一种生物抗菌剂的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种生物抗菌剂的制备方法，是将生物抗体诱导源菌种分别接种到五龄蚕活体进行免疫培养，制得生物活性非致病性菌抗体菌液，再将其合并，经过干燥、加入生物激素、磁力搅拌培养获得；或是将由生物抗体诱导源菌种制备得到细菌和真菌的混合源种菌孢子悬浮液的菌种接种到五龄蚕活体上，进行抗菌培养，再与生物激素或细胞分裂素制得。所制得的抗菌剂产品对农作物可预防青枯病和枯萎病，预防发病率达80%~90%；该产品具有较强的抗菌作用及高效、广谱的抗菌优势，已完成了中试，本方法技术路线简便，产品稳定，生产成本低廉，产率可控度高，无污染、成果容易转化、便于产业化生产。
【专利说明】一种生物抗菌剂的制备方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种抗菌剂，具体是一种生物抗菌剂。
【背景技术】
[0002]抗微生物(antimicrobialpeptide)或生物抗菌剂，是生物免疫系统产生的一类抵抗外界生物感染源的活性蛋白多肽物质，在昆虫、植物、动物及人体内广泛存在。它除有非特异性的抗细菌、真菌、病毒、抗感染、抗疾病的作用外，还有抗细胞变异、抗肿瘤细胞的作用，且不损害人体正常细胞，尤其对多重耐药菌株仍有效。生物抗菌剂对革兰氏阳性和阴性细菌约40余种、绿脓杆菌和副伤寒菌等耐药性菌株均有较强的杀灭作用。有效生物抗性药物是当今世界研究的重点和热点，由青枯病病原菌引起的番茄和辣椒青枯病(BacterialWilt)、由枯萎镰刀菌引起的香蕉枯萎病(Fusarium wilt)等世界性细菌毁灭性土传病害已经有许多研究报道。但是，利用五龄蚕幼虫活体，经中部1/2丝腺处皮下注射接种诱导生物抗性直接用于农业抗生预防的研究未见报道。
[0003]本申请的发明人所在组从2004年广东省重点引导项目立项资助以来，十年时间对蚕的再生资源进行了深入系统的研究、试验证明家蚕具有超强的免疫蛋白合成能力，一条蚕，在不到一个月的生长期中，食用3(T40g的桑叶可合成并分泌可利用鲜丝腺3~5g或吐出0.5"!.5g的蚕丝蛋白。试验证明蚕抗微生物(antimicrobialpeptide)或生物抗菌剂，是蚕生物免疫系统产生的一类抵抗外界生物感染源的活性多肽物质，具有抗细菌、真菌感染、抗多重耐药菌株变异。对革兰氏阳性、部份革兰氏阴性细菌、对绿脓杆菌和副伤寒菌等耐药性菌株均有一定作用。利用生物抗菌剂对农作物以上病害进行有效地预防，尤其在我国沿海地区温暖潮湿的环境减少发病率可达80、0%。通过生物抗菌剂的广泛应用，可以在植物根际、体表或体内及土壤中快速、大量繁衍和定殖，有效地排斥、阻止和干扰植物病原微生物对植物的侵染和定殖，从而达到抑菌和防病的效果。不但能直接抑制植物病原菌，而且能通过诱发植物自身的抗病潜`能从而增强植物的抗病性。可有效地防止、减轻农业病虫害，减少农药的施用量，降低农业生产投入，确保农产品食用安全，实现农业增产增收，从而起到事半功倍、绿色环保的作用。
[0004]现已有家蚕相关研究，如中国专利ZL200910116463.3公开了一种诱导家蚕产生抗菌肽的方法，所述该方法是采用病毒或细菌注射，或者可以采用使家蚕饥饿的方法；采用病毒或细菌注射时，给家蚕注射微量的细菌或病毒，采用使家蚕饥饿的方法时，对家蚕不喂桑叶，让其饥饿48小时，再正常饲养24小时，该专利所述诱导方法简单易行，能有效诱导出较多的抗菌肽，使抗菌肽提取效率大为提高；中国专利ZL200910193620.0则公开了一种家蚕抗菌肽BmcecE及其cDNA序列与应用，该发明的家蚕抗菌肽对革兰氏阳性菌(苏云金芽孢杆菌)、以及革兰氏阴性菌(大肠杆菌、绿脓杆菌、灵菌败血病菌或青枯菌)均具有抗菌活性、抗菌谱广，家蚕抗菌肽BmcecE可用于人、畜、禽的药物研发、预防和治疗由苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、灵菌败血病菌或青枯菌感染引起人、畜、禽的致病，还可以用于生物产品添加剂的制备，防止由苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、灵菌败血病菌或青枯菌引起的生物产品的腐败变质。
