1
[0032]pCR-Bluntll-TOPO 载体、Gateway LR clonase Enzyme Mix kit、pENTR 2B 载体购自 Invitrogen 公司，pK7GWIWG2 表达载体购自 VIB(www.gateway, psb.ugent.be)。农杆菌 C58Cl(pMP90)(见文献 McKersie, etc.，1999，Plant Physiol 119:839-847)，农杆菌GV3101购自Invitrogen公司。质粒DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA片段纯化试剂盒购自QIAGEN公司。大肠杆菌(Escherichia coli)DH5 α ;限制性内切酶、KlenowFragment ;反转录试剂盒、DNA Marker>LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶及T4 DNA连接酶、壮观霉素均购自大连宝生物公司和Roche公司。RNA提取试剂盒Trizol购自Invitrogen公司，检测PVY的ELISA试剂盒和试纸条购自Agdia公司(www.agdia.com)。
[0033]一、烟草总RNA的提取
[0034]分别取中烟100和NC55的IOOmg幼嫩叶片放入用DEPC水处理过的研钵中；加入ImlTrizol (Invitrogen公司生产的RNA专用提取试剂),研磨成均衆,转移至DEPC水处理过的EP离心管中，室温静置5min ;加入0.2ml三氯甲烷，振荡15sec，室温静置3min ；4°C下12000g离心15min ;转移上清液至新的EP管，转移上清液最多400 μ L ;向上清液中加入
0.5ml异丙醇,静置IOmin ;4°C下12000g离心15min ;弃异丙醇,用移液枪将残余的异丙醇吸出丢弃，加入Iml75%的乙醇；4°C下7500g离心2min ;用移液枪将残余的乙醇吸出丢弃，室温干燥2-3min ;加入30ul DEPC处理水溶解沉淀块，若不易溶解则放入55°C水浴锅中水浴IOmin ;-80°C保存待用。
[0035]二、eIF4E_l基因的克隆
[0036]1.第一链cDNA的合成
[0037]在EP管中加入上述烟草总RNA约 0.1 μ g_5 μ g、oligo (dT) 50ng、IOmM dNTP混合物I μ L，用DEPC处理水补足至10 μ L，混匀后短暂离心。置于65°C水浴5min，取出冰浴lOmin，加入反应混合物 9 μ L( 5 X reaction buffer 4μ L,25mM MgCl22y L,0.1M DTT 2 μ L, RNA 酶抑制剂 I μ L),混匀后短暂离心。25°C保温 2min,加入 I μ L M-MLV Reverse Transcriptase(宝生物公司出品)，混匀后短暂离心。25°C保温20min，然后42°C保温70min，cDNA的合成完成，-20°C保存备用。
[0038]2.eIF4E_l基因编码区的克隆
[0039]根据eIF4E_l基因的序列设计特异引物，同时参考pBI121载体上的酶切位点在引物上引入BamHI及Sac I位点。引物序列为:
[0040]4E-1F:CGCGGATCCATGGCAGAGGAAGCTGAGAAATT (SEQ N0.3)
[0041]4E-1R:GCTAGAGCTCCTATACTGTATAACGATTCTTGG (SEQ N0.4)
[0042]以中烟100的cDNA为模板，用Taq酶(宝生物公司出品)和引物4E-1F和4E_1R( SEQN0.3和SEQ N0.4)，通过PCR扩增感病品种中烟100的eIF4E_l基因片段，大小为660bp，PCR反应体系如下:总体积为20yL，其中50ng/yL DNA样品2.5 μ LUOXPCR buffer 2.0 μ L,dNTPs l.2μL，引物4E-lF和4E-lR各l.5μL，Eχ-Taq DNA 酶 0.3 μ L，ddH20 12.6 μ L0 所用试剂购自宝生物公司。
[0043]PCR 温度循环 参数为:94°C 3min，94°C 30sec，55°C 30sec，72°C lmin，35 个循环，72°C 7min。PCR反应在BIO-RAD基因扩增仪(规格型号为ClOOO Thermal Cycler)上进行。
[0044]PCR产物回收与纯化:将PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为I X TBE,当电泳指示剂溴酚蓝在120V及60min条件下迁移至足够分离DNA片段时，取下凝胶，用凝胶图像分析系统记录结果，如图1所示。在紫外灯下割下含目的DNA片段凝胶。用胶回收试剂盒(QIAGEN公司出品)回收DNA。
[0045]三、eIF4E_l过表达载体构建
[0046]将纯化好的DNA片段通过T4连接酶连接到pCR-Bluntll-TOPO载体上，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒采用BamHI及SacI酶切检测，挑选酶切正确的质粒，送大连宝生物公司测序。将测序正确的含有eIF4E-l基因的pCR-Bluntll-TOPO质粒及PBI121质粒均用BamHI及SacI双酶切过夜，酶切后凝胶电泳，分别切胶回收目标基因片段及载体片段，通过T4DNA连接酶将eIF4E-l基因片段连接pBI121载体上，获得含有eIF4E-l基因片段的植物表达载体。转化农杆菌GV3101，挑选阳性克隆，用于转化烟草。
