可可茶子叶愈伤组织培养方法
【专利摘要】可可茶的子叶诱导愈伤组织培养方法采用可可茶子叶为外植体，在SH、MS基本培养基中加入蔗糖、琼脂粉、2，4-二氯苯氧乙酸、苄基嘌呤、吲哚乙酸等的培养基中组织培养，得到可可茶愈伤组织。采用本发明组织培养方法以及使用的培养基可用于可可茶愈伤组织的培养。pH全部调为5.6，配制好的诱导愈伤组织培养基分装在培养瓶中，每瓶25ml，盖好瓶盖，在压力为0.1-0.15MPa下灭菌25分钟，将培养瓶置于22-26℃、光照强度为2000-30001x的温室中培养，每天光照12-14小时，培养98天后，转入2号培养基中继续培养诱导，培养7天后，转入3号培养基中继续培养诱导，培养35天后，长出胚状芽，继续培养至长出叶片、成苗。
【专利说明】可可茶子叶愈伤组织培养方法 1.
【技术领域】
[0001] 本发明介绍一种茶树的子叶诱导愈伤组织培养方法，尤其是可可茶的子叶诱导愈 伤组织培养方法。 2.
【背景技术】
[0002] 可可茶（Camellia ptilopyhlla Chang)是在广东省境内发现的我国独有的野生 茶树植物资源。传统的饮用茶都以咖啡碱为主，并含有微量的可可碱和茶叶碱，而可可茶主 要特征是以可可碱含量为主而不含咖啡碱，可可碱含量可高达6. 8% ;另外茶多酚的含量比 一般茶类植物高。可可碱在生理和药理方面具有特殊的效果，其急性降压作用缓和，没有兴 奋神经作用，有助于睡眠，具有强心作用，可提高机体动态耐力，能抗脂质过氧化及延缓机 体衰老，同时能降低胆固醇和血脂，因此可可茶在保健功能上优于含有较多咖啡碱的传统 茶叶，市场前景广阔。
[0003] 可可茶为野生植物，由于它的成分独特、资源较少、分布范围很狭窄，因此对它的 繁殖研究具有重要的意义。目前已有移栽、扦插、嫁接、愈伤诱导等研究，但文献极少，专利 更少（仅有可可茶嫁接普洱茶的获准专利，但砧木和接穗的限制导致此法无法实现快速大 量繁殖）。对它的组织培养的研究，叶创兴等已成功地从可可茶的胚和茎段诱导成苗；朱念 德等报道了由成熟种子带极小部分子叶的胚诱导成苗。但这些研究并没有实现应用，目前 仍然没有实现可可茶快速、大量繁殖的技术。
[0004] 为了克服现有的自然繁殖率低及目前已有的各种繁殖技术对可可茶种苗繁殖的 限制，本发明提供一种新的快速繁殖方法。 3.
【发明内容】
[0005] 本发明采用野生可可茶子叶，克服了上述可可茶愈伤组织培养方法的缺乏和缺 点，提供一种可可茶新的愈伤组织培养方法以及适应该方法所用的培养基。
[0006] 4技术方案
[0007] 解决上述技术问题所采用的技术方案是它包括如下步骤：
[0008] (1)外植体制备
[0009] 材料消毒：将剥去种皮的种子置于50 %漂白粉溶液中浸泡lOmin，用灭菌的ddH20 冲洗3-5次，每次5分钟，在超净工作台上用灭菌的吸水纸吸干种子表面的水液，把胚挑出， 将每一个子叶切成50mm 2小块；
[0010] (2)愈伤组织诱导
[0011] 将（1)处理好的可可茶子叶小块接入诱导愈伤组织1号培养基中诱导愈伤组织， 该诱导愈伤组织培养基为在1升SH基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
[0012] 蔗糖 20_40g
[0013] 琼脂粉 5.5_7.2g
[0014] 2,4-二氯苯氧乙酸 1.0-3. Omg
[0015] pH为5. 6,配制好的诱导愈伤组织培养基分装在培养瓶中，每瓶25ml，盖好瓶盖， 在压力为0. l-o. 15MPa下灭菌25分钟，将培养瓶置于22-26°C、光照强度为2000-30001X的 温室中培养，每天光照12-14小时，培养98天后，转入2号培养基中继续培养诱导，该诱导 愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
[0016] 蔗糖 20-40g 琼脂粉 5.5-7.2g 2，4-二氯苯氧乙酸 O.l-l.Omg 苄基嘌呤（BA) 0.5-3.0 mg
[0017] pH为5. 6,配制好的诱导愈伤组织培养基分装在培养瓶中，每瓶25ml，盖好瓶盖， 在压力为0. 1-0. 15MPa下灭菌25分钟，将培养瓶置于22-26°C、光照强度为2000-30001x的 温室中培养，每天光照12-14小时，培养7天后，转入3号培养基中继续培养诱导，该诱导愈 伤组织培养基为在1升SH基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