[0005]迄今为止，尚未有关于利用免疫诱导技术，以五龄蚕幼虫活体为原材料，经蚕体中部1/2丝腺处皮下注射接种生物诱导菌种来制备生物抗菌剂直接用于农业抗生预防的具体报道。
【发明内容】
[0006]本发明目的在于克服现代农用生物抗菌剂的缺点或不足，利用蚕体具有超强的免疫蛋白合成能力，以天然五龄蚕为接种原材料,通过受体适应性免疫和体液、细胞免疫途径激活信号因子，使受体淋巴细胞免疫球蛋白产生抗体或激活的自然杀伤细胞，制备具有特殊抗性的病原体丧失至病能力而用于农业生产的生物抗菌剂，达到减轻有毒害性农药使用量，降低农业生产成本，逐步修复土壤生态、使农业合理、安全、高效、高产的良性循环的目的。
[0007]为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下: 一种生物抗菌剂的制备方法，是将生物抗体诱导源菌种分别接种到五龄蚕活体进行免疫培养，制备各生物抗体诱导源菌种的生物活性非致病性菌抗体菌液，再将其合并，经过干燥、加入生物激素、磁力搅拌培养获得，具体步骤如下:
(1)制备青枯菌的生物活性非致病性菌抗体菌液:在常温、湿度7510%条件下，取消毒五龄蚕活体中部1/2丝腺处皮下注射接种青枯菌菌浓为IO8 cfu/ml的菌悬液0.01mL，进行48h的蚕活体免疫培养后，将培养后的蚕活体以组织粉碎机进行组织粉碎，遮光条件下磁力搅拌培养72h，加温至100°C下恒温10-15min，过滤，过滤液静置12_14h，获青枯菌的生物活性非致病性菌抗体菌液；
(2)制备辣椒疫霉菌的生物活性非致病性菌抗体菌液:在常温、湿度75~80%条件下，取消毒五龄蚕活体中部1/2丝腺处皮下注射接种菌浓为IO6 cfu/ml的辣椒疫霉菌游动孢子菌悬液0.01mL，进行48小时的蚕活体免疫培养后，将培养后的蚕活体以组织粉碎机进行组织粉碎，遮光条件下磁力搅拌培养72h，加温至60°C下恒温10-15min，过滤，过滤液静置12-14h，获辣椒疫霉菌的生物活性非致病性菌抗体菌液；
(3)制备黄瓜枯萎病菌的生物活性非致病性菌抗体菌液:在常温、湿度75、0%条件下，取消毒五龄蚕活体中部1/2丝腺处皮下注射接种菌浓为IO6 cfu/ml的黄瓜枯萎病菌孢子菌悬液0.01mL，进行48小时的蚕活体免疫培养后，将培养后的蚕活体以组织粉碎机进行组织粉碎，遮光条件下磁力搅拌培养72h，加温至100°C下恒温10-15min，过滤，过滤液静置12-14h，获青枯菌的生物活性非致病性菌抗体菌液；
(4)制备枯草芽孢杆菌的生物活性非致病性菌抗体菌液:在常温、湿度75~80%条件下，取消毒五龄蚕活体中部1/2丝腺处皮下注射接种菌浓为109cfu/ml的枯草芽孢杆菌菌悬液0.01mL,进行48小时的蚕活体免疫培养后，将培养后的蚕活体以组织粉碎机进行组织粉碎，遮光条件下磁力搅拌培养72h，加温至10(TC下恒温10_15min，过滤，过滤液静置12-14h，获青枯菌的生物活性非致病性菌抗体菌液；
(5)将上述制备得到的青枯菌、辣椒疫霉菌、黄瓜枯萎病菌、枯草芽孢杆菌的生物活性非致病性菌抗体菌液进行合并，在红外灯下将蚕活体组织粉碎液干燥至水分含量为70%~80%后，投入50kg反应釜中，并加入生物激素，磁力搅拌培养120h，40°C红外灯光照下干燥，，即得。
[0008]—种生物抗菌剂的制备方法，是将由生物抗体诱导源菌种制备得到细菌和真菌的混合源种菌孢子悬浮液的菌种接种到五龄蚕活体上，进行抗菌培养培养，再与生物激素制备得到，具体的步骤如下:
(1)用于接种的细菌和真菌的混合源种菌孢子悬浮液的制备:将收集得到的青枯菌、枯草芽孢杆菌的菌悬液先分别用由无菌水配制的0.5%生理盐水稀释菌种至在显微镜下观察一个视野45-50个孢子，再将分别稀释后的菌悬液组装在一起，混合均匀，菌浓为IO4Cfu/ml，置于4°C冰箱中保存；将收集得到的辣椒疫霉菌、黄瓜枯萎病菌的孢子悬浮液分别用由无菌水配制的0.5%生理盐水稀释菌种至在显微镜下观察一个视野75-80个孢子，再将分别稀释后的孢子悬浮液组装在一起，混合均匀，菌浓IO8Cfu.g_\在置于4°C冰箱中保存；最后将两次组装得到的混合菌悬液和混合孢子悬浮液再组装在一起，混合均匀，制得接种细菌、真菌混合源种菌孢子悬浮液；接种量以液体菌种子控制在IXlO6Cfu.g_\在4°C冰箱中保存；待接种用；
(2)在常温、湿度7510%的条件下，取消毒后五龄蚕活体，以皮试针经五龄蚕活体中部丝腺1/2处经皮下注射接种0.01ml菌浓为IO6Cfu.g—1的步骤(1)制得的细菌和真菌的混合源种菌孢子悬浮液，进行48h的蚕活体抗菌培养，培养结束，用组织粉碎机培养后的蚕活体粉碎，粉碎得到的蚕活体组织粉碎液投入50kg反应爸中，并加入生物激素,在转速为200~500rp/min搅拌条件下培养l(T20d后，加温至60°C，在此温度条件下恒温2小时，过滤，即可制得。
[0009]一种生物抗菌剂的制备方法，是将由生物抗体诱导源菌种制备得到细菌和真菌的混合源种菌孢子悬浮液的菌种接种到五龄蚕活体上，进行抗菌培养培养，再与细胞分裂素和清水制备得到，具体的步骤如下:
(1)用于接种的细菌和真菌的混合源种菌孢子悬浮液的制备:将收集得到的青枯菌、枯草芽孢杆菌的菌悬液先分别用由无菌水配制的0.5%生理盐水稀释菌种至在显微镜下观察一个视野45-50个孢子，再将分别稀释后的菌悬液组装在一起，混合均匀，菌浓为IO4Cfu/ml，置于4°C冰箱中保存；将收集得到的辣椒疫霉菌、黄瓜枯萎病菌的孢子悬浮液分别用由无菌水配制的0.5%生理盐水稀释菌种至在显微镜下观察一个视野75-80个孢子，再将分别稀释后的孢子悬浮液组装在一起，混合均匀，菌浓IO8Cfu.g_\在置于4°C冰箱中保存；最后将两次组装得到的混合菌悬液和混合孢子悬浮液再组装在一起，混合均匀，制得接种细菌、真菌混合源种菌孢子悬浮液；接种量以液体菌种子控制在IX IO6Cfu.g_\在4°C冰箱中保存；待接种用；
(2)常温下，湿度75~80%，取消毒后五龄蚕，皮试针经五龄蚕活体中部丝腺1/2处经皮下注射接种0.01ml菌浓为IO6Cfu.g-1的细菌和真菌的混合源种菌孢子悬浮液，进行48h的蚕活体抗菌培养，培养结束，用组织粉碎机培养后的蚕活体粉碎，得到的蚕活体组织粉碎液；在50kg反应釜中加入20kg清水，加入蚕活体组织粉碎液20kg，再加入细胞分裂素500g，在常温下搅拌培养l(T20d，即可制得。
[0010]本发明所述生物激素为地塞米松磷酸钠或地塞米松醋酸酯，生物激素与蚕活体组织粉碎液质量的用量比例为1-1.2:1000o
[0011]本发明所述细胞分裂素为6-BA，即6-苄氨基腺嘌呤。[0012]本发明所述生物抗体诱导源菌种为青枯菌菌液、辣椒疫霉菌游动孢子液、黄瓜枯萎病菌孢子液、枯草芽孢杆菌菌液，其各自的收集方法如下:
(O生物抗体诱导源青枯菌的收集:从辣椒病症严重植株茎体液中，以转速1500~2000rp/min离心提取青枯病病原菌(Pseudomonas solanacearum)上清液，取ImL上清液，用划线分离法划线浇在米饭培养基上，冬天36°C，夏天室温下，湿度80-90%，培养3~5d后，再挑取菌落中央呈粉红色、外缘为白色的奶油状，形状不规则的野生型青枯菌菌落转移至同样培养基中转接，室温下黑暗中，20(T500rpm/min转速振荡培养3(T48d后，青枯菌短期可保存在米饭培养基上；按照浊度计数法，以灭菌水稀释成浓度为IO8 cfu/ml的菌悬液，作为接种体，备用；
