发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee工作发酵剂制品及其预防便秘保健用途
【专利摘要】本发明公开了一种发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee工作发酵剂制品及其预防便秘保健用途，发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee，中国典型培养物保藏中心保藏编号CCTCCM2013512。该发酵乳杆菌能在人的肠道内正常生长。小鼠体内试验还表明，发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee能够减缓便秘引起的小鼠体重减轻趋势，加快排黑便时间，提高小肠推进率，不同程度的增加血清的MTL、Gas、ET、AchE、SP和VIP因子水平，降低SS因子，增加摄食量和饮水量，降低排便量、排便颗粒数和粪便含水量下降的趋势，与便秘药物起到相似的作用，表现出一定的便秘预防效果。最佳使用剂量1.0×109CFU每公斤体重。CCTCC NO：M201351220131025
【专利说明】发酵乳杆菌Lactobaci I Ius fermentum Lee工作发酵剂制 品及其预防便秘保健用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物【技术领域】，更具体地，本发明涉及一种分离自四川省若尔盖县 牧民家自然发酵牦牛酸乳中的可调节肠道运动、预防便秘的发酵乳杆菌和以该菌株为发酵 剂或添加的发酵乳、健康食品以及动物保健制品中的应用。
【背景技术】
[0002] 乳杆菌与人类生活关系密切，是广泛应用于食品发酵、工业乳酸发酵及医疗保健 领域中的有益微生物之一。现已认识的乳杆菌属和双歧杆菌属中的许多种都具有特定的优 良性质和遗传性状，表现出极强的益生菌特性。乳杆菌不仅能够提高食品营养价值，改善食 品风味，延长保存时间，还可以改善食品的功能性质。它能够通过分解食物中的蛋白质、糖 类、合成维生素，提高食物的消化率和生物价，促进消化吸收。还能够减少人体胆固醇含量、 增强免疫功能、抗变异原性、抗肿瘤、抗高血压等。近年来，乳杆菌以其特殊的生理活性和营 养功能而成为益生菌的主要来源，正日益引起人们的重视。
[0003] 便秘是非常普遍的一种疾病，在人群中的患病率高达27%，它可以影响各年龄段 的人。习惯性便秘因用力增加腹压，屏气使劲排便，是诱发中老年男性高血脂、心脑血管疾 病、动脉硬化、肿瘤等疾病及其并发症的罪魁祸首，从而导致老人心脑血管病变死亡率急剧 增加，出现痔疮、肛裂等问题，令人痛苦不堪。另外长期便秘，大量便渣会滞留在肠道内发 酵、腐烂，大量毒素和有害菌被肠道反复吸收，通过血液循环到达人体各部位，成为女性健 康和美丽的罪魁祸首。便秘还会使小孩胃肠道菌群失衡，导致精力不集中、思维迟钝、营养 不良、心情急躁、消瘦、免疫力下降、易感冒、生长迟缓，如不及时调理，可能造成不可逆的 病变。因便秘发病率高、病因复杂，患者常有许多苦恼，便秘严重时会影响生活质量。因此， 寻找一种能够代替药物来预防便秘的生物制品有很大的现实意义，微生态疗法恰是以一个 崭新的手段解决了传统疗法存在的多种问题。
[0004] 国内外对乳酸菌的生理功能有大量的研究报道，但对乳酸菌预防便秘的功能性研 究报道很少。关于乳酸菌预防便秘的研究对食品科学、预防医学和微生态学等许多学科都 有很大价值。发酵乳制品是人们摄入乳酸菌的一条重要渠道，筛选优良的具有预防便秘和 安全的乳酸菌菌株，对于开发功能性乳制品、丰富现有乳制品种类、提高乳品的附加值将具 有重要意义。因此，具有预防便秘的乳酸菌具很大的研究和应用价值。
