一种高稳定性饲用液体复合酶的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种高稳定性饲用液体复合酶的制备工艺，首先利用液体深层工业发酵方法产出发酵液，然后分别对单酶进行精制与纯化，制成的均一、稳定、澄清、透明的单酶液可长时间保存，待需要时根据需求将单酶进行任意比例的复配得到稳定的成品酶液。本发明采用先制备稳定的单酶液待需要时进行任意比例的复配的方法，工艺先进，设备简单，操作灵活，复配前的单酶液纯度高稳定性好，可进行长时间的储存，复配后的成品酶稳定性极高，酶液中的蛋白性质接近，解决了现有工艺生产中设备和材料投入成本高、成品酶稳定性低、极易发生沉淀、易受杂质酶影响导致贮存期间酶活大量损失及不能灵活进行任意比例的复配的问题。
【专利说明】一种高稳定性饲用液体复合酶的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种高纯度高稳定性饲用液体复合酶的制备方法。
【背景技术】
[0002]酶是一种活性蛋白质，对外部环境很敏感，在高温、高压下极易变性失活，目前，外援酶在家禽家畜饲料中的添加应用发展较快，现有加酶饲料中颗粒饲料占有较大比重。在颗粒饲料的生产过程中，需要在高温高压蒸汽下调制后挤压制粒之后进入冷却系统，颗粒进入冷却系统之前的料温可达到78~90°C，高温导致饲料自身的内源酶和外添加酶的活性受到不同程度的损失。为降低酶活损失，通常采用酶的稳定化技术和后喷涂技术，后喷涂技术作为一项新型的饲料加工工艺，可以有效的保护酶以及和酶性质相似的热敏性组分的有效性。因此，利用液体酶进行的后喷涂技术得到良好的推广应用，液体酶的制备成为现有研究热点。[0003]传统液体复合酶的制备技术中一般采用固体发酵法，将固体发酵曲料经传统常规工艺进行压榨过滤后，对得到的滤清液进行简单处理即作为液体复合酶成品，由于各酶种的生产工艺、生产条件及菌种差异等极易产生沉淀，复合酶稳定性较低，使用这种液体复合酶制剂进行喷涂时，不仅会导致喷雾系统堵塞，损坏喷涂设备，而且还对自动化生产造成不便；同时，一般先将单酶混合后再进行简单纯化，提纯工艺简单，杂质酶无法去除，且单酶的比例不易控制，不能灵活按照需要进行任意比例的复配。
【发明内容】
[0004]本发明目的在于提供一种高稳定性饲用液体复合酶的制备方法，解决现有饲用液体复合酶制备中采用固体发酵法得到发酵曲料、由曲料得到滤清液的处理过程简单原始、成品复合酶稳定性较低易沉淀、使用时易导致喷雾系统堵塞损坏喷涂设备、不仅对自动化生产造成不便还造成酶活浪费的问题；还解决现有多种单酶混合后再处理的工艺制作过程中成品酶的酶种组成配比不可调节、生产和贮存期间酶活大量损失的问题；还解决现有技术设备和材料投入成本高的技术问题。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下:
一种高稳定性饲用液体复合酶的制备方法，其特征在于具体包括下列步骤:
A、选用高产单酶的工程菌株，进行大规模液体深层工业发酵，产出单酶含量较高的发酵液；
B、将液体发酵产出的单酶发酵液过碟片离心机，得到单酶清液；
C、将单酶清液过陶瓷膜，截留残留菌体以及比酶分子大的颗粒，收集清液得到单酶陶清液；
D、将单酶陶清液过有机膜，截留酶分子，排出小分子的杂蛋白、无机盐和一部分水，同时使酶液浓缩，得到单酶浓缩酶液；E、在所得单酶浓缩酶液中加离子水进行稀释，得到单酶稀释酶液；
F、在所得到的单酶稀释酶液中加入沉降剂、稳定剂和防腐剂，并调节pH至4.4~5.5，置于玻璃钢罐体中进行自然沉降；
G、通过玻璃钢罐体侧壁上的清液放料口取出沉降好的单酶清液；
H、按照步骤A~G的方法制备其他单酶清液；
1、在去离子水中加入稳定剂、防腐剂，并调节pH至4.4~5.5，得到稀释液；
J、将步骤H中沉降好的多种单酶清液和步骤I中制备的稀释液进行均匀混合，至此，液体复合酶制备完成。