(2)生物抗体诱导源辣椒疫霉菌游动孢子液的收集:将致病性辣椒疫霉菌菌株从试管中转移至米饭培养基上，夏天室温下，冬天36°C，湿度80-90%，暗培养5-7d，至菌丝长满培养基表面，在培养箱中加入300mL无菌水，将其放置在光照培养箱中培养7d，诱导孢子囊的产生；取出放置在4°C冰箱中3(T40min，然后室温放置4(T60min，反复诱导抱子囊释放游动孢子培养3~5d后，再挑取菌块转移至同样培养基中转接，室温下以20(T500rpm/min转速在黑暗中振荡培养3(T48d，以灭菌水稀释成浓度为IO6 cfu/ml的菌悬液，作为接种体，备用；
(3)生物抗体诱导源黄瓜枯萎病菌孢子液的收集及萌发:将黄瓜枯萎病菌接种在米饭培养基上，夏天置于室温下，冬天36°C，湿度80-90%，暗培养6~8d ;取菌丝外延的新生菌丝，接种于米饭培养基中加入0.5%生理盐水500mL，室温下以20(T500rpm/min转速在黑暗中振荡培养3(T48d，诱导孢子产生，培养液经滤纸过滤，除去菌丝，获得抱子悬浮液；以灭菌水稀释成浓度为IO6 cfu/ml的菌悬液，作为接种体，备用；
(4)生物抗体诱导源枯草芽孢杆菌菌液的收集方法:自购由生物纯化商品代，传代次数不超过5代的枯草芽孢杆菌菌液，取菌液lmL，为5(Tl00cfum，接种米饭培养基上，冬天38 °C，夏天常温下，湿度80-90%，培养:T5d后，至再挑取菌块转移至用同样培养基中转接，室温下以20(T500rpm/min转速在黑暗中振荡培养培养3(T48d，加入0.5%生理盐水匀浆，用500ml离心管以20000rpm/min转速离心，取上清液，以灭菌水稀释成浓度为109cfu.g—1保存，备用。`
[0013]本发明所述的五龄蚕幼虫活体的获得方式如下:蚕卵从蚁蚕起完成四次蜕皮春季大约25天，夏秋23~25天，每条蚕大约进食3(T40g桑叶，发育成5龄蚕，再进食6_8天后停止食桑叶时，成为熟蚕，通体透明。经过人工分检，除去末成熟家蚕，用1/10000高猛酸钾喷五龄蚕活体，蚕体药液自然风干，室温下备用。
[0014]本发明相对于现有技术的有益效果是:
(1)利用蚕体具有超强的免疫蛋白合成能力，以天然五龄蚕为接种原材料，通过受体适应性免疫和体液、细胞免疫途径激活信号因子，使受体淋巴细胞免疫球蛋白产生抗体或激活的自然杀伤细胞，制备具有特殊抗性的生物抗菌剂，所制得的抗菌剂产品对农作物可预防青枯病和枯萎病，预防发病率达80%~90% ；
(2)该产品可以在植物根际、体表或体内及土壤中快速、大量繁衍和定殖，有效地排斥、阻止和干扰植物病原微生物对植物的侵染和定殖，从而达到抑菌和防病的效果；不但能直接抑制植物病原菌，而且能通过诱发植物自身的抗病潜能从而增强植物的抗病性；
(2)作为农业生防抗菌剂，是天然产物，无毒副作用，无污染、不产生耐药作用，生产成本低廉，产率稳定，成果容易转化、便于产业化生产。
【具体实施方式】
[0015]下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
[0016]在以下的实施例中，五龄蚕幼虫活体的获得方式如下:蚕卵从蚁蚕起完成四次蜕皮夏秋25天，每条蚕大约进食3(T40g桑叶，发育成5龄蚕，再进食6-8天后停止食桑叶时，成为熟蚕，通体透明。经过人工分检，除去末成熟家蚕，用1/10000高猛酸钾喷五龄蚕活体，蚕体药液自然风干，室温下备用。 [0017]实施例1采用如下步骤制备本实施例的生物抗菌剂:
(O制备青枯菌的生物活性非致病性菌抗体菌液:在常温、湿度75%条件下，取消毒五龄蚕活体中部1/2丝腺处皮下注射接种青枯菌菌浓为IO8 cfu/ml的菌悬液0.01mL，进行48h的蚕活体免疫培养后，将培养后的蚕活体以组织粉碎机进行组织粉碎，遮光条件下磁力搅拌培养72h，加温至100°C下恒温lOmin，过滤，过滤液静置12h，获青枯菌的生物活性非致病性菌抗体菌液；
(2)制备辣椒疫霉菌的生物活性非致病性菌抗体菌液:在常温、湿度80%条件下，取消毒五龄蚕活体中部1/2丝腺处皮下注射接种菌浓为IO6 cfu/ml的辣椒疫霉菌游动孢子菌悬液0.01mL，进行48小时的蚕活体免疫培养后，将培养后的蚕活体以组织粉碎机进行组织粉碎，遮光条件下磁力搅拌培养72h，加温至60°C下恒温12min，过滤，过滤液静置14h，获辣椒疫霉菌的生物活性非致病性菌抗体菌液；