[0005] 在目前已经公开的文献与专利或专利申请中，例如CN101144064A公开了一种具 有抗致突变活性、产胞外多糖的短乳杆菌及其用途，用于发酵食品中以改善食品品质，增 加其营养学功能。CN1796540A公开了具有抗肠道致病菌和抗氧化特性的双歧杆菌及其用 途，用于制备食品组合物或药物组合物，杀死或抑制幽门螺旋杆菌或大肠杆菌，治疗由其引 起的各种疾病。CN102174450A公开了一种抗幽门螺杆菌感染的植物乳杆菌及其用途，用 于制备药物组合物、发酵剂、动物饲料添加剂和保健品中来预防或减轻幽门螺杆菌的感染。 CN101144065A公开了一种耐过氧化氢、清除自由基的抗氧化干酪乳杆菌及其用途，用于发 酵食品及乳品胶囊制品中以开发功能性乳制品、丰富现有乳制品种类、提高乳品的附加值。 但是，这些专利或专利申请没有完全涉及具有调节肠道运动、预防便秘等性能的微生物。因 此，目前还需要有一种具有调节肠道运动、预防便秘的微生物及其含有它们的食品。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种发酵乳杆菌工作发酵剂制品。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供一种所述发酵乳杆菌在发酵食品中的用途。
[0008] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
[0009] 一种发酵乳杆菌工作发酵剂制品，发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum strain Lee，CCTCC N0:M2013512(中国典型培养物保藏中心，中国武汉，武汉大学2013. 10. 25)，采 用如下的步骤制得：
[0010] 1)将上述发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee原始菌种接种于MRS液体培 养基中，在37°C条件下培养12-16h进行活化，连续活化两代，然后将活化培养物按2-4%体 积接种于MRS培养基中，培养16-18h，在4°C条件下4000r/min离心15min，去除上清液，得 到细胞沉淀，将沉淀用一定量的无菌脱脂乳制成悬浮液，得到工作发酵剂备用；2)由1)所 得目标工作发酵剂直接添加到食品中，或者与可共生的制备发酵乳的商业发酵剂一起使用 制备发酵乳。
[0011] 与本发明申请（II )相关的不同工作发酵剂产生途径（I )的发明专利申请已同 日提出。
[0012] 本发明人从自然发酵牦牛酸乳中筛选出一株发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Le，保藏编号 CCTCCM2013512。
[0013] 该发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee的形态学特征：
[0014] 菌体特征：呈革兰氏染色阳性，细胞杆状，菌体约0. 5-1. 0 ii m宽，1. 5-4 ii m长，成 单、成对或者成链，不形成芽孢，两端圆形。
[0015] 菌落特征：在MRS培养基上形成明显的菌落，直径在0.5-2. Omm之间，圆形，边缘整 齐，乳白色，透明，表面湿润光滑，不产生色素，参见附图1和2。
[0016] 本发明发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee的体内耐受特征：
[0017] 发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee菌株耐酸性较强，在pH3. 0的人工胃 液下3h后存活率达到了 40. 48 ±1. 84% ;在0. 3 %浓度胆盐下存活率达到60% ;发酵乳杆 菌 Lactobacillus fermentum Lee 细胞的疏水性也达到了 15. 17±6. 20%。
[0018] 本发明的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee来源于传统发酵食品，属公 认安全（Generally Recognized As Safe, GRAS)菌种，可用于发酵食品中。
[0019] 所述的发酵食品是乳酸菌奶饮料、乳粉、胶囊制品或发酵乳可为人类食品、动物饲 料或保健品。
[0020] 所述食用对象包括人类和养殖动物，方法添加在日常食品中使食用对象获得调节 肠道运动预防便秘的保健作用。
[0021] 一种发酵乳杆菌工作发酵剂制品调节肠道运动预防便秘保健用途，作为发酵剂添 加到食品中添加或者与可共生的制备发酵乳的商业发酵剂一起使用制备发酵乳，以获得调 节肠道运动预防便秘保健作用，最佳使用剂量I. OX IO9CFU每公斤体重。
[0022] 下面分别描述所述发酵食品的制备方法。
[0023] 所述的乳酸菌奶饮料是按照下述步骤制备得到的：
