利用农杆菌获得转基因籼稻的方法及其专用培养基的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用农杆菌获得转基因籼稻的方法及其专用培养基。本发明提供了用于制备转基因植物的试剂盒，包括诱导培养基、感染液体培养基、共培养培养基、恢复培养基、筛选培养基、预分化培养基、分化培养基和生根培养基；本发明的实验证明，本发明针对籼稻9311，优化了植物组培的培养基，其中恢复培养基和筛选培养基中添加了有效的抑菌的抗生素，制备转基因水稻，可以得到转化率较高的转基因植物，因此本发明获得了适合籼稻9311的PMI/甘露糖筛选系统的遗传转化系统，可以重复稳定获得籼稻9311转基因植株，为基因功能鉴定、安全有效转基因水稻材料的创制奠定技术基础。
【专利说明】利用农杆菌获得转基因籼稻的方法及其专用培养基
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种利用农杆菌获得转基因籼稻的方法及其
专用培养基。
【背景技术】
[0002]水稻是单子叶植物基因组研究模式作物，组织培养较易于其他禾本科作物，已建立较完善的遗传转化体系。但多数籼稻品种在愈伤组织继代过程容易褐化，导致分化能力降低；迄今为止，籼稻遗传转化只局限于某些品种，适合不同籼稻品种遗传转化的高效组织培养体系尚未建立。
[0003]随着转基因作物产业化步伐的加快，植物转基因安全性越来越受到普遍关注，抗生素或除草剂抗性的选择标记基因存留于转基因植物中是转基因产品安全性的一个重要隐患。PMI (6-磷酸甘露糖异构酶6-phosphomannose isomerase)基因作为新型的安全选择标记基因具有筛选率高、生物安全性强等优点，已经越来越广泛地应用于植物转基因的研究中。在水稻遗传转 化中也成功得到应用，并且对影响水稻PMI/甘露糖筛选系统转化效率的因素作了一些研究，只有少数研究以籼稻为材料。
[0004]籼稻9311是我国杂交水稻的骨干恢复系，在水稻生产上占有重要地位，然而该品种的组织培养力较差，愈伤组织继代过程易褐化，作为植物遗传转化受体对通常的筛选剂较敏感，较难获得转基因植株，同时，籼稻9311相对其它品种农杆菌(EHA105)侵染共培养后抑菌较难，因此，适合籼稻9311的遗传转化系统的筛选成为热点。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是提供用于制备转基因植物的试剂盒。
[0006]本发明提供的试剂盒，包括诱导培养基、感染液体培养基、共培养培养基、恢复培养基、筛选培养基、预分化培养基、分化培养基和生根培养基；
[0007]所述诱导培养基由CC液体基本培养基、终浓度为2mg/L的2，4_D (2，4_ 二氯苯氧乙酸)、终浓度为20g/L麦芽糖和终浓度为3g/L植物凝胶组成；
[0008]所述感染液体培养基由终浓度为2950mg/L KC1、终浓度为150mg/L CaCl2.2H20、终浓度为 250mg/LMg04.7H20、终浓度为 150mg/LNaH2P04.H20、终浓度为 3mg/LH3B03、终浓度为 10mg/LMnS04.H20、终浓度为 0.025mg/LCoCl2.6H20、终浓度为 0.025mg/LCuS04.5H20、终浓度为 2mg/L ZnSO4.7H20、终浓度为 0.25mg/L NaMoO4.2H20、终浓度为 0.75mg/LK1、终浓度为27.8mg/L FeSO4.7H20、终浓度为 37.3mg/LNa2-EDTA.2H20、终浓度为 0.4mg/L维生素B1、终浓度为0.5mg/L维生素B6、终浓度为0.5mg/L烟酸、终浓度为100mg/L肌醇、终浓度为500mg/L水解酪蛋白、终浓度为68.5g/L蔗糖、终浓度为36g/L的葡萄糖、终浓度为176.7mg/L的L-精氨酸、终浓度为900mg/L的L-谷氨酰胺、终浓度为300mg/L的L-天冬氨酸、终浓度为20mg/L的乙酰丁香酮和水组成；
[0009]所述共培养培养基由CC液体基本培养基、终浓度为10g/L葡萄糖、终浓度为2mg/L2，4-D、终浓度为30g/L蔗糖、终浓度为3g/L植物凝胶和终浓度为20mg/L乙酰丁香酮组成；
[0010]所述恢复培养基由CC液体基本培养基、终浓度为2mg/L的2，4_D、终浓度为20g/L麦芽糖，终浓度为3g/L植物凝胶、终浓度为0-200mg/L特美汀、终浓度为0_250mg/L头孢
霉素组成，
[0011]所述筛选培养基由CC液体基本培养基、终浓度为2mg/L的2，4_D、终浓度为5g/L蔗糖、终浓度为25g/L甘露糖、终浓度为3g/L植物凝胶、终浓度为0-200mg/L特美汀和终浓度为0-250mg/L头孢霉素组成；