(3)制备黄瓜枯萎病菌的生物活性非致病性菌抗体菌液:在常温、湿度78%条件下，取消毒五龄蚕活体中部1/2丝腺处皮下注射接种菌浓为IO6 cfu/ml的黄瓜枯萎病菌孢子菌悬液0.01mL，进行48小时的蚕活体免疫培养后，将培养后的蚕活体以组织粉碎机进行组织粉碎，遮光条件下磁力搅拌培养72h，加温至100°C下恒温lOmin，过滤，过滤液静置13h，获青枯菌的生物活性非致病性菌抗体菌液；
(4)制备枯草芽孢杆菌的生物活性非致病性菌抗体菌液:在常温、湿度76%条件下，取消毒五龄蚕活体中部1/2丝腺处皮下注射接种菌浓为109cfu/ml的枯草芽孢杆菌菌悬液
0.01mL，进行48小时的蚕活体免疫培养后，将培养后的蚕活体以组织粉碎机进行组织粉碎，遮光条件下磁力搅拌培养72h，加温至10(TC下恒温15min，过滤，过滤液静置12h，获青枯菌的生物活性非致病性菌抗体菌液；
(5)将上述制备得到的青枯菌、辣椒疫霉菌、黄瓜枯萎病菌、枯草芽孢杆菌的生物活性非致病性菌抗体菌液进行合并，在红外灯下将蚕活体组织粉碎液干燥至水分含量为75%后，投入50kg反应釜中，并加入生物激素地塞米松磷酸钠，生物激素与蚕活体组织粉碎液质量的用量比例为1:1000，磁力搅拌培养120h，40°C红外灯光照下干燥，即得。
[0018]本实施例的生物抗体诱导源菌种为青枯菌菌液、辣椒疫霉菌游动孢子液、黄瓜枯萎病菌孢子液、枯草芽孢杆菌菌液，其各自的收集方法如下:
(O生物抗体诱导源青枯菌的收集:从辣椒病症严重植株茎体液中，以转速2000rp/min离心提取青枯病病原菌(Pseudomonas solanacearum)上清液,取ImL上清液,用划线分离法划线浇在米饭培养基上，夏天室温下，湿度85%，培养3d后，再挑取菌落中央呈粉红色、外缘为白色的奶油状，形状不规则的野生型青枯菌菌落转移至同样培养基中转接，室温下黑暗中，300rpm/min转速振荡培养40d后，青枯菌短期可保存在米饭培养基上；按照浊度计数法，以灭菌水稀释成浓度为IO8 cfu/ml的菌悬液，作为接种体，备用；
(2)生物抗体诱导源辣椒疫霉菌游动孢子液的收集:将致病性辣椒疫霉菌菌株从试管中转移至米饭培养基上，夏天室温下，湿度90%，暗培养5d，至菌丝长满培养基表面，在培养箱中加入300mL无菌水，将其放置在光照培养箱中培养7d，诱导孢子囊的产生；取出放置在4°C冰箱中350min，然后室温放置50min，反复诱导抱子囊释放游动孢子培养4d后，再挑取菌块转移至同样培养基中转接，室温下以300rpm/min转速在黑暗中振荡培养48d,以灭菌水稀释成浓度为IO6 cfu/ml的菌悬液，作为接种体，备用；
(3)生物抗体诱导源黄瓜枯萎病菌孢子液的收集及萌发:将黄瓜枯萎病菌接种在米饭培养基上，夏天置于室温下，湿度80%，暗培养8d ;取菌丝外延的新生菌丝，接种于米饭培养基中加入0.5%生理盐水500mL，室温下以500rpm/min转速在黑暗中振荡培养30d，诱导孢子产生，培养液经滤纸过滤，除去菌丝，获得抱子悬浮液；以灭菌水稀释成浓度为IO6 cfu/ml的菌悬液，作为接种体，备用；
(4)生物抗体诱导源枯草芽孢杆菌菌液的收集方法:自购由生物纯化商品代，传代次数不超过5代的枯草芽孢杆菌菌液，取菌液lmL，为IOOcfum，接种米饭培养基上，夏天常温下，湿度85%,培养3~5d后,至再挑取菌块转移至用同样培养基中转接，室温下以200rpm/min转速在黑暗中振荡培养培养42d，加入0.5%生理盐水匀浆，用500ml离心管以20000rpm/min转速离心，取上清液，以灭菌水稀释成浓度为IO9Cfu.g—1保存，备用。
[0019]实施例2采用如下步骤制备本实施例的生物抗菌剂:
(1)细菌和真菌的混合源种菌孢子悬浮液采用如下步骤:将收集得到的青枯菌、枯草芽孢杆菌的菌悬液先分别用由无菌水配制的0.5%生理盐水稀释菌种至在显微镜下观察一个视野45个孢子，再将分别稀释`后的菌悬液组装在一起，混合均匀，菌浓为104cfu/ml，置于4°C冰箱中保存；将收集得到的辣椒疫霉菌、黄瓜枯萎病菌的孢子悬浮液分别用由无菌水配制的0.5%生理盐水稀释菌种至在显微镜下观察一个视野78个孢子，再将分别稀释后的孢子悬浮液组装在一起，混合均匀，菌浓IO8Cfu.g_S在置于4°C冰箱中保存；最后将两次组装得到的混合菌悬液和混合孢子悬浮液再组装在一起，混合均匀，制得接种细菌、真菌混合源种菌孢子悬浮液；接种量以液体菌种子控制在IX IO6Cfu.g_S在4°C冰箱中保存，待接种用；
(2)在常温、湿度78%的条件下，取消毒后五龄蚕活体，以皮试针经五龄蚕活体中部丝腺1/2处经皮下注射接种0.01ml菌浓为IO6Cfu.g—1的细菌和真菌的混合源种菌孢子悬浮液，进行48h的蚕活体抗菌培养，培养结束，用组织粉碎机培养后的蚕活体粉碎，粉碎得到的蚕活体组织粉碎液投入50kg反应釜中，并加入生物激素地塞米松醋酸酯，生物激素与蚕活体组织粉碎液质量的用量比例为1.2:1000，在转速为400rp/min搅拌条件下培养15d后，加温至60°C，在此温度条件下恒温2小时，过滤，即可制得，按500mL/瓶以瓶装。
[0020]经多次试验证明，本实施例制备得到的产品在用于农作物预防青枯病和枯萎病时预防发病率达80%~90%，该产品具有较强的抗菌作用及高效、广谱的抗菌优势。
[0021]实施例3采用如下步骤制备本实施例的生物抗菌剂:
(I)细菌和真菌的混合源种菌孢子悬浮液采用如下步骤:将收集得到的青枯菌、枯草芽孢杆菌的菌悬液先分别用由无菌水配制的0.5%生理盐水稀释菌种至在显微镜下观察一个视野50个孢子，再将分别稀释后的菌悬液组装在一起，混合均匀，菌浓为104cfu/ml，置于4°C冰箱中保存；将收集得到的辣椒疫霉菌、黄瓜枯萎病菌的孢子悬浮液分别用由无菌水配制的0.5%生理盐水稀释菌种至在显微镜下观察一个视野80个孢子，再将分别稀释后的孢子悬浮液组装在一起，混合均匀，菌浓IO8Cfu.g_S在置于4°C冰箱中保存；最后将两次组装得到的混合菌悬液和混合孢子悬浮液再组装在一起，混合均匀，制得接种细菌、真菌混合源种菌孢子悬浮液；接种量以液体菌种子控制在IX IO6Cfu.g_S在4°C冰箱中保存；待接种用；
(2)常温下，湿度75~80%，取消毒后五龄蚕，皮试针经五龄蚕活体中部丝腺1/2处经皮下注射接种0.01ml菌浓为IO6Cfu.g-1的细菌和真菌的混合源种菌孢子悬浮液，进行50h的蚕活体抗菌培养，培养结束，用组织粉碎机培养后的蚕活体粉碎，得到的蚕活体组织粉碎液；在50kg反应釜中加入20kg清水，加入蚕活体组织粉碎液20kg，再加入细胞分裂素6-苄氨基腺嘌呤500g，在常温下搅拌培养20d，即可制得。
[0022]经多次试验证明，本实施例制备得到的产品在用于农作物预防青枯病和枯萎病时预防发病率达80%~90%，该产品具有较强`的抗菌作用及高效、广谱的抗菌优势。
【权利要求】
1.一种生物抗菌剂的制备方法，其特征在于:将生物抗体诱导源菌种分别接种到五龄蚕活体进行免疫培养，制备各生物抗体诱导源菌种的生物活性非致病性菌抗体菌液，再将其合并，经过干燥、加入生物激素、磁力搅拌培养获得，具体步骤如下: (1)制备青枯菌的生物活性非致病性菌抗体菌液:在常温、湿度7510%条件下，取消毒五龄蚕活体中部1/2丝腺处皮下注射接种青枯菌菌浓为108 cfu/ml的菌悬液0.01mL，进行48h的蚕活体免疫培养后，将培养后的蚕活体以组织粉碎机进行组织粉碎，遮光条件下磁力搅拌培养72h，加温至100°C下恒温10-15min，过滤，过滤液静置12_14h，获青枯菌的生物活性非致病性菌抗体菌液； (2)制备辣椒疫霉菌的生物活性非致病性菌抗体菌液:在常温、湿度75~80%条件下，取消毒五龄蚕活体中部1/2丝腺处皮下注射接种菌浓为106 