一种条斑紫菜种质固相保存方法
【专利摘要】本发明涉及一种条斑紫菜种质固相保存方法，包括：在无菌操作台内，将条斑紫菜的藻球1个～2个，插入保存管内的保存基斜面下1cm～1.5cm处，然后加入保存液1ml～1.5ml；保存管加盖，用封口胶封口，编号；保存管插入保存架，保存架置于保存箱内；保存管理。本发明进行了专门的系统的研究，形成了成熟的条斑紫菜种质一级固相保存技术方法，为紫菜种质资源的保存提供了一种科学的规范的操作方法；且方法简单，成本低，保存效果好。
【专利说明】一种条斑紫菜种质固相保存方法
【技术领域】
[0001]本发明属于种质保存领域，特别涉及一种条斑紫菜种质固相保存方法。
【背景技术】
[0002]条斑紫菜具有叶状体和丝状体两个异型世代，丝状体在贝壳等基质中萌发、生长、发育称贝壳丝状体，丝状体在培养液中悬浮称为自由丝状体。条斑紫菜自由丝状体在人为控制的条件下，能长期保持不生长和不发育的状态，因此可以把条斑紫菜自由丝状体作为种质长期保存。但迄今为止未见报导比较可靠的方法，目前基本采用的条斑紫菜种质保存方法是将得到的条斑紫菜种质于广口瓶等容器中，无控温、控光及其它技术的系统管理，特别是至今未见有关紫菜种质固相保存方法报导，专利 申请人:从2000年开始进行了专门研究，不断总结改进，形成了成熟的紫菜种质一级固相保存方法，紫菜种质一级固相保存方法不仅能使种质长期保持不生长发育，且不易受其它杂藻和病菌污染。特别是3年继代保存，大大减少了保存管理中工作量，是一种高效、防污染能力强的好方法。目前一级固相保存条斑紫菜种质800多品系，种质状态良好。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供一种条斑紫菜种质固相保存方法，该保存方法科学实用，可操作性强；保存中能有限防止细菌、杂藻的污染，使紫菜种质更加安全。
[0004]本发明的一种条斑紫菜种质固相保存方法，包括:
[0005]在无菌操作台内，将条斑紫菜的种质藻球I个~2个，插入保存管内的保存基斜面下Icm~1.5cm处，然后加入保存液Iml~1.5ml ;保存管加盖，用封口胶封口，编号；保存管插入保存架，保存架置于保存箱内；保存管理。
[0006]所述无菌操作台内需控制温度3 °C~5 °C。
[0007]所述条斑紫菜的种质藻球为条斑紫菜自由丝状体形成的纯净藻球。
[0008]所述保存管为IOml玻璃试管。玻璃试管用盐酸浸泡后，清洗干净并烘干，在高温灭菌锅消毒。
[0009]所述保存基，为固相琼脂培养基，并为斜面，琼脂培养基琼脂含量为1.0%~1.5%。所述固相琼脂培养基的制备方法:1000ml消毒海水中加入加琼脂粉10~15g，加温充分溶解、并煮沸5分钟，制成含1.0%~1.5%琼脂培养液，然后用移液管将5ml琼脂培养液移入IOml玻璃试管中，试管倾斜30度，冷却(5~10°C)，制成固体斜面培养基，加盖，固相琼脂
培养基即得。
[0010]所述保存液为消毒海水1000ml中加入PES营养母液5ml配制而成。
[0011]保存液配制:黑 暗沉淀40天的自然海水，加淡水调制到比重为1.018海水(20°C )，200目筛絹双层过滤，然后调制海水盛入5000ml锥形玻璃烧瓶中，加温至100°C，煮沸8分钟~10分钟，冷却后，1000ml消毒海水中加PES营养母液5ml充分混均，瓶口用保鲜膜密封待用，即得。[0012]所述PES营养母液盐配制:PES营养母液由I液和II液混合配制而成，I液和II液均用蒸懼水配制。I液配制，6种溶液分别配制，NaNO3溶液配制,35g NaNO3加入到100mL蒸懼水中，完全溶解，即得，配制同法，β -甘油磷酸钠(Na2glycerophosphate) 5g/100ml,VBulmg/lOOmlJBJmg/lOOml，生物素(VH) 0.5mg/100ml,，缓血酸铵(Tris buffer 三羟甲基氨基甲烷)500mg/100ml。II液配制，在1000ml蒸馏水中，加入Na2EDTAl.45g完全溶解后，依次加入 CoSO4.7Η204.8mg、ZnSO4.7H2022mg、MnSO4.4H20164mg、FeSO4.7H20500mg、FeCl3.6H2049mg、H3BO3L 14g，全部完全溶解(为了完全溶解，加热至50°C左右)。I液和II液配制完成，静置24h小时后，在II液250ml+ I液各10ml，混均，PES营养母液即得。
[0013]所述保存箱为低温食品保存箱，封闭式，能够调节和控制温度，光照等。
[0014]所述保存管理:保存箱内温度为5°C~8°C、光照强度为80Lx~lOOLx、光周期为12L:12D,防止污染等，一年更换一次保存液，三年继代保存。
_5] 有益.效果
[0016](I)本发明形成了成熟的条斑紫菜种质一级固相保存技术方法，为紫菜种质资源的管理提供了科学的规范的操作方法；