[0006]作为本发明的优选技术方案，本专利中提到的酶种范围即所述步骤A或H中的单酶为NSP (非淀粉多糖)单酶，如木聚糖酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶等，也可为植酸酶。[0007]作为本发明的优选技术方案，所述步骤C中陶瓷膜的孔径范围为0.05~0.1 μ m。
[0008]作为本发明的进一步优选技术方案，所述步骤D中有机膜截留小分子的分子量为8000 ~10000。
[0009]作为本发明的进一步优选技术方案，所述步骤E中稀释酶液的最终稀释浓度为:纤维素酶3000~5000U/g，其余单酶的酶活3~5万U/g。
[0010]作为本发明的进一步优选技术方案，所述步骤F中的沉降剂为十二水合硫酸铝钾、硫酸锌，其重量比为稀释酶液:十二水合硫酸铝钾:硫酸锌=100:0.5~0.6:0.3~0.5。
[0011]作为本发明的进一步优选技术方案，所述步骤F中的稳定剂为山梨糖醇、葡萄糖、硫酸镁和乙酸钠，其重量比为稀释酶液:山梨糖醇:葡萄糖:硫酸镁:乙酸钠=100:8~12:3 ~6:0.8 ~1.3:3 ~6。
[0012]进一步的，所述步骤F中的防腐剂为苯甲酸钠、山梨酸钾、卡松和氯化钠，其重量比为稀释酶液:苯甲酸钠:山梨酸钾:卡松:氯化钠=100:0.1~0.25:0.4~
0.6:0.15-0.25:10 ~14。
[0013]作为本发明的进一步优选技术方案，所述步骤I中的稳定剂为山梨糖醇、葡萄糖、硫酸镁和乙酸钠，其重量比为去离子水:山梨糖醇:葡萄糖:硫酸镁:乙酸钠=100:8~12:3 ~6:0.8 ~1.3:3 ~6。
[0014]进一步的，所述步骤I中的防腐剂为苯甲酸钠、山梨酸钾、卡松和氯化钠，其重量比为去离子水:苯甲酸钠:山梨酸钾:卡松:氯化钠=100:0.1~0.25:0.4~0.6:0.15~
0.25:10 ~14。
[0015]作为本发明的进一步优选技术方案，所述步骤J中的单酶清液与稀释液的混合比例根据实际酶活需要自行配比。
[0016]与现有技术相比，本发明提供了一种高稳定性饲用液体复合酶的制备方法，首先进行单酶的精制与稳定化处理，然后创造稳定的复配环境将单酶进行任意比例的复配，本发明的技术优势在于:
1、先进的分离和多层截留工艺
具体为利用液体深层工业发酵方法产出发酵液，经过离心机离心去除大部分的菌体和发酵所产生的固体残渣，离心后的清液在按顺序过陶瓷膜和有机膜，陶瓷膜是截留较大颗粒物质，有机膜是截留酶分子相近的颗粒，排除小颗粒物质和水。经过双向截留，清液中都是和酶分子相近的蛋白，这样不仅去除了大量杂蛋白、无机盐等一些杂质，而且起到了浓缩酶液的作用，同时，该步骤也使不同种类酶液中的蛋白分子特性更相近，为复合酶的稳定性提供了必要条件。
[0017]2、优势的稳定化配方
本发明采用专用的添加剂配方，具体优势分别解析如下:
沉降剂:沉降剂中十二水硫酸铝钾在水中水解出氢氧化铝胶体，胶体粒子带有正电荷，会和一些带负点的粒子电荷中和形成胶粒，胶粒可以吸附悬浮的不稳定颗粒，从而体积变大，最终沉入水底，此外在弱酸环境中硫酸铝钾的水解受到一定的抑制作用，使得沉降更温和，作用周期更长，并在整个沉降周期中逐步耗尽，硫酸锌中锌离子可以和NSP酶类进行特异性结合使之带微弱的正电荷，在沉降过程中起到保护酶的作用；
稳定剂:稳定剂配方中山梨糖醇和葡萄糖会少量增加液体粘度，增加酶液钝性从而缓解外接环境变化对酶液的影响，硫酸镁中的镁离子可以对NSP酶类的酶活具有激活作用，乙酸钠为pH稳定剂；
防腐剂:整个工艺并没有在无菌条件下进行，不可避免混入空气中的菌类。防腐剂中苯甲酸钠、山梨酸钾、卡松和氯化钠的联合应用和最优配比使得防腐剂的抗菌谱更广。
[0018]此外，酶是一种蛋白质具有等电点，当酶液pH由于某些因素造成pH变化，达到某种酶的等电点，就会出现酶凝聚沉淀的现象，所以稳定酶液PH也是重要的环节。 [0019]本发明通过以上的沉降防腐的稳定化技术，使得酶液中的蛋白质酶学性质更相似，从而达到均一、稳定、澄清、透明的、可在后期复配过程中根据实际酶活需要进行任意比例配制的高稳定性饲用液体复合酶。