[0047]四、eIF4E_l干涉(RNAi )表达载体构建
[0048](l)eIF4e-l基因片段的PCR扩增与纯化
[0049]根据eIF4e_l基因序列，参考中间载体上酶切位点的位置，在正向引物和反向引物上分别引入BamH I和Xho I酶切位点。正向引物eIF4El 194 F Bam:5’_CGGGATCCATGGCAGAGGAAGCTGAGAAATTG-3’，反向引物 eIF4El_194_R_Xho:5’ -CCGCTCGAGGCAGCTTGTCTAGATTTAGCC-3，。
[0050]以云烟87的cDNA为模板，以上述引物进行PCR扩增。PCR反应体系为:总体积为 20μ L，其中 50ng/y L DNA 样品 2.5 μ L、10 X PCR buffer 2.0 μ L, dNTPs 1.2yL，引物4E-1F 和 4E-1R 各 1.5μ L，Ex-Taq DNA 酶 0.3 μ L，ddH20 12.6 μ L0 所用试剂购自宝生物公司。
[0051]PCR 温度循环参数为`:94°C 3min,94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 30sec, 35 个循环，72°C 5min。PCR反应在BIO-RAD基因扩增仪(规格型号ClOOO Thermal Cycler)上进行。
[0052]PCR产物回收与纯化:将PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为I X TBE,当电泳指示剂溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段时(120V, 60min)，取下凝胶，应凝胶图像分析系统记录结果，如图2所示。在紫外灯下割下含目的DNA片段凝胶。用胶回收试剂盒(QIAGEN公司出品)回收DNA。
[0053](2)目标片段连接 pCR-Bluntll-TOPO 载体
[0054]将纯化的目的片段连接到pCR-Bluntll-TOPO载体上，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞。挑选阳性克隆，提取质粒进行酶切鉴定，挑选酶切鉴定鉴定正确的质粒，送宝生物公司测序。获得pT0P0-eIF4El-194质粒。
[0055](3 )目标片段连接pENTR 2B载体
[0056]将pT0P0-eIF4El-194质粒和pENTR 2B质粒均用BamH I和Xho I双酶切，分别割胶回收目标基因片段和载体片段，通过T4DNA连接酶连接获得p2B-eIF4El-194入门克隆。
[0057](4)通过LR反应获得植物RNAi载体
[0058]米用Gateway LR clonase Enzyme Mix kit (Invitrogen 公司出品)，将构建得到入门克隆和PK7GWIWG2表达载体(VIB)进行LR反应获得RNAi载体。反应体系为:p2B-eIF4El-194 入门克隆(300ng/μ L) 2 μ L，pK7GWIWG2 表达载体(200ng/μ L) I μ L,5 X LR Clonase reaction buffer I μ L, LR Clonase enzyme mix IuL0 在 25°C过夜后转化感受态细胞Escherichia coli DH5 α。挑选阳性克隆，提取质粒。质粒XbaI酶切后产生的条带与预期一致，见图3，质粒送宝生物公司测序。获得测序正确的植物RNAi载体pK7GWIWG2-eIF4El。转化农杆菌C58C1 (pMP90)，挑选阳性克隆，用于转化烟草。[0059]五、烟草转化
[0060]挑取含目标表达载体的农杆菌克隆接种于50ml的LB培养基中(含壮观霉素Spe100 μ g/mL), 180rpm, 28°C培养 24h,菌液 OD600 至 1.0 左右，3000rpm 离心 IOmin,沉淀菌体。再用IOml左右的MS液体培养基悬浮，3000rpm离心lOmin，沉淀菌体。重复以上操作2~3次。最后用加入一定体积的MS液体培养基重悬浮，使菌体的OD6tltl值为0.5。采用叶盘法转化，选取无菌培养烟草抗PVY品种TN86和感PVY品种云烟87的叶片，在农杆菌菌液中浸染15min至20min，用无菌吸水纸吸干后，平铺于MSl培养基上黑暗共培养2d，将外植体转移至含羧卞青霉素500 μ g/mL和卡那霉素200 μ g/mL的芽诱导培养基如MS4上进行筛选，约15d继代一次。待有芽生成后,转入含羧卞青霉素250 μ g/mL和卡那霉素100 μ g/mL的生根培养基MS上，进行根诱导生长。待根系发达后，移栽到温室中，进行常规管理，获得转基因烟草Ttl代苗。所获得的Ttl代转基因植株，采用卡那霉素抗性基因(NPT II)引物进行基因组PCR检测，确定NPT II阳性的转基因植株，用于PVY抗性检测。
[0061]六、过表达eIF4E_l转基因TN86烟草对PVY的抗性检测
[0062]对60株Ttl转基因植株和转基因空白对照TN86进行PVY抗性鉴定。苗期采用高压喷枪接种马铃薯Y病毒(PVY)坏死株系ZT-5的病叶汁液40倍。接种后14d、21d调查发病情况，并采集叶片样品，采用Agdia公司的ELISA试剂盒和试纸条，检测PVY。