[0012]所述预分化培养基由CC液体基本培养基、终浓度为2mg/L NAA、终浓度为Img/L6-BA、终浓度为20g/L麦芽糖，终浓度为3g/L植物凝胶和终浓度为5mg/L ABA组成；
[0013]所述分化培养基由CC液体基本培养基B、终浓度为lmg/L NAA、终浓度为2mg/L6-BA、终浓度为20g/L麦芽糖，终浓度为3g/L植物凝胶和终浓度为lmg/L KT组成；
[0014]所述生根培养基由终浓度为950mg/L KNO3、终浓度为825mg/L NH4NO3、终浓度为 220mg/L CaCl2.2H20、终浓度为 185mg/L MgO4.7H20、终浓度为 85mg/L ΚΗ2Ρ04、终浓度为
.6.2mg/L Η3Β03、终浓度为 16.9mg/L MnSO4.H20、终浓度为 0.025mg/L CoCl2.6H20、终浓度为.0.025mg/L CuSO4.5H20、终浓度为 8.6mg/L ZnSO4.7H20、终浓度为 0.25mg/LNaMo04.2H20、终浓度为 0.83mg/L ΚΙ、终浓度为 27.8mg/L FeSO4.7H20、终浓度为 37.3mg/L Na2-EDTA.2H20、终浓度为0.4mg/L维生素B1、终浓度为0.5mg/L维生素B6、终浓度为0.5mg/L烟酸、终浓度为100mg/L肌醇、终浓度为20g/L蔗糖、终浓度为0.5mg/L NAA、终浓度为3g/L植物凝胶和水组成；
[0015]所述CC液体基本培养基B为将所述CC液体基本培养基中的36.34g/L甘露醇替换为20g/L山梨醇；
[0016]每IL 所述 CC 液体基本培养基由 1212mg KN03、640mgNH4N03、588mg CaCl2.2H20、247mg MgO4.7H20、136mg KH2P04、27.8mg FeSO4.7H20、37.3mg Na2-EDTA.2H20、3.1mgH3B03、11.15mg MnSO4.4H20、5.76mg ZnSO4.7H20、0.83mgK1、0.24mg NaMoO4.2H20、.0.025mgCuS04.5H20、0.028mg CoCl2.6H20、6mg 烟酸、8.5mg 维生素 B1、Img 维生素 B6、IOOmg肌醇、300mg水解酪蛋白、2.878g脯氨酸、500mg谷氨酰胺、36.43g甘露醇和水组成,用水补足体积。
[0017]上述试剂盒还包括洗菌液；所述洗菌液由终浓度为0-200mg/L特美汀、终浓度为0-250mg/L头孢霉素和水组成。
[0018]上述的试剂盒中，
[0019]所述恢复培养基、所述筛选培养基和所述洗菌液中的特美汀和头孢霉素的终浓度均如下:终浓度为O或200mg/L特美汀、终浓度为O或200mg/L或250mg/L头孢霉素；
[0020]所述筛选培养基中的蔗糖和甘露糖的终浓度如下:
[0021]终浓度为15g/L蔗糖、终浓度为15g/L甘露糖；
[0022]或终浓度为15g/L蔗糖、终浓度为30g/L甘露糖；
[0023]或终浓度为5g/L蔗糖、终浓度为50g/L甘露糖；
[0024]或终浓度为5g/L蔗糖、终浓度为25g/L甘露糖。
[0025]上述的试剂盒中，[0026]所述恢复培养基、所述筛选培养基和所述洗菌液中的特美汀和头孢霉素的终浓度均如下:终浓度为200mg/L特美汀、终浓度为200mg/L头孢霉素；
[0027]所述筛选培养基中的蔗糖和甘露糖的终浓度如下:终浓度为5g/L蔗糖、终浓度为25g/L甘露糖；
[0028]或终浓度为5g/L蔗糖、终浓度为50g/L甘露糖。
[0029]上述的试剂盒中，所述试剂盒中的培养基的pH值均为5.2或5.9 ;
[0030]只有感染培养基和共培养基中为5.2。
[0031]所述植物为单子叶植物或双子叶植物；
[0032]所述单子叶植物具体为籼稻。
[0033]本发明的另一个目的是提供一种制备转基因植物的方法。
[0034]本发明提供的方法，包括如下步骤:
[0035]I)制备转化用受体和侵染用重组农杆菌菌液:
[0036]所述制备转化用受体的方法包括如下步骤:先将植物种子去颖壳，再在上述试剂盒中的所述诱导培养基中进行诱导培养，得到发芽的种子愈伤组织；再将所述发芽的种子愈伤组织去除胚乳和芽，得到胚愈伤组织作为受体；
[0037]所述制备重组农杆菌菌液的方法包括如下步骤:先将含有外源基因的重组农杆菌悬浮在所述感染液体培养基中，得到侵染用重组农杆菌菌液；
[0038]2)将所述胚愈伤组织浸泡`在所述侵染用重组农杆菌菌液中，得到侵染后愈伤组织；
[0039]3)将所述侵染后愈伤组织在所述共培养培养基中进行共培养，得到共培养愈伤组织；