cfu/ml的辣椒疫霉菌游动孢子菌悬液0.01mL，进行48小时的蚕活体免疫培养后，将培养后的蚕活体以组织粉碎机进行组织粉碎，遮光条件下磁力搅拌培养72h，加温至60°C下恒温10-15min，过滤，过滤液静置12-14h，获辣椒疫霉菌的生物活性非致病性菌抗体菌液； (3)制备黄瓜枯萎病菌的生物活性非致病性菌抗体菌液:在常温、湿度75、0%条件下，取消毒五龄蚕活体中部1/2丝腺处皮下注射接种菌浓为IO6 cfu/ml的黄瓜枯萎病菌孢子菌悬液0.01mL，进行48小时的蚕活体免疫培养后，将培养后的蚕活体以组织粉碎机进行组织粉碎，遮光条件下磁力搅拌培养72h，加温至100°C下恒温10-15min，过滤，过滤液静置12-14h，获青枯菌的生物活性非致病性菌抗体菌液； (4)制备枯草芽孢杆菌的生物活性非致病性菌抗体菌液:在常温、湿度75~80%条件下，取消毒五龄蚕活体中部1/2丝腺处皮下注射接种菌浓为109cfu/ml的枯草芽孢杆菌菌悬液0.01mL,进行48小时的蚕活体免疫培养后，将培养后的蚕活体以组织粉碎机进行组织粉碎，遮光条件下磁力搅拌培养72h，加温至100°C下恒温10-15min，过滤，过滤液静置12-14h，获青枯菌的生物活性非致病性菌抗体菌液； (5)将上述制备得到的青枯菌、辣椒疫霉菌、黄瓜枯萎病菌、枯草芽孢杆菌的生物活性非致病性菌抗体菌液进行合并，在红外灯下将蚕活体组织粉碎液干燥至水分含量为70%~80%后，投入50kg反应釜中，并加入生物激素，磁力搅拌培养120h，40°C红外灯光照下干燥，即得。
2.一种生物抗菌剂的制备方法，其特征在于:是将由生物抗体诱导源菌种制备得到细菌和真菌的混合源种菌孢子悬浮液的菌种接种到五龄蚕活体上，进行抗菌培养培养，再与生物激素制备得到，具体的步骤如下: (I)用于接种的细菌和真菌的混合源种菌孢子悬浮液的制备:将收集得到的青枯菌、枯草芽孢杆菌的菌悬液先分别用由无菌水配制的0.5%生理盐水稀释菌种至在显微镜下观察一个视野45-50个孢子，再将分别稀释后的菌悬液组装在一起，混合均匀，菌浓为104Cfu/ml，置于4°C冰箱中保存；将收集得到的辣椒疫霉菌、黄瓜枯萎病菌的孢子悬浮液分别用由无菌水配制的0.5%生理盐水稀释菌种至在显微镜下观察一个视野75-80个孢子，再将分别稀释后的孢子悬浮液组装在一起，混合均匀，菌浓108Cfu.g_\在置于4°C冰箱中保存；最后将两次组装得到的混合菌悬液和混合孢子悬浮液再组装在一起，混合均匀，制得接种细菌、真菌混合源种菌孢子悬浮液；接种量以液体菌种子控制在IX IO6Cfu.g_\在4°C冰箱中保存；待接种用；(2)在常温、湿度7510%的条件下，取消毒后五龄蚕活体，以皮试针经五龄蚕活体中部丝腺1/2处经皮下注射接种0.01ml菌浓为IO6Cfu.g—1的步骤(1)制得的细菌和真菌的混合源种菌孢子悬浮液，进行48h的蚕活体抗菌培养，培养结束，用组织粉碎机培养后的蚕活体粉碎，粉碎得到的蚕活体组织粉碎液投入50kg反应爸中，并加入生物激素,在转速为200~500rp/min搅拌条件下培养l(T20d后，加温至60°C，在此温度条件下恒温2小时，过滤，即可制得。
3.—种生物抗菌剂的制备方法，其特征在于:是将由生物抗体诱导源菌种制备得到细菌和真菌的混合源种菌孢子悬浮液的菌种接种到五龄蚕活体上，进行抗菌培养培养，再与细胞分裂素和清水制备得到，具体的步骤如下: (1)用于接种的细菌和真菌的混合源种菌孢子悬浮液的制备:将收集得到的青枯菌、枯草芽孢杆菌的菌悬液先分别用由无菌水配制的0.5%生理盐水稀释菌种至在显微镜下观察一个视野45-50孢子，再将分别稀释后的菌悬液组装在一起，混合均匀，菌浓为104cfu/ml，置于4°C冰箱中保存；将收集得到的辣椒疫霉菌、黄瓜枯萎病菌的孢子悬浮液分别用由无菌水配制的0.5%生理盐水稀释菌种至在显微镜下观察一个视野75-80个孢子，再将分别稀释后的孢子悬浮液组装在一起，混合均匀，菌浓IO8Cfu.g_S在置于4°C冰箱中保存；最后将两次组装得到的混合菌悬液和混合孢子悬浮液再组装在一起，混合均匀，制得接种细菌、真菌混合源种菌孢子悬浮液；接种量以液体菌种子控制在IX