[0018] 蔗糖 15-35g 琼脂粉 5.5-7.2g 苄基嘌呤（BA) 0.5-3.0 mg 吲哚乙酸（IBA) 0.1-0.5mg
[0019] pH为5. 6,配制好的诱导愈伤组织培养基分装在培养瓶中，每瓶25ml，盖好瓶盖， 在压力为0. l-o. 15MPa下灭菌25分钟，将培养瓶置于22-26°C、光照强度为2000-30001X的 温室中培养，每天光照12-14小时，培养35天后，长出胚状芽，继续培养至叶片长出、成苗及 愈伤组织褐化。
[0020] 本发明培养方法中所用的优选诱导可可茶愈伤组织培养基1号、2号、3号分别为 在1升SH、MS、SH基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
[0021] 1号培养基
[0022] 蔗糖 25_35g
[0023] 琼脂粉 5. 8-6. 8g
[0024] 2,4_ 二氯苯氧乙酸 1.5-2. 5mg
[0025] 2号培养基
[0026] 蔗糖 25-35g 琼脂粉 5.8-6.8g 2，4-二氯苯氧乙酸 0.2-1.8mg 苄基嘌呤（BA) 0.8-2.0mg
[0027] 3号培养基
[0028] 蔗糖 20-30g 琼脂粉 5.8-6.8g 苄基嘌呤（BA) 1.5-2.5mg 吲哚乙酸（IBA) 0.1-0.3mg
[0029] 本发明培养方法中所用的最佳诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加 入下述的原料及其配比制成：
[0030] 1号培养基
[0031] 蔗糖 30g
[0032] 琼脂粉 6. 5g
[0033] 2,4-二氯苯氧乙酸 2. Omg
[0034] 2号培养基
[0035] 蔗糖 30g 琼脂粉 6.5g 2, 4-二氯苯氧乙酸 0.5mg 苄基嘌呤（BA) l.Omg
[0036] 3号培养基
[0037] 蔗糖 25g 琼脂粉 6.5g 苄基嘌呤（BA) 2.0mg 吲哚乙酸（IBA) 0.2mg
[0038] 本发明培养方法采用可可茶子叶为外植体，在SH、MS基本培养基中加入蔗糖、琼 脂粉、2,4_二氯苯氧乙酸、苄基嘌呤、吲哚乙酸等的培养基中组织培养，得到可可茶愈伤组 织。采用本发明组织培养方法以及使用的培养基可用于可可茶愈伤组织的培养。 4【具体实施方式】
[0039] 实施例1 :
[0040] (1)外植体制备
[0041] 材料消毒：将剥去种皮的种子置于50 %漂白粉溶液中浸泡lOmin，用灭菌的ddH20 冲洗3-5次，每次5分钟，在超净工作台上用灭菌的吸水纸吸干种子表面的水液，把胚挑出， 将每一个子叶切成50mm 2小块；
[0042] (2)愈伤组织诱导
[0043] 将（1)处理好的可可茶子叶小块接入诱导愈伤组织1号培养基中诱导愈伤组织， 该诱导愈伤组织培养基为在1升SH基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
[0044] 蔗糖 30g
[0045] 琼脂粉 6. 5g
[0046] 2,4_ 二氯苯氧乙酸 2.0mg
[0047] pH为5. 6,配制好的诱导愈伤组织培养基分装在培养瓶中，每瓶25ml，盖好瓶盖， 在压力为0. l-o. 15MPa下灭菌25分钟，将培养瓶置于22-26°C、光照强度为2000-30001X的 温室中培养，每天光照12-14小时，培养98天后，转入2号培养基中继续培养诱导，该诱导 愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
[0048] 蔗糖 30g 琼脂粉 6.5g 2，4-二氯苯氧乙酸 0.5mg 苄基嘌呤（BA) l.Omg
[0049] pH为5. 6,配制好的诱导愈伤组织培养基分装在培养瓶中，每瓶25ml，盖好瓶盖， 在压力为0. l-o. 15MPa下灭菌25分钟，将培养瓶置于22-26°C、光照强度为2000-30001X的 温室中培养，每天光照12-14小时，培养7天后，转入3号培养基中继续培养诱导，该诱导愈 伤组织培养基为在1升SH基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：