[0020]3、设备和材料投入成本低
本发明中所涉及的设备和原料均为市场上容易采购的常规廉价产品，使得液体复合酶的生产投入和成本大大降低。
[0021]4、可灵活进行复配
在需要液体复合酶时，可在短时间内把处理好的多种单酶清液按比例复配即可，产品的酶种配比更灵活，生产快速、便捷。
[0022]5、成品稳定性高
本发明制备方法采用单酶单独处理的方式，单酶处理后可存放2年，液体仍然澄清透明，酶活损失在15%以下；生产出的液体复合酶，在保质期6个月内无沉淀或仅有微量沉淀，酶活损失控制在10%以内。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1是本发明高稳定性饲用液体复合酶的制备流程图。
【具体实施方式】
[0024]下面结合四个具体实施例对本
【发明内容】
进行进一步的说明。以下实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。本发明所涉及的设备均为本行业常用设备，包括碟片离心机、陶瓷膜、有机膜以及玻璃钢罐。所用的酶活检测方法为本行业常用方法，所用原料为饲用级或食品级，所用菌种为行业内常用液体发酵单酶菌种，其所产出的单酶分别为木聚糖酶、纤维素酶、植酸酶、甘露聚糖酶等。
[0025]实施例一
1、如图1所示，按照制备流程，选用高产单酶的工程菌株进行大规模液体深层工业发酵，液体深层发酵技术为现有成熟技术，此处不再赘述，得到的单酶深层液体发酵的发酵液包括木聚糖酶发酵液、甘露聚糖酶发酵液、纤维素酶发酵液分别过碟片离心机，得到清液过0.10 μ m孔径陶瓷膜，取陶清液过I万分子量孔径有机膜浓缩，木聚糖酶浓缩酶液加去离子水稀释至50000U/g，甘露聚糖酶浓缩酶液加去离子水稀释至50000U/g，纤维素酶浓缩酶液加去离子水稀释至3000U/g。
[0026]2、在稀释好的酶液中分别按比例加入沉降剂、稳定剂、防腐剂，具体比例为稀释酶液:十二水合硫酸铝钾:硫酸锌:山梨糖醇:葡萄糖:硫酸镁:乙酸钠:苯甲酸钠:山梨酸钾:卡松:氯化钠=100:0.5:0.4:12:5:1.2:5:0.2:0.6:0.2:14搅拌均匀后，置于玻璃钢罐内沉降5~7天，从清液放料口放出清液备用。
[0027]3、在去离子水中加入稳定剂、防腐剂，具体比例为去离子水:山梨糖醇:葡萄糖:硫酸镁:乙酸钠:苯甲酸钠:山梨酸钾:卡松:氯化钠=100:12:5:1.2:5:0.2:0.6:0.2:14搅拌均匀后，备用。
[0028]4、配制液体复合酶1000 kg，在成品混合罐中加入沉降后的木聚糖酶液201 kg，甘露聚糖酶液48 kg,纤维素酶200 kg,稀释液551kg,混合均匀后即得液体复合酶成品，经检测，木聚糖酶11055U/ml，甘露聚糖酶2440U/ml，纤维素酶65 lU/ml。
[0029]实施例二
工艺方法同实施例一，配制含木聚糖酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、植酸酶的四种酶的液体复合酶1000 kg，在成品混合罐中加入沉降后的木聚糖酶液201 kg，甘露聚糖酶液48 kg,纤维素酶333.3 1^，植酸酶100此，稀释液317.7 kg，混合均匀后即得液体复合酶成品，经检测，木聚糖酶11834U/ml，甘露聚糖酶2406U/ml，纤维素酶1024U/ml，植酸酶5437U/ml。
[0030]实施例三
为了证明本发明制备出的液体复合酶的稳定性，快速评价其在长期贮存以及运输过程中的稳定性，本实施例利用化学动力学来量化外来因素如温度、湿度、压力、光照等对质变反应的影响，通过控制产品处于一个或多个外在因素高于正常水平的环境中，引起质变的速度加速较短时间内即可判定产品是否变质。振荡和温度通常为产品质量衰退的重要因素。采购市场上的液体复合酶和本发明制作的液体复合酶进行加速实验对比，具体实验如下:
把100mL液体复合酶装入500ml的三角瓶中，封住瓶口，置于恒温摇床中，设定温度为45°C，回旋频率为200rpm，时间24h，检测实验前后样品的酶活水平以及吸光值(546nm)的变化情况，其中，复合酶a为本发明实例一中生产的批次样品，复合酶b、c、d为在市场上采购的其他复合酶产品，数据见表1:
【权利要求】
1.一种高稳定性饲用液体复合酶的制备方法，其特征在于具体包括下列步骤: 选用高产单酶菌株进行大规模液体深层工业发酵，产出单酶含量较高的发酵液； 将步骤A液体发酵产出的发酵液过碟片离心机，得到单酶的酶清液； 将单酶的酶清液过陶瓷膜，截留残留菌体和比酶分子大的颗粒，收集清液得到单酶陶清液； 将单酶陶清液过有机膜，截留酶分子，排出小分子的杂蛋白、无机盐和部分水，使酶液浓缩，得到单酶浓缩酶液； 在所得单酶浓缩酶液中加去离子水进行稀释，得到单酶的稀释酶液； 在所得单酶的稀释酶液中加入沉降剂、稳定剂和防腐剂，并调节pH至4.4~5.5，置于玻璃钢罐体中进行自然沉降； 通过玻璃钢罐体侧壁上的清液放料口取出沉降好的单酶清液，放置备用； 按照步骤A~G的方法制备出生产饲用液体复合酶所需要的几种单酶清液； 在去离子水中加入稳定剂、防腐剂，并调节pH至4.4~5.5，得到稀释液； 将步骤H中沉降好的多种单酶清液和步骤I中制备的稀释液进行均匀混合，单酶清液与稀释液的混合比例根据实际酶活和酶种类的需要进行配比，至此，液体复合酶制备完成。
2.根据权利要求1所述的一种高稳定性饲用液体复合酶的制备方法，其特征在于:所述步骤A或H中的单酶为非淀粉多糖单酶或植酸酶。
3.根据权利要求2所述的一种高稳定性饲用液体复合酶的制备方法，其特征在于:所述步骤C中陶瓷膜的孔径范围为0.05~0.1 μ m。
4.根据权利要求2所述的一种高稳定性饲用液体复合酶的制备方法，其特征在于:所述步骤D中有机膜截留小分子的分子量为8000~10000。
5.根据权利要求2所述的一种高稳定性饲用液体复合酶的制备方法，其特征在于:所述步骤E中稀释酶液的最终稀释浓度为:纤维素酶3000~5000U/g，其他种类单酶的酶活为3~5万U/g。
6.根据权利要求1所述的一种高稳定性饲用液体复合酶的制备方法，其特征在于:所述步骤F中的沉降剂为十二水合硫酸铝钾、硫酸锌，其添加量为重量比稀释酶液:十二水合硫酸铝钾:硫酸锌=100:0.5~0.6:0.3~0.5。
7.根据权利要求1所述的一种高稳定性饲用液体复合酶的制备方法，其特征在于:所述步骤F中的稳定剂为山梨糖醇、葡萄糖、硫酸镁和乙酸钠，其添加量为重量比稀释酶液:山梨糖醇:葡萄糖:硫酸镁:乙酸钠=100:8~12:3~6:0.8~1.3:3~6。
8.根据权利要求1所述的一种高稳定性饲用液体复合酶的制备方法，其特征在于:所述步骤F中的防腐剂为苯甲酸钠、山梨酸钾、卡松和氯化钠，其添加量为重量比稀释酶液:苯甲酸钠:山梨酸钾:卡松:氯化钠=100:0.1~0.25:0.4~0.6:0.15-0.25:10~14。
9.根据权利要求1所述的一种高稳定性饲用液体复合酶的制备方法，其特征在于:所述步骤I中的稳定剂为山梨糖醇、葡萄糖、硫酸镁和乙酸钠，其添加量为重量比去离子水:山梨糖醇:葡萄糖:硫酸镁:乙酸钠=100:8~12:3~6:0.8~1.3:3~6。
10.根据权利要求1~9所述的一种高稳定性饲用液体复合酶的制备方法，其特征在于:所述步骤I中的防腐剂为苯甲酸钠、山梨酸钾、卡松和氯化钠，其添加量为重量比去离子水:苯甲酸钠:山梨酸钾:卡松:氯化钠=100:0.1~0.25:0.4~0.6:0.15~0.25:10~14。
【文档编号】A23K1/165GK103898084SQ201410165030
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月23日 优先权日:2014年4月23日
【发明者】赵丽芳, 苏俊兵, 蔡晓龙 申请人:北京昕大洋科技发展有限公司