[0024] 首先，所述发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee原始菌种在温度_75°C下以 30% (重量）甘油悬液形式保存，或者在温度4°C下以冷冻干燥菌粉的形式保存备用。
[0025] 原料乳在95°C下加热杀菌20min或在140°C下高温热杀菌2s，然后冷却到4°C， 再加入前面所述的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee工作发酵剂，使其浓度达到 106cfu/mL以上，在4°C冷藏保存即得到含发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee活菌 的乳酸菌奶饮料。
[0026] 发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee菌株的耐酸性较强，在pH3. 0的 人工胃液下3h后存活率达到了 40. 48± 1. 84 %，在0. 3 %浓度胆盐下存活率达到60 %， Lactobacillus fermentum Lee细胞的疏水性也达到了 15. 17±6. 20%。这表明发酵乳杆 菌Lactobacillus fermentum Lee能在人的肠道内正常生长。小鼠体内试验还表明，发酵 乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee能够减缓便秘引起的小鼠体重减轻趋势，加快排黑 便时间，提高小肠推进率，不同程度的增加血清的MTL、Gas、ET、AchE、SP和VIP因子水平， 降低SS因子，增加摄食量和饮水量，降低排便量、排便颗粒数和粪便含水量下降的趋势，与 便秘药物起到相似的作用，表现出一定的便秘预防效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图 1 发酵乳杆菌 Lactobacillus fermentum Lee 菌落形态。
[0028] 图 2 发酵乳杆菌 Lactobacillus fermentum Lee 的菌体形态（IOOOx)。
[0029] 图3小鼠体重随实验时间的变化。
[0030] 图4不同组小鼠首次排黑便所需时间。
[0031] 图5不同组小鼠的小肠总长度。
[0032] 图6不同组小鼠的小肠推进率。
[0033] 图7不同组小鼠血清中各因子水平。其中，图a. MTL因子；图b. Gas因子；图c. ET 因子；图d. SS因子；图e. AchE因子；图f. SP因子；图g. VIP因子。
【具体实施方式】 [0034]
[0035] 在以下叙述中，所述的加热杀菌是例如使用上海沃迪自动化装备股份有限公司销 售的TW10D1000型管式杀菌机进行的。高温热杀菌是例如使用北京勇创嘉业机械设备有限 公司销售的YC-104型板式超高温杀菌机进行的。
[0036] 含发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee的乳粉是按照下述步骤制备得到 的：
[0037] 按照上述乳酸菌奶饮料的制备方法制备，只是原料乳在95°C下加热杀菌20min 或在140°C下高温热杀菌2s，然后冷却到37°C，再以原料乳体积的4%接菌量接种前面所述 的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee工作发酵剂，再在37°C下发酵16h，得到发 酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee发酵乳；然后所述的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee发酵乳按照1:3 (V:V)加到上述灭菌原料乳中，进行均质，真空浓缩、喷雾干 燥得到含发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee的乳粉。
[0038] 所述的均质是例如使用常州市均质机械有限公司销售的GJB500-40小型均质机 进行的。
[0039] 所述的浓缩是例如使用上海伟宙轻工机械有限公司销售的真空浓缩锅进行的。
[0040] 所述的喷雾干燥是例如使用上海沃迪科技有限公司销售的实验型喷雾干燥机进 行的。