[0063]接种后第21天的症状调查和采样ELISA检测结果表明:过表达eIF4E_l的TN86转基因苗表现PVY症状，如图4和图5所示，ELISA和试纸条检测为PVY阳性，如表1。对照TN86植株无PVY症状，ELISA和试纸条检测为PVY阴性。过表达eIF4E_l使抗PVY的烟草品种TN86表现为感病，表明eIF4E-l具备生物学功能，为烟草感PVY基因，也就是烟草隐性抗PVY基因。
[0064]表1过表达eIF4E_l的TN86苗接种PVY后第21天的症状与PVY病毒检测
[0065]
【权利要求】
1.烟草隐性抗PVY基因eIF4E-l，其特征是，包含eIF4E-l基因编码区的DNA片段，该DNA片段由特异性引物对引物4E-1F (SEQ ID N0.3)和引物4E-1R (SEQ ID N0.4)通过PCR扩增得到；该DNA片段缺失或该片段编码蛋白的缺失能赋予烟草对马铃薯Y病毒(Potatovirus Y)所引起的病害的感病性丧失；该DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.如权利要求1所述的烟草隐性抗PVY基因eIF4E-l，其特征是，所述eIF4E_l基因编码区的DNA片段如SEQ ID N0.1所示的序列表，或者基本相当于SEQ ID N0.1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID N0.1所示的亚片段。
3.如权利要求1所述的烟草隐性抗PVY基因eIF4E-l，其特征是，所述的SEQID N0.1核苷酸序列为:
ATGGCAGAGGAAGCTGAGAAATTGCGGGTAGATGAAGTAGAAGTAGTCGACGATGGACCTGAAGAAGGAGAAATTGTGGATGAATCTGATGATACGGCGTCGTATTTGGGCAAAGAAATCAAACCTAAGCATCCATTAGAGAATTCTTGGACTTTTTGGTTTGATAATCCTATGGCTAAATCTAGACAAGCTGCTTGGGGCAGTTCCCTTCGCGAACTTTACACTTTTTCCACTGTCGAAGATTTTTGGGGTGTTTACAATAATATCAACCACCCAAGCAAGTTAGTTGTGGGAGCAGACTTTCATTGTTTTAAGCATAAAATTGAGCCAAAGTGGGAAGATCCTGTATGTGCGAATGGAGGGAATTGGACAATGAGCTTTAGTAAGGGTAAATCTGATACCAGCTGGCTATACACGCTGCTGGCAATGATTGGACATCAATTCGATCATGGAGAGGAAATTTGTGGAGCAGTAGTTAGCGTCCGAAATAAGGGGGATAAAATAGCTTTATGGACCAAGAATGCTGCAAATGAAACAGCTCAGGTTAGCATTGGTAAGCAATGGAAGGAGTTTCTGGATTACAGCAACTCGATTGGCTTCATATTTCATGACGACTCAATGAGGCTCGGCAGAGGTGCCAAGAATCGTTATACAGTATAGo
4.如权利要求1所述的烟草隐性抗PVY基因eIF4E-l，其特征是，所述的其编码蛋白质的氨基酸序列SEQ ID N0.2为:
maeeaeklrvdevevvddgpeegeivdesddtasylgkeikpkhplenswtfwfdnpmaksrqaawgssIrelytfstvedfwgvynninhpsklvvgadfhcfkhkiepkwedpvcanggnwtmsfskgksdtswlytIlamighqfdhgeeicgavvsvrnkgdkialwtknaanetaqvsigkqwkefldysnsigfifhddsmrlgrgaknrytvο
5.如权利要求1所述的烟草隐性抗PVY基因eIF4E-l，其特征是，所述的抗PVY基因的特异性引物对 SEQ ID N0.3 的核苷酸序列为 CGCGGATCCATGGCAGAGGAAGCTGAGAAATT，SEQ IDN0.4 的核苷酸序列为 GCTAGAGCTCCTATACTGTATAACGATTCTTGG。
6.烟草隐性抗PVY基因eIF4E-l，其特征是，分离克隆烟草品种TN86中缺失的一个有生物学功能的隐性抗PVY基因，过表达eIF4E-l基因编码区的DNA片段使抗PVY的烟草品种TN86表现为感病，表明为烟草感PVY基因，也就是烟草隐性抗PVY基因。
7.烟草隐性抗P VY基因eIF4E-l的应用，其特征是，首先得到烟草抗PVY基因eIF4E_l编码区的核苷酸序SEQ ID N0.1，及其编码的蛋白质的氨基酸序列SEQ ID N0.2，所述的eIF4E-l基因为隐性抗病基因，将eIF4E-l基因通过常规育种手段使感病烟草eIF4E_l基因丢失，得到非转基因抗病烟草，利用eIF4E-l基因构建干涉载体质粒，并转化到感病烟草，抑制感病烟草eIF4E-l基因的表达，获得抗病性明显增强的转基因烟草。
【文档编号】A01H5/00GK103820465SQ201310687774
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2013年12月16日 优先权日:2013年12月16日
【发明者】刘勇, 王丙武, 宋中邦, 高玉龙, 李文正, 谢贺, 杨大海, 陈学军, 肖炳光 申请人:云南省烟草农业科学研究院