[0040]4)将所述共培养愈伤组织在所述恢复培养基中进行恢复培养，得到恢复后愈伤组织；
[0041]5)将所述恢复后愈伤组织在所述筛选培养基进行筛选培养，得到抗性愈伤组织；
[0042]6)将所述抗性愈伤组织在所述预分化培养基上进行预分化培养，得到预分化培养后愈伤组织；
[0043]7)将所述预分化培养后愈伤组织在所述分化培养基上进行分化培养，得到分化培养后愈伤组织；
[0044]8)将所述分化培养后愈伤组织在所述生根培养基进行生根培养，即得到转基因植物。
[0045]上述方法中，
[0046]步骤3)和步骤4)之间还包括如下步骤:将所述共培养愈伤组织用所述洗菌液洗涤。
[0047]上述方法中，
[0048]步骤I)中，所述诱导培养的条件为25_28°C暗培养7_10天，所述诱导培养的条件具体为27 °C暗培养7天；
[0049]步骤2)中，所述侵染时间为15-25分钟，所述侵染时间具体为20分钟；
[0050]步骤3)中，所述共培养的条件为21_26°C静置暗培养2_3天，所述共培养的条件具体为25 °C静置暗培养3天；[0051]步骤4)中，所述恢复培养的条件为25_28°C静置暗培养3-5天，所述恢复培养的条件具体为27°C静置暗培养3天；
[0052]步骤5)中，所述筛选培养为三次筛选培养，每次所述筛选培养的条件为25_28°C静置暗培养14-20天，每次所述筛选培养的条件具体为27°C静置暗培养15天；
[0053]步骤6)中所述预分化培养的条件为25_28°C静置光照培养14_20天，所述预分化培养的条件具体为27°C静置光照培养15天；
[0054]步骤7)中，所述分化培养的条件为25_28°C静置光照培养15_30天，所述分化培养的条件具体为27°C静置光照培养20天；
[0055]步骤8)中，所述生根培养的条件为25_28°C静置光照培养25-35天，所述生根培养的条件具体为27°C静置光照培养30天；
[0056]各步骤中的所述光照培养的光照周期为16h光/8h暗、光照强度为20001x。
[0057]上述方法中，
[0058]所述外源基因为PMI基因，所述PMI基因的核苷酸序列为序列表中的序列I ;
[0059]所述农杆菌为根瘤农杆菌EHA105。
[0060]上述方法中，
[0061]所述植物为单子叶植物或双子叶植物；
[0062]所述单子叶植物具体为籼稻。
[0063]本发明实施例中的籼稻为籼稻9311。
[0064]本发明的实验证明，本发明针对籼稻9311，优化了植物组培的培养基，其中恢复培养基和筛选培养基中添加了有效的抑菌的抗生素，制备转基因水稻，可以得到转化率较高的转基因植物，因此本发明获得了适合籼稻9311的PMI/甘露糖筛选系统的遗传转化系统，可以重复稳定获得籼稻9311转基因植株，为基因功能鉴定、安全有效转基因水稻材料的创制奠定技术基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0065]图1为籼稻9311抗性愈伤组织筛选
[0066]图2为籼稻9311部分抗性植株PMI基因PCR检测结果
【具体实施方式】
[0067]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0068]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0069]水稻品种:籼稻9311 (又称扬稻6号，国审稻2001002 ;中国作物种质资源信息网络(CGRIS))
[0070]质粒:pCAMBIA1300-PM1:将PMI基因(核苷酸序列作为序列I)取代pCAMBIA1300(YRGene公司、目录号:VZC0323)载体的XhoI酶切位点间的hptll基因得到的载体。
[0071]实施例1、籼稻9311的PMI/甘露糖筛选体系建立
[0072]—、培养基的制备
[0073]以下培养基除感染液体培养基和CC液体基本培养基外都为固体。
[0074]诱导培养基的配方如下:由CC液体基本培养基、终浓度为2mg/L的2，4_D(2，4_ 二氯苯氧乙酸)、终浓度为20g/L麦芽糖，和终浓度为3g/L植物凝胶组成；pH值为5.9。
[0075]诱导培养基配置方法如下:在CC液体基本培养基中添加终浓度为2mg/L的2，4_D(2，4- 二氯苯氧乙酸)、终浓度为20g/L麦芽糖，和终浓度为3g/L植物凝胶，用CC液体基本培养基定容；调节PH值为5.9。