IO6Cfu.g_\在4°C冰箱中保存；待接种用； (2)常温下，湿度75~80%，取消毒后五龄蚕，皮试针经五龄蚕活体中部丝腺1/2处经皮下注射接种0.01ml菌浓为IO6Cfu.g-1的细菌和真菌的混合源种菌孢子悬浮液，进行48h的蚕活体抗菌培养，培养结束， 用组织粉碎机培养后的蚕活体粉碎，得到的蚕活体组织粉碎液；在50kg反应釜中加入20kg清水，加入蚕活体组织粉碎液20kg，再加入细胞分裂素500g，在常温下搅拌培养l(T20d，即可制得。
4.是根据权利要求1或2所述的生物抗菌剂的制备方法，其特征在于:所述生物激素为地塞米松磷酸钠或地塞米松醋酸酯，生物激素与蚕活体组织粉碎液质量的用量比例为1-1.2:1000o
5.根据权利要求3所述的生物抗菌剂的制备方法，其特征在于:所述细胞分裂素为6-ΒΑ，即6-苄氨基腺嘌呤。
6.根据权利要求1或2或3中任一项所述的生物抗菌剂的制备方法，其特征在于:所述生物抗体诱导源菌种为青枯菌菌液、辣椒疫霉菌游动孢子液、黄瓜枯萎病菌孢子液、枯草芽孢杆菌菌液，其各自的收集方法如下: (1)生物抗体诱导源青枯菌的收集:从辣椒病症严重植株茎体液中，以转速1500~2000rp/min离心提取青枯病病原菌(Pseudomonas solanacearum)上清液，取ImL上清液，用划线分离法划线浇在米饭培养基上，冬天36°C，夏天室温下，湿度80-90%，培养3~5d后，再挑取菌落中央呈粉红色、外缘为白色的奶油状，形状不规则的野生型青枯菌菌落转移至同样培养基中转接，室温下黑暗中，20(T500rpm/min转速振荡培养3(T48d后，青枯菌短期可保存在米饭培养基上；按照浊度计数法，以灭菌水稀释成浓度为IO8 cfu/ml的菌悬液，作为接种体，备用； (2)生物抗体诱导源辣椒疫霉菌游动孢子液的收集:将致病性辣椒疫霉菌菌株从试管中转移至米饭培养基上，夏天室温下，冬天36°C，湿度80-90%，暗培养5-7d，至菌丝长满培养基表面，在培养箱中加入300mL无菌水，将其放置在光照培养箱中培养7d，诱导孢子囊的产生；取出放置在4°C冰箱中3(T40min，然后室温放置4(T60min，反复诱导抱子囊释放游动孢子培养:T5d后，再挑取菌块转移至同样培养基中转接，室温下以20(T500rpm/min转速在黑暗中振荡培养3(T48d，以灭菌水稀释成浓度为IO6 cfu/ml的菌悬液，作为接种体，备用； (3)生物抗体诱导源黄瓜枯萎病菌孢子液的收集及萌发:将黄瓜枯萎病菌接种在米饭培养基上，夏天置于室温下，冬天36°C，湿度80-90%，暗培养6~8d ;取菌丝外延的新生菌丝，接种于米饭培养基中加入0.5%生理盐水500mL，室温下以20(T500rpm/min转速在黑暗中振荡培养3(T48d，诱导孢子产生，培养液经滤纸过滤，除去菌丝，获得抱子悬浮液；以灭菌水稀释成浓度为IO6 cfu/ml的菌悬液，作为接种体，备用； (4)生物抗体诱导源枯草芽孢杆菌菌液的收集方法:自购由生物纯化商品代，传代次数不超过5代的枯草芽孢杆菌菌液，取菌液lmL，为5(Tl00cfum，接种米饭培养基上，冬天`38 °C，夏天常温下，湿度80-90%，培养:T5d后，至再挑取菌块转移至用同样培养基中转接，室温下以20(T500rpm/min转速在黑暗中振荡培养培养3(T48d，加入0.5%生理盐水匀浆，用500ml离心管以20000rpm/min转速离心，取上清液，以灭菌水稀释成浓度为109cfu.g—1保存，备用。`
【文档编号】A01P3/00GK103621564SQ201310691513
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年12月17日 优先权日:2013年12月17日
【发明者】罗富英, 李典 申请人:湛江师范学院