[0050] 蔗糖 25g 琼脂粉 6.5g 苄基嘌呤（BA) 2.0mg 吲哚乙酸（IBA) 0.2mg
[0051] pH为5. 6,配制好的诱导愈伤组织培养基分装在培养瓶中，每瓶25ml，盖好瓶盖，
【权利要求】
1. 可可茶子叶愈伤组织培养方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 外植体制备 材料消毒：将剥去种皮的种子置于50%漂白粉溶液中浸泡lOmin，用灭菌的ddH20冲洗 3-5次，每次5分钟，在超净工作台上用灭菌的吸水纸吸干种子表面的水液，把胚挑出，将每 一个子叶切成50mm2小块； (2) 愈伤组织诱导 将（1)处理好的可可茶子叶小块接入诱导愈伤组织1号培养基中诱导愈伤组织，该诱 导愈伤组织培养基为在1升SH基本培养基中加入下述的原料及其配比制成： 鹿糖 20-40g 琼脂粉 5. 5-7. 2g 2,4-二氯苯氧乙酸 1. 0-3. Omg pH为5. 6,配制好的诱导愈伤组织培养基分装在培养瓶中，每瓶25ml，盖好瓶盖，在压 力为0. 1-0. 15MPa下灭菌25分钟，将培养瓶置于22-26°C、光照强度为2000-30001x的温室 中培养，每天光照12-14小时，培养98天后，转入2号培养基中继续培养诱导，该诱导愈伤 组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成： 蔗糖 20-40g 琼脂粉 5.5-7.2g 2, 4-二氯苯氧乙酸 O.l-l.Omg 苄基嘌呤（BA) 0.5-3.0mg pH为5. 6,配制好的诱导愈伤组织培养基分装在培养瓶中，每瓶25ml，盖好瓶盖，在压 力为0. 1-0. 15MPa下灭菌25分钟，将培养瓶置于22-26°C、光照强度为2000-30001x的温 室中培养，每天光照12-14小时，培养7天后，转入3号培养基中继续培养诱导，该诱导愈伤 组织培养基为在1升SH基本培养基中加入下述的原料及其配比制成： 蔗糖 15-35g 琼脂粉 5.5-7.2g 苄基嘌呤（BA) 0.5-3.0mg 吲哚乙酸（IBA) 0.1-0.5mg pH为5. 6,配制好的诱导愈伤组织培养基分装在培养瓶中，每瓶25ml，盖好瓶盖，在压 力为0. 1-0. 15MPa下灭菌25分钟，将培养瓶置于22-26°C、光照强度为2000-30001x的温室 中培养，每天光照12-14小时，培养35天后，长出胚状芽，继续培养至叶片长出、成苗及愈伤 组织褐化。
2. 根据权利要求1所述的可可茶愈伤组织培养方法，其中诱导可可茶愈伤组织培养基 1号、2号、3号分别为在1升SH、MS、SH基本培养基中加入下述的原料及其配比制成： 1号培养基 鹿糖 25-35g 琼脂粉 5. 8-6. 8g 2,4_二氯苯氧乙酸1.5-2. 5mg 2号培养基 蔗糖 25-35g 琼脂粉 5.8-6.8g 2，4-二氯苯氧乙酸 0.2-1.8mg 苄基嘌呤（BA) 0.8-2.0mg 3号培养基 蔗糖 20-30g 琼脂粉 5.8_6.8g 苄基嘌呤（BA) 1.5-2.5 mg° 吲哚乙酸（IBA) 0.1-0.3mg
3.根据权利要求1所述的可可茶愈伤组织培养方法，其中诱导愈伤组织培养基为在1 升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成： 1号培养基 鹿糖 30g 琼脂粉 6. 5g 2,4-二氯苯氧乙酸2. Omg 2号培养基 蔗糖 30g 琼脂粉 6.5g 2, 4-二氯苯氧乙酸 〇.5mg 苄基嘌呤（BA) l.Omg 3号培养基 蔗糖 25g 琼脂粉 6.5g 苄基嘌呤（BA) 2.0mg° 吲哚乙酸（IBA) 0.2mg
【文档编号】A01H4/00GK104115746SQ201410264068
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】杭悦宇, 温尧林, 郭海松, 孙小芹, 李密密 申请人:江苏凯吉生物科技有限公司, 江苏省中国科学院植物研究所