[0076]感染液体培养基的配方如下:由终浓度为2950mg/L KCl、终浓度为150mg/LCaCl2.2H20、终浓度为 250mg/LMg04.7H20、终浓度为 150mg/LNaH2P04.H2O,终浓度为 3mg/LH3B03、终浓度为 10mg/LMnS04.H2O,终浓度为 0.025mg/LCoCl2.6H20、终浓度为 0.025mg/LCuSO4.5H20、终浓度为 2mg/L ZnSO4.7H20、终浓度为 0.25mg/L NaMoO4.2H20、终浓度为0.75mg/LK1、终浓度为 27.8mg/L FeSO4.7H20、终浓度为 37.3mg/LNa2-EDTA.2H20、终浓度为0.4mg/L维生素B1、终浓度为0.5mg/L维生素B6、终浓度为0.5mg/L烟酸、终浓度为IOOmg/L肌醇、终浓度为500mg/L水解酪蛋白、终浓度为68.5g/L蔗糖、终浓度为36g/L的葡萄糖、终浓度为176.7mg/L的L-精氨酸、终浓度为900mg/L的L-谷氨酰胺、终浓度为300mg/L的L-天冬氨酸、终浓度为20mg/L的乙酰丁香酮和水组成，pH值为5.2 ;
[0077]感染液体培养基制备方法为先将终浓度为2950mg/L KCl、终浓度为150mg/L CaCl2.2H20、终浓度为 250mg/LMg04.7H20、终浓度为 150mg/LNaH2P04.H20、终浓度为 3mg/LH3B03、终浓度为 10mg/LMnS04.H2O,终浓度为 0.025mg/LCoCl2.6H20、终浓度为 0.025mg/LCuSO4.5H20、终浓度为 2mg/L ZnSO4.7H20、终浓度为 0.25mg/L NaMoO4.2H20、终浓度为0.75mg/LK1、终浓度为 27.8mg/L FeSO4.7H20、终浓度为 37.3mg/LNa2-EDTA.2H20、终浓度为0.4mg/L维生素B1、终浓度为0.5mg/L维生素B6、终浓度为0.5mg/L烟酸、终浓度为IOOmg/L肌醇、终浓度为500mg/L水解酪蛋白、终浓度为68.5g/L蔗糖、终浓度为36g/L的葡萄糖、终浓度为176.7mg/L的L-精氨酸、终浓度为900mg/L的L-谷氨酰胺、终浓度为300mg/L的L-天冬氨酸和水混匀，灭 菌后加终浓度为20mg/L乙酰丁香酮(AS)，调节pH值为5.2。
[0078]共培养培养基的配方如下:由CC液体基本培养基、终浓度为10g/L葡萄糖、终浓度为2mg/L2，4-D、终浓度为30g/L蔗糖、终浓度为3g/L植物凝胶和终浓度为20mg/L乙酰丁香酮组成;PH值为5.2 ;
[0079]共培养培养基的制备方法如下:在CC液体基本培养基中添加终浓度为10g/L葡萄糖、终浓度为2mg/L2，4-D、终浓度为30g/L蔗糖、终浓度为3g/L植物凝胶，用CC液体基本培养基定容；灭菌后加终浓度为20mg/L乙酰丁香酮，调节pH值为5.2。
[0080]恢复培养基的配方如下:由CC液体基本培养基、终浓度为2mg/L的2，4_D、终浓度为20g/L麦芽糖、终浓度为3g/L植物凝胶、终浓度为200mg/L特美汀、终浓度为200mg/L头孢霉素组成，pH值为5.9。
[0081]恢复培养基按照如下方法制备:在CC液体基本培养基中添加终浓度为2mg/L的2，4-D、终浓度为20g/L麦芽糖和终浓度为3g/L植物凝胶，用CC液体基本培养基定容，灭菌后加终浓度为200mg/L特美汀和终浓度为200mg/L头孢霉素，调节pH值为5.9。
[0082]筛选培养基的配方如下:由CC液体基本培养基、终浓度为2mg/L的2，4_ 二氯苯氧乙酸、终浓度为5g/L蔗糖、终浓度为25g/L甘露糖、终浓度为3g/L植物凝胶、终浓度为200mg/L特美汀、终浓度为200mg/L头孢霉素和水组成，pH值为5.9 ;
[0083]筛选培养基的制备方法如下:在CC液体基本培养基中添加终浓度为终浓度为2mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸、终浓度为5g/L蔗糖、终浓度为25g/L甘露糖、终浓度为3g/L植物凝胶，用CC液体基本培养基定容，灭菌后加200mg/L特美汀和200mg/L头孢霉素，调节pH值为5.9。
[0084]预分化培养基:由CC液体基本培养基、终浓度为2mg/L NAA、终浓度为lmg/L6_BA、终浓度为20g/L麦芽糖、终浓度为3g/L植物凝胶和终浓度为5mg/L ABA组成，pH值为5.9 ；
[0085]预分化培养基的制备方法如下:将CC液体基本培养基中添加终浓度为2mg/LNAA、终浓度为lmg/L6-BA、终浓度为20g/L麦芽糖、终浓度为3g/L植物凝胶和终浓度为5mg/LΑΒΑ,用CC液体基本培养基定容，灭菌后加终浓度为5mg/L ΑΒΑ,调节pH值为5.9。
[0086]分化培养基:由CC液体基本培养基B、终浓度为lmg/L NAA、终浓度为2mg/L6_BA、终浓度为20g/L麦芽糖、终浓度为3g/L植物凝胶、终浓度为lmg/L KT组成，pH值为5.9。
