拟南芥糖基转移酶基因ugt79b2在提高植物抗盐耐旱性中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种拟南芥糖基转移酶基因UGT79B2在提高植物抗盐耐旱性中的应用，其中所述糖基转移酶基因UGT79B2的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，其是通过RT-PCR技术从拟南芥中克隆的。本发明利用基因UGT79B2构建植物过表达载体，进行植物转基因操作，获得转基因植物。检测表明转基因植物的抗盐耐旱性得到显著提高，预示本发明实施后将会创造新型抗盐耐旱植物，可用于后续的作物品种改良，对我国农业生产具有重大意义。
【专利说明】拟南芥糖基转移酶基因 UGT79B2在提高植物抗盐耐旱性中 的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一个糖基转移酶基因及其应用，尤其涉及一种拟南芥糖基转移酶基因 UGT79B2在提高植物抗盐耐旱性中的应用，属于基因工程领域。
【背景技术】
[0002] 糖基转移酶是专门负责催化糖基化修饰反应的酶类，它将活性糖基从供体（通 常是UDP-glucose)转移到受体分子上。糖基化修饰往往会改变植物分子的生物活性、水 溶性、在细胞内和整体植株的转运特性、亚细胞定位以及与受体的相互识别与结合特性，另 外还能降低或消除内源和外源物质的毒性（Lim and Bowles, 2004 ;Bowles et al·，2006; Wang and Hou，2009)。因此，糖基转移酶基因在调节植物细胞代谢平衡、维持植物正常生长 发育等方面有重要意义。例如，已有报道糖基转移酶基因参与植物激素平衡调节、植物防御 反应、植物次生代谢物合成以及植物信号转导等（Wang and Hou，2009)。
[0003] 生物界存在的糖基转移酶按照所催化的底物性质和序列相关性分属94个不同 的家族。其中家族1包含的成员数量最多，与植物的关系最密切。在家族1中大多数基 因 C端具有一个由44个氨基酸组成的保守序列，即PSPG盒（plant secondary product glycosyltransferase box)。随着拟南芥（Arabidopsis thaliana)全基因组测序的完成， 通过对PSPG盒的序列分析发现拟南芥中共有119个可能的糖基转移酶，这些糖基转移酶中 大部分的功能还不清楚。
[0004] 干旱是我国严重的自然灾害之一，它对农作物的高产稳产产生很大的影响。盐碱 是影响粮食产量的另一重要因素。据不完全统计，世界上现有耕地13. 7亿平方公里，干旱 半干旱地区占世界土地面积的1/3,全球有8亿公顷的土地受到不同程度的盐渍化的影响 (Munns and Tester, 2008)，并且这一数目在还逐步扩大，我国大约有10%的耕地属于盐渍 化和次盐渍化土地，其中大部分盐渍化土地是由于干旱和半干旱地区的自然原因导致长期 聚集盐分而形成的。愈发严重的土地盐渍化和干旱严重影响了全球农作物的产量，使得粮 食生产和粮食安全成为全球关注的重要议题。因而，培育耐盐耐旱作物已成为缓解粮食安 全问题的重要途径。虽然利用传统的育种方式培育抗盐抗旱的品种已经取得了一定的进 展，但是借助转基因分子手段培育新种质越来越受到重视（王均华等，2008)。转基因种质 的获得依赖于抗盐抗旱机制的研究，通过研究克隆抗盐抗旱基因，从而获得耐盐耐旱性高 的种质，对于推动农业生产将具有重要意义。目前已了解的植物耐盐耐旱相关功能基因主 要包括离子转运蛋白、渗透保护物质合成酶、水通道蛋白、抗氧化酶、盐胁迫应答转录因子 等。这些研究发现为了解植物耐盐机制作出了重要贡献，获得的转基因植物也具有一定的 耐盐性。然而目前的问题是，已有的发现可能只是反映了整个耐旱耐盐机制中的某一个方 面。植物的耐旱耐盐性涉及一系列复杂的生理生化反应或过程，往往是多基因相互作用的 结果，目前的研究现状也要求科研工作者继续挖掘新型的耐旱耐盐基因，更好地为大幅度 提高重要作物在整个生长周期的耐盐耐旱性奠定技术基础。
[0005] UGT79B2是拟南芥糖基转移酶家族1中的一个成员，目前它的基因序列已公开于 核酸序列数据库中。但是经过检索，拟南芥糖基转移酶基因 UGT79B2在增强植物抗盐耐旱 性中的应用目前未见报道。
【发明内容】
[0006] (1)本发明的目的
[0007] 针对现有技术的不足，本发明的目的是提供了 一种拟南芥糖基转移酶基因 UGT79B2在提高植物抗盐耐旱性中的应用。
[0008] (2)实现本发明的具体技术方案
[0009] 本发明所述拟南芥糖基转移酶基因 UGT79B2在提高植物抗盐耐旱性中的应用。
[0010] 其中：所述糖基转移酶基因 UGT79B2的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。所述植 物优选是十字花科植物，进一步优选拟南芥、芥菜、油菜、白菜或甘蓝。