[0041] 另外，所述的胶囊制品是按照下述步骤制备得到的：
[0042] 将原料乳在140°C高温热杀菌2s，然后冷却至37°C，以原料乳体积的4%接菌量接 种本发明的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee工作发酵剂，在37°C下发酵16h， 得到发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee发酵乳。将发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee发酵乳以1:3(V:V)加入灭菌后的原料乳中均质，经真空浓缩、喷雾干燥处 理后得到乳粉，将得到的乳粉装到胶囊中制成胶囊制品。
[0043] 此外，所述的发酵乳是按照下述步骤制备得到的：
[0044] 按照上述乳酸菌奶饮料的制备方法制备，只是原料乳在95°C下加热杀菌20min或 在140°C下高温热杀菌2s，然后冷却到37°C，再按照3-5% (体积）加入前面所述的发酵乳 杆菌Lactobacillus fermentum Lee工作发酵剂，再加入3-5% (体积）可共生的制备发 酵乳商品发酵剂，混匀后在37°C下混菌发酵至滴定酸度以乳酸计0. 6-0. 7%，然后冷却至 4°C，再进行冷藏保存得到所述的发酵乳。
[0045] 所述的商品发酵剂优选的是保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌。
[0046] 在本发明的意义上，所述的原料乳是一种或多种选自脱脂奶、鲜奶、复原奶的原料 乳。
[0047] 实施例1 :发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee的分离、纯化及初步鉴定
[0048] 该实施例按照下述步骤进行：
[0049] (I)Lactobacillus fermentum Lee 的分离、纯化
[0050] 以无菌操作吸取样品500 ii L加入至5mL灭菌生理盐水混合作成1 :10的均匀稀释 液，并继续作一定比例的稀释。选择合适梯度的稀释液，用无菌枪头各吸取IOOu L分别涂 布到MRS固体平板培养基中，30°C培养48-72h，观察记录菌落形态（图1)。用接种环（或 灭菌牙签）从平板表面及内部挑取不同菌落接种于MRS液体培养基中，置30°C，300r摇床 培养24-48h ;重复以上步骤连续活化2代后进行涂片革兰氏染色镜检（图2)，确定为G+菌 的继续活化，直至得到纯菌落（镜检无杂菌），并进行过氧化氢酶实验。将G+和过氧化氢酶 阴性的无芽孢杆菌、球菌及链球菌均暂定为乳酸菌，并保存，具体操作参照《微生物学实验 技术》。
[0051] 实验结果显示，从若尔盖县的十个样品中共分离出乳酸菌56株，乳酸菌活菌数平 均在108cfu/mL数量级。
[0052] (2)Lactobacillus fermentum Lee 的初步鉴定
[0053] 革兰氏染色：取典型菌落涂片，进行革兰氏染色，在微生物显微镜油镜下观察菌体 形态及其排列方式。挑取视野清晰、形态典型的菌株，进行拍照。过氧化氢酶实验：挑取固 体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2mL，观察结果（于半 分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性）。
[0054] 结果表明，从样品中分离纯化出的菌株均能在含5%。CaCO3的MRS平板培养基上生 长，并在菌落周围形成溶钙圈，革兰氏染色阳性，过氧化氢酶试验阴性。
[0055] 实施例2 :发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee的体外筛选 [0056] (1)益生菌耐受pH3. 0人工胃液的筛选
[0057] 人工胃液的配制：NaClO. 2%、胃蛋白酶0.35%、用IM的HCl调整pH值为3.0后， 在无菌操作台中用真空泵抽滤除菌后备用。
[0058] 益生菌对人工胃液耐受性的测定：取5mL已经活化好的菌株培养液，在无菌操作 台中倒入已灭菌IOmL离心管中，经3000r/min离心IOmin收集菌体，加入5mL灭菌生理盐水 混匀制成菌悬液，取ImL菌悬液与9mL pH3. 0的人工胃液混合，摇匀，置于恒温振荡器中培 养（37°C，300r)，并分别在Oh和3h取样，用MRS琼脂培养基倾注37°C培养48h。用平板计 数法测定活菌数，计算其存活率:存活率（％)= 3h的活菌数/Oh的活菌数X 100%