[0087]分化培养基制备方法如下:将CC液体基本培养基B中添加终浓度为lmg/L NAA、终浓度为2mg/L6-BA、终浓度为lmg/L KT、终浓度为20g/L麦芽糖、终浓度为3g/L植物凝胶，用CC液体基本培养基B定容，调节pH值为5.9。
[0088]CC液体基本培养基B为将CC液体基本培养基中的36.34g/L甘露醇替换为20g/L山梨醇，pH值为5.9。
[0089]生根培养基的配方如下:由终浓度为950mg/LKN03、终浓度为825mg/LNH4N03、终浓度为 220mg/LCaCl2.2H20、终浓度为 185mg/LMg04.7H20、终浓度为 85mg/L KH2PO4、终浓度为 6.2mg/LH3B03、终浓度为 16.9mg/LMnS04.H20、终浓度为 0.025mg/LCoCl2.6H20、终浓度为
0.025mg/LCuS04.5H20、终浓度为 8.6ZnS04.7H20、终浓度为 0.25mg/LNaMo04.2H20、终浓度为
0.83mg/L ΚΙ、终浓度为 27.8mg/L FeSO4.7H20、终浓度为 37.3mg/L Na2-EDTA.2H20、终浓度为
0.4mg/L维生素B1、终浓度为0.5mg/L维生素B6、终浓度为0.5mg/L烟酸、终浓度为IOOmg/L肌醇、终浓度为20g/L蔗糖、终浓度为0.5mg/L NAA、终浓度为3g/L植物凝胶和水组成，PH为 5.9。
[0090]生根培养基按照如下方法制备:将终浓度为950mg/LKN03、终浓度为825mg/LNH4NO3' 终浓度为 220mg/LCaCl2.2H20、终浓度为 185mg/LMg04.7H20、终浓度为 85mg/L KH2PO4' 终浓度为 6.2mg/LH3B03、终浓度为 16.9mg/LMnS04.H20、终浓度为 0.025mg/LCoCl2.6H20、终浓度为 0.025mg/LCuS04.5H20、终浓度为 8.6mg/LZnS04.7H20、终浓度为
0.25mg/L NaMoO4.2H20、终浓度为 0.83mg/L ΚΙ、终浓度为 27.8mg/L FeSO4.7H20、终浓度为37.3mg/L Na2-EDTA.2H20、终浓度为0.4mg/L维生素B1、终浓度为0.5mg/L维生素B6、终浓度为0.5mg/L烟酸、终浓度为100mg/L肌醇、终浓度为20g/L蔗糖、终浓度为0.5mg/L NAA、终浓度为3g/L植物凝胶和水混匀，调节pH值为5.9。
[0091]ILCC 液体基本培养基配方:由 1212mg KNO3>640mgNH4N03> 588mg CaCl2.2H20、247mgMgO4.7H20、136mg KH2PO4Λ 27.8mg FeSO4.7H20、37.3mg Na2-EDTA.2H20、3.1mg H3BO3'11.15mgMnSO4.4H20、5.76mg ZnSO4.7H20、0.83mgK1、0.24mg NaMoO4.2H20、0.025mgCuS04.5H20、
0.028mg CoCl2.6H20、6mg烟酸、8.5mg 维生素Bl、lmg维生素B6、100mg肌醇、300mg水解酪蛋白，2.878g脯氨酸，500mg谷氨酰胺，36.43g甘露醇和水组成，用水补足体积；pH值为5.9。
[0092]二、 pCAMBIA1300-PMI导入籼稻9311获得转基因籼稻的方法建立
[0093]1、转化受体的获得
[0094]将籼稻9311成熟种子去掉颖壳，挑选干净没有病斑的种子，用70%酒精灭菌1_2分钟；再用20%的次氯酸钠在200rpm/min摇床上灭菌20分钟左右，用无菌水冲洗5次；用滤纸将水吸干，接种到诱导培养基上，27°C暗培养7天(盾片膨大，胚乳变软)，得到发芽的种子愈伤组织；将发芽的种子愈伤组织去除胚乳和芽，得到胚愈伤组织作为受体进行转化。
[0095]2、重组农杆菌菌液的获得
[0096]1)重组农杆菌获得
[0097]将质粒pCAMBIA1300-PMI转入根癌农杆菌EHA105 (购自上海迈其生物科技有限公司货号:CH5002B)中，得到重组农杆菌(经过提取质粒后PCR扩增获得652bp条带为阳性，PCR 引物:PM1-1:CCGCCGAGCGTAACTATAAA PM1-2:CTGCTGGCTAATGGTGGTTT)。
[0098]2)重组农杆菌菌液的获得