[0017](2)本发明保存技术方法科学实用，可操作性强；
[0018](3)本发明保存中能有效防止细菌、杂藻的污染，使紫菜种质更加安全；
[0019](4)本发明保存过程对环境友好，对环境无污染与危害。 【具体实施方式】
[0020]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0021]实施例1
[0022]琼脂保存基配制:1000ml消毒海水加入加琼脂粉12g，加温充分溶解、并煮沸5分钟，制成含1.2%琼脂培养液；然后用移液管将5ml琼脂培养液移入IOml玻璃试管中，试管倾斜30度，冷却(5~10°C)，制成固体斜面培养基，玻璃试管加盖，固相保存基即得。
[0023]保存液配制:黑暗沉淀40天的自然海水，加淡水调制到比重为1.018海水(20°C ),200目筛絹双层过滤，用5000ml锥形玻璃烧瓶盛调制海水，加温至100°C，煮沸8分钟~10分钟，冷却后，1000rnl消毒海水中加PES营养母液5ppm，保鲜膜封口，即得。
[0024]PES营养母液盐配制:PES营养母液由I液和II液混合配制而成，I液和II液均用蒸懼水配制。I液配制，6种溶液分别配制，NaNO3溶液配制，35g NaNO3加入到100ml蒸懼水中，完全溶解，即得，配制同法，β -甘油磷酸钠(Na2glycerophosphate) 5g/100ml,VBulmg/lOOmlJBJmg/lOOml，生物素(VH) 0.5mg/100ml,，缓血酸铵(Tris buffer 三羟甲基氨基甲烷)500mg/100ml。II液配制，在1000ml蒸馏水中，加入Na2EDTAl.45g完全溶解后，依次加入 CoSO4.7Η204.8mg、ZnSO4.7H2022mg、MnSO4.4H20164mg、FeSO4.7H20500mg、FeCl3.6H2049mg、H3BO3L 14g，全部完全溶解(为了完全溶解，加热至50°C左右)。I液和II液配制完成，静置24h小时后，在II液250ml+ I液各10ml，混均，PES营养母液即得。
[0025]进入保存系统操作:无菌操作台内控制温度3°C左右，将2个条斑紫菜的种质小藻球插入保存管内琼脂保存基斜面下Icm处，加保存液1ml，保存管加盖，进口封口带封口，编号，保存管插于保存架，放置于保存箱内。
[0026]上述的保存管:10ml玻璃试管用盐酸浸泡后，清洗干净并烘干，在高温灭菌锅消毒。
[0027]上述工具:使用前放在开水中煮沸灭菌10分钟。
[0028] 保存管理:保存箱内控制温度5°C~8°C、光照强度80Lx~lOOLx、光周期为12L:12D。防止污染等。正常情况一年更换一次保存液，三年继代保存。
【权利要求】
1.一种条斑紫菜种质固相保存方法，包括: 在无菌操作台内，将条斑紫菜的种质藻球I个~2个，插入保存管内的保存基斜面下Icm~1.5cm处，然后加入保存液Iml~1.5ml，加盖，封口，保存管编号，保存管插入保存架，保存架置于保存箱内，保存管理。
2.根据权利要求1所述的一种条斑紫菜种质固相保存方法，其特征在于:所述无菌操作台内需控制温度3 °C~5 °C。
3.根据权利要求1所述的一种条斑紫菜种质固相保存方法，其特征在于:所述条斑紫菜的种质藻球为条斑紫菜纯净自由丝状体形成的藻球。
4.根据权利要求1所述的一种条斑紫菜种质固相保存方法，其特征在于:所述保存管为IOml玻璃试管,玻璃试管用盐酸浸泡后,清洗,烘干,高温灭菌锅内消毒。
5.根据权利要求1所述的一种条斑紫菜种质固相保存方法，其特征在于:所述保存基为固相琼脂培养基，并为斜面，琼脂培养基琼脂含量为1.0%~1.5%。
6.根据权利要求5所述的一种条斑紫菜种质固相保存方法，其特征在于:所述固相琼脂培养基的制备方法为=1000mL消毒海水中加入琼脂粉10~15g，溶解，沸腾，制成含1.0%~1.5%琼脂培养液 ，然后移入保存管中，5~10°C冷却，并形成斜面，得到固相琼脂培养基。
7.根据权利要求1所述的一种条斑紫菜种质固相保存方法，其特征在于:所述保存管理保存液为消毒海水1000ml中加入PES营养母液10ml。
8.根据权利要求1所述的一种条斑紫菜种质固相保存方法，其特征在于:所述保存管理控制温度为5°C~8°C、光照强度为80Lx~lOOLx、光周期为12L: 12D，一年更换一次保存液，三年继代保存。
【文档编号】A01H4/00GK103907533SQ201410127576
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年3月31日 优先权日:2014年3月31日
【发明者】陈国耀, 朱建一, 陆勤勤, 张美如, 周伟, 胡传明, 许广平, 丁亚平, 朱庙先 申请人:江苏省海洋水产研究所