[0059] (2)益生菌耐受不同浓度胆盐的测定
[0060] 选择在pH3. 0人工胃液中存活率在10%以上的菌种做不同胆盐浓度下的生长测 试。将活化好的菌种5mL按2%的接种量（IOOii L)用移液枪分别接种于含0.0%牛胆盐 (即空白）、〇? 3%牛胆盐、0.5%牛胆盐、1.0%牛胆盐（W/V)的MRS-THIO培养基（MRS培养 基中加0. 2%的巯基乙酸钠）。在恒温振荡器中37°C培养24h后，以空白培养基为对照（未 接种的MRS-THIO培养基），分别测定上述不同浓度培养基的OD值，计算菌株对胆盐的耐受 力。胆盐耐受力=含胆盐的培养基的OD值/空白培养基的OD值X 100%
[0061] (3)菌液浓度调整
[0062] 选择在pH3. 0人工胃液中存活率在10%以上、耐胆盐较强的的菌种，经镜检观察 菌体生长形态良好后进行试验，将活化好的细菌培养物5mL，在无菌操作台中倒入已灭菌 10mT,离心管中，以3000r/min离心IOmin收集菌体。以5mLPBS (50mM，pH6. 5)缓冲液洗漆 菌体，3000r/min离心lOmin，重复洗涤两次。以PBS缓冲液为空白对照，用缓冲液调整受试 菌株菌体浓度，使其在560nm波长下AO值约为1. 00。取4mL调整好浊度的菌液于已灭菌 IOmL离心管中，加入0. 8mL二甲苯，对照组不加二甲苯，振荡30s，停顿10s，后再振荡30s， 于试管架上静置5?IOmin分层，取下层水相，以PBS缓冲液为空白对照，在560nm下测量 A值并进行记录。疏水率H%= [(AO-A)/AO] X 100其中AO和A分别是与二甲苯混匀前、后 菌液在560nm下测量得到的A值。
[0063] 乳酸菌是正常肠道菌的一部分，作为益生菌的首要条件之一，是能在胃和小肠前 段存活，被筛选的菌株应具有足够的耐酸性和酸性环境下生长发育的特性。
[0064] Lactobacillus fermentum Lee 的筛选结果如表 1 所不。
【权利要求】
1. 一种发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee工作发酵剂制品，中国典型培养物 保藏中心保藏编号CCTCCM2013512,采用如下的步骤制得目标物： 1)将上述发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee原始菌种接种于MRS液体培养基 中，在37°C条件下培养12-16h进行活化，连续活化两代，然后将活化培养物按2-4%体积接 种于MRS培养基中，培养16-18h，在4°C条件下4000r/min离心15min，去除上清液，得到细 胞沉淀，将沉淀用一定量的无菌脱脂乳制成悬浮液，得到工作发酵剂备用；2)由1)所得目 标工作发酵剂直接添加到食品中，或者与可共生的制备发酵乳的商业发酵剂一起使用制备 发酵乳。
2. 根据权利要求1或2所述之发酵乳杆菌工作发酵剂制品，其特征在于，所述商业发酵 剂为保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌。
3. -种发酵乳杆菌工作发酵剂制品调节肠道运动预防便秘保健用途，作为发酵剂添加 到食品中添加或者与可共生的制备发酵乳的商业发酵剂一起使用制备发酵乳，以获得调节 肠道运动预防便秘保健作用，最佳使用剂量1. OX 109CFU每公斤体重。
4. 根据权利要求3所述之发酵乳杆菌工作发酵剂制品调节肠道运动预防便秘保健用 途，所述食品包括人类食品、动物饲料或保健品。
5. 如权利要求3所述之发酵乳杆菌工作发酵剂制品调节肠道运动预防便秘保健用途， 其特征在于，所述食用对象包括人类和养殖动物，方法添加在日常食品中使食用对象获得 调节肠道运动预防便秘的保健作用。
【文档编号】A23K1/16GK104381440SQ201410340109
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年7月17日 优先权日:2014年7月17日
【发明者】李键, 索化夷, 骞宇, 赵欣, 兰道亮, 陈炼红, 谢婕 申请人:西南民族大学