[0099]将重组农杆菌划板YEB (50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平)，28°C暗培养至形成单菌斑，挑取单菌斑接种于500 μ I液体YEB离心管28°C，220rpm/min摇至浑浊，吸取离心管中500 μ I菌液于含有50ml YEB三角瓶，28°C 220rpm/min摇至OD6tltl为0.5，得到重组农杆菌菌液。
[0100]3)侵染用重组农杆菌菌液的获得
[0101]将上述2)制备的重组农杆菌菌液放在50ml离心管中，4°C，6000rpm/min离心8分钟，倒掉上清液，用感染液体培养基洗一次，用50ml感染液体培养基重悬菌液((?_为0.5)，得到侵染用重组农杆菌菌液。
[0102]3、农杆菌转化
[0103]1)侵染
[0104]将步骤I制备的胚愈伤组织浸泡在上述2制备的侵染用重组农杆菌菌液中，侵染20分钟，其间摇动数次，然后倒掉菌液，用灭菌的滤纸将菌液吸干，得到侵染后愈伤组织；
[0105]2)共培养
[0106]将侵染后愈伤组织转移到共培养培养基上进行共培养，得到共培养愈伤组织。
[0107]共培养的条件为25°C静置暗培养3天。
[0108]将共培养愈伤组织用无菌水清洗5次，直到水不再浑浊，再用洗菌液洗一次，吹干，得到洗菌后共培养愈伤组织。
[0109]洗菌液的配方如下:由头孢霉素、特美汀和水组成，头孢霉素在洗菌液中的终浓度为200mg/L，特美汀在洗菌液中的终浓度为200mg/L。
[0110]3)恢复培养
[0111]将洗菌后共培养愈伤组织转移到恢复培养基进行恢复培养，得到恢复后愈伤组织。
[0112]恢复培养的条件为27°C静置暗培养3天。
[0113]3)筛选培养
[0114]将恢复后愈伤组织转移到筛选培养基进行三次筛选培养，得到抗性愈伤组织。
[0115]上述每次筛选培养的条件为27°C静置暗培养15天。
[0116]4)预分化培养
[0117]将抗性愈伤组织转移到预分化培养基进行预分化培养，得到预分化培养后愈伤组织；
[0118]上述预分化培养的条件为27°C静置光照培养(光照周期为16h光/8h暗、光照强度为 20001x) 15 天。[0119]5)分化培养
[0120]将预分化培养后愈伤组织转移到分化培养基进行分化培养，得到分化培养后愈伤组织；
[0121]上述分化培养的条件为27°C静置光照培养(光照周期为16h光/8h暗、光照强度为20001x) 20 天。
[0122]6)生根培养
[0123]将分化培养后愈伤组织转移到生根培养基进行生根培养，得到再生籼稻植株。
[0124]上述生根培养的条件为27°C静置光照培养(光照周期为16h光/8h暗、光照强度为20001x) 30 天。
[0125]三、pCAMBIA1300-PMI导入籼稻9311获得转基因籼稻方法中条件摸索
[0126]1、pCAMBIA1300-PMI导入籼稻9311获得转基因籼稻方法中不同抗生素浓度的摸索
[0127]籼稻9311相对其它品种农杆菌(EHA105)侵染共培养后抑菌较难，本研究进行了不同抗生素配比及浓度抑菌效果的比较，方法与上述二基本相同，不同的是下述:
[0128]共培养中采用的洗菌液中的抗生素及其终浓度分别为表1中的5种:200mg/L特美叮、500mg/L羧苄青霉素、250mg/L头孢霉素、250mg/L羧苄青霉素+lOOmg/L特美叮、200mg/L头孢霉素+200m g/L的特美汀；
[0129]恢复培养中采用 的恢复培养基中的抗生素及其终浓度分别为表1中的5种；
[0130]筛选培养中采用的筛选培养基中的抗生素及其终浓度分别为表1中的5种；
[0131]在每次获得转基因籼稻的方法中，洗菌液、恢复培养基和筛选培养基中采用的抗生素及浓度都一致。
[0132]筛选培养6天检测农杆菌生长的概率(长菌概率:长菌的愈伤组织数/受体胚愈伤组织数X 100%)，结果如表1所示，表中可以看出，在洗菌液和恢复培养基及筛选培养基中加200mg/L头孢霉素+200mg/L特美汀，可以对共培养后的籼稻9311愈伤组织洗菌后的农杆菌(EHA105)起到有效的抑制作用。
[0133]表1为籼稻9311愈伤组织筛选培养6天农杆菌生长的概率
【权利要求】
1.用于制备转基因植物的试剂盒，包括诱导培养基、感染液体培养基、共培养培养基、恢复培养基、筛选培养基、预分化培养基、分化培养基和生根培养基； 所述诱导培养基由CC液体基本培养基、终浓度为2mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸终浓度为20g/L麦芽糖和终浓度为3g/L植物凝胶组成； 所述感染液体培养基由终浓度为2950mg/L KC1、终浓度为150mg/L CaCl2.2H20、终浓度为 250mg/LMg04.7H20、终浓度为 150mg/LNaH2P04.H20、终浓度为 3mg/LH3B03、终浓度为 IOmg/LMnSO4.H20、终浓度为 0.025mg/LCoCl2.6H20、终浓度为 0.025mg/LCuS04.5H20、终浓度为 2mg/L ZnSO4.7H20、终浓度为 0.25mg/L NaMoO4.2H20、终浓度为 0.75mg/LK1、终浓度为 27.8mg/L FeSO4.7H20、终浓度为37.3mg/LNa2-EDTA.2H20、终浓度为0.4mg/L维生素B1、终浓度为.0.5mg/L维生素B6、终浓度为0.5mg/L烟酸、终浓度为100mg/L肌醇、终浓度为500mg/L水解酪蛋白、终浓度为68.5g/L蔗糖、终浓度为36g/L的葡萄糖、终浓度为176.7mg/L的L-精氨酸、终浓度为900mg/L的L-谷氨酰胺、终浓度为300mg/L的L-天冬氨酸、终浓度为20mg/L的乙酰丁香酮和水组成； 所述共培养培养基由CC液体基本培养基、终浓度为10g/L葡萄糖、终浓度为2mg/L2, 4- 二氯苯氧乙酸、终浓度为30g/L蔗糖、终浓度为3g/L植物凝胶和终浓度为20mg/L乙酰丁香酮组成； 所述恢复培养基由CC液体基本培养基、终浓度为2mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸、终浓度为20g/L麦芽糖、终浓度为3g/L植物凝胶、终浓度为0-200mg/L特美汀、终浓度为0_250mg/L头孢霉素组成， 所述筛选培养基由CC液体基本培养基、终浓度为2mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸、终浓度为5g/L蔗糖、终浓度为25g/L甘露糖、终浓度为3g/L植物凝胶、终浓度为0-200mg/L特美汀和终浓度为0_250mg/L头孢霉素组成； 所述预分化培养基由CC液体基本培养基、终浓度为2mg/L NAA、终浓度为lmg/L6_BA、终浓度为20g/L麦芽糖、终浓度为3g/L植物凝胶和终浓度为5mg/L ABA组成； 所述分化培养基由CC液体基本培养基B、终浓度为lmg/L NAA、终浓度为2mg/L6_BA、、终浓度为20g/L麦芽糖、终浓度为3g/L植物凝胶和终浓度为lmg/L KT组成； 所述生根培养基由终浓度为950mg/LKN03、终浓度为825mg/LNH4N03、终浓度为220mg/LCaCl2.2H20、终浓度为 185mg/LMg04.7H20、终浓度为 85mg/L KH2PO4' 终浓度为 6.2mg/LH3BO3、终浓度为 16.9mg/LMnS04.H20、终浓度为 0.025mg/LCoCl2.6H20、终浓度为 0.025mg/LCuSO4.5H20、终浓度为 8.6mg/L ZnSO4.7H20、终浓度为 0.25mg/L NaMoO4.2H20、终浓度为.0.83mg/L ΚΙ、终浓度为 27.8mg/L FeSO4.7H20、终浓度为 37.3mg/L Na2-EDTA.2H20、终浓度为.0.4mg/L维生素B1、终浓度为0.5mg/L维生素B6、终浓度为0.5mg/L烟酸、终浓度为IOOmg/L肌醇、终浓度为20g/L蔗糖、终浓度为0.5mg/L NAA、终浓度为3g/L植物凝胶和水组成；所述CC液体基本培养基B为将所述CC液体基本培养基中的36.34g/L甘露醇替换为.20g/L山梨醇； 每 IL 所述 CC 液体基本培养基由 1212mg KNO3>640mgNH4N03>588mg CaCl2.2H20、247mgMgO4.7H20、136mg KH2PO4Λ 27.8mg FeSO4.7H20、37.3mg Na2-EDTA.2H20、3.1mg H3BO3'11.15mgMnSO4.4H20、5.76mg ZnSO4.7H20、0.83mgK1、0.24mg NaMoO4.2H20、0.025mgCuS04.5H20、.0.028mg CoCl2.6H20、6mg 烟酸、8.5mg 维生素 BlUmg 维生素 B6、IOOmg 肌醇、300mg 水解酪蛋白、2.878g脯氨酸、500mg谷氨酰胺、36.43g甘露醇和水组成，用水补足体积。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括洗菌液；所述洗菌液由终浓度为0-200mg/L特美汀、终浓度为0-250mg/L头孢霉素和水组成。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于: 所述恢复培养基、所述筛选培养基和所述洗菌液中的特美汀和头孢霉素的终浓度均如下:终浓度为O或200mg/L特美汀、终浓度为O或200mg/L或250mg/L头孢霉素； 所述筛选培养基中的蔗糖和甘露糖的终浓度如下: 终浓度为15g/L蔗糖、终浓度为15g/L甘露糖； 或终浓度为15g/L蔗糖、终浓度为30g/L甘露糖； 或终浓度为5g/L蔗糖、终浓度为50g/L甘露糖； 或终浓度为5g/L蔗糖、终浓度为25g/L甘露糖。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于: 所述恢复培养基、所述筛选培养基和所述洗菌液中的特美汀和头孢霉素的终浓度均如下:终浓度为200mg/L特美汀、终浓度为200mg/L头孢霉素； 所述筛选培养基中的蔗糖和甘露糖的终浓度如下: 终浓度为5g/L蔗糖、终浓度 为25g/L甘露糖； 或终浓度为5g/L蔗糖、终浓度为50g/L甘露糖。
5.根据权利要求1-4所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中的培养基的pH值均为5.2 或 5.9 ; 所述植物为单子叶植物或双子叶植物； 所述单子叶植物具体为籼稻。
6.一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤: 1)制备转化用受体和侵染用重组农杆菌菌液: 所述制备转化用受体的方法包括如下步骤:先将植物种子去颖壳，再在权利要求1-5中所述试剂盒中的所述诱导培养基中进行诱导培养，得到发芽的种子愈伤组织；再将所述发芽的种子愈伤组织去除胚乳和芽，得到胚愈伤组织作为受体； 所述制备重组农杆菌菌液的方法包括如下步骤:先将含有外源基因的重组农杆菌悬浮在所述感染液体培养基中，得到侵染用重组农杆菌菌液； 2)将所述胚愈伤组织浸泡在所述侵染用重组农杆菌菌液中，得到侵染后愈伤组织； 3)将所述侵染后愈伤组织在所述共培养培养基中进行共培养，得到共培养愈伤组织； 4)将所述共培养愈伤组织在所述恢复培养基中进行恢复培养，得到恢复后愈伤组织； 5)将所述恢复后愈伤组织在所述筛选培养基进行筛选培养，得到抗性愈伤组织； 6)将所述抗性愈伤组织在所述预分化培养基上进行预分化培养，得到预分化培养后愈伤组织； 7)将所述预分化培养后愈伤组织在所述分化培养基上进行分化培养，得到分化培养后愈伤组织； 8)将所述分化培养后愈伤组织在所述生根培养基进行生根培养，即得到转基因植物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于: 步骤3)和步骤4)之间还包括如下步骤:将所述共培养愈伤组织用所述洗菌液洗涤。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于: 步骤I)中，所述诱导培养的条件为25-28°C暗培养7-10天，所述诱导培养的条件具体为27°C暗培养7天； 步骤2)中，所述侵染时间为15-25分钟，所述侵染时间具体为20分钟；； 步骤3)中，所述共培养的条件为21-26°C静置暗培养2-3天，所述共培养的条件具体为25 °C静置暗培养3天； 步骤4)中，所述恢复培养的条件为25-28°C静置暗培养3-5天，所述恢复培养的条件具体为27 °C静置暗培养3天； 步骤5)中，所述筛选培养为三次筛选培养，每次所述筛选培养的条件为25-28°C静置暗培养14-20天，每次所述筛选培养的条件具体为27°C静置暗培养15天； 步骤6)中所述预分化培养的条件为25-28°C静置光照培养14-20天，所述预分化培养的条件具体为27°C静置光照培养15天； 步骤7)中，所述分化培养的条件为25-28°C静置光照培养15-30天，所述分化培养的条件具体为27°C静置光照培养20天； 步骤8)中，所述生根培养的条件为25-28°C静置光照培养25-35天，所述生根培养的条件具体为24°C静置光照培养30天； 各步骤中的所述光照培养的光照周期为16h光/8h暗、光照强度为20001x。
9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于:所述外源基因为PMI基因，所述PMI基因的核苷酸序列为序列表中的序列I ;` 所述农杆菌为根瘤农杆菌EHA105。
10.根据权利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于:所述植物为单子叶植物或双子叶植物； 所述单子叶植物具体为籼稻。
【文档编号】A01H4/00GK103710381SQ201310717649
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月23日 优先权日:2013年12月23日
【发明者】付永彩, 侯晶晶, 李倩倩, 朱颖, 谭禄宾, 朱作峰, 刘凤霞, 才宏伟, 孙传清 申请人:中国农业大学