[0011] 本发明利用SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的引物序列，通过RT-PCR技术从拟 南芥中克隆糖基转移酶基因 UGT79B2,然后利用该基因构建植物过表达载体，进行植物转基 因操作，获得转基因植物。检测表明转基因植物的耐盐抗旱性得到显著提高。
[0012] (3)本发明实施后可能带来的有益效果
[0013] 实验证实，应用本发明所述拟南芥糖基转移酶基因 UGT79B2进行植物转基因操 作，可以显著提高转基因植物的抗盐性（见附图1、附图2和附图3)和耐旱性（见附图4、 附图5和附图6)。预示本发明实施后将会创造新型耐旱抗盐植物，可用于后续的作物品种 改良，对我国农业生产具有重大意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1.含盐培养基垂直培养实验。其中WT为拟南芥对照植物，0E7和0E18为糖基 转移酶基因 UGT79B2的两个过表达株系。选取生长状态一致的种子，灭菌后均匀铺在MS培 养基中垂直生长3天，然后选择根长长度一致的幼苗移栽到含0、100mM、125mM、150mMNaCl 的MS培养基中生长14天，统计对照植物和过表达株系的根长。在不同浓度的NaCl培养基 上，能够看到过表达株系的根长要比野生型的长。表明UGT79B2基因具有明显的抗盐作用。
[0015] 图2.含盐培养基中水平培养实验。其中WT为拟南芥对照植物，0E7和0E18为糖基 转移酶基因 UGT79B2的两个过表达株系。选取生长状态一致的种子，灭菌后均匀铺在MS培 养基中水平培养14天，然后将生长状态一致的幼苗移栽到含0mM、125mM、150mM、175mMNaCl 的MS培养基中生长14天，观察对照野生型和过表达株系的生长状态。在不同浓度的NaCl 培养基上，过表达株系的生长状态要比野生型好，野生型叶片多有白化，而过表达体叶片多 数保持绿色。表明UGT79B2基因具有明显的抗盐作用。
[0016] 图3. 土壤中浇盐水实验。其中WT为拟南芥对照植物，0E7和0E18为糖基转移酶 基因 UGT79B2的两个过表达株系。选取生长状态一致的种子，灭菌后点种在培养盘中，正常 培养三周，停止浇水（停止浇水前一天，在培养盘中充分浇水后过夜。第二天早上，将培养 盘中多余的水分倒出，停止浇灌）。随后两周进行盐水浇灌，第四周的第一天在培养盘中充 分浇灌含150mM NaCl的盐水1次。第五周的第一天在培养盘中充分浇灌含200mM NaCl的 盐水1次。第六周停止浇盐水，并观察表型。在浇灌盐水实验中，观察到过表达株系的生长 状态明显好于野生型，野生型植株已经接近死亡，而过表达体仍然生长良好。表明UGT79B2 基因具有明显的抗盐作用。
[0017] 图4.含甘露醇培养基垂直培养实验。其中WT为拟南芥对照植物，0E7和0E18为糖 基转移酶基因 UGT79B2的两个过表达株系。选取生长状态一致的种子，灭菌后均匀铺在MS 培养基中垂直生长3天，然后选择根长长度一致的幼苗移栽到含0mM、200mM、250mM、300mM 甘露醇的MS培养基中生长14天，统计对照野生型和过表达株系的根长。在不同浓度的甘 露醇培养基上，能够观察到过表达株系的根长要比野生型的长。表明UGT79B2基因具有明 显的抗旱作用。
[0018] 图5.含甘露醇培养基中水平培养实验。其中WT为拟南芥对照植物，0E7和0E18为 糖基转移酶基因 UGT79B2的两个过表达株系。选取生长状态一致的种子，灭菌后均匀铺在 MS培养基中水平培养14天，然后将生长状态一致的幼苗移栽到含0mM、300mM、350mM、400mM 甘露醇的MS培养基中生长14天，观察对照野生型和过表达株系的生长状态。在不同浓度 的甘露醇培养基上，过表达株系多数叶片保持绿色，生长状态要比野生型好。表明UGT79B2 基因具有明显的抗旱作用。
[0019] 图6. 土壤中干旱实验。其中WT为拟南芥对照植物，0E7和0E18为糖基转移酶基 因 UGT79B2的两个过表达株系。选取生长状态一致的种子，灭菌后点种在培养盘中，正常培 养三周，停止浇水（停止浇水前一周，在培养盘中充分浇水后过夜。第二天早上，将培养盘 中多余的水分倒出，停止浇灌）。为了防止幼苗在空气中直接干燥，在停止浇水第一天培养 盘上盖上透明的塑料盖。干旱处理两周左右，再在培养盘中充分浇水，正常培养三天后观察 幼苗生长的恢复情况。在土壤干旱实验中，观察到过表达株系生长良好，而野生型对照已经 接近死亡。表明UGT79B2基因具有明显的抗旱作用。
【具体实施方式】
[0020] 实施例1克隆拟南芥糖基转移酶基因 UGT79B2
[0021] 1.拟南芥糖基转移酶基因 UGT79B2的克隆
[0022] 通过公开网站http://www. cazy. org获得UGT79B2基因的cDNA序列。根据cDNA 序列设计引物，正向引物为79B2-F:5'-GGATCCCAGAAATGGGTGGTTTGAAGTTTC-3'，反向引物为 79B2-R:5'-GAGCTCTACCAACCTTATTGATCACTCCCT-3'。利用 TRIzol 试剂盒从拟南芥叶片提取 RNA，通过RT-PCR方法扩增UGT79B2基因的全长cDNA序列。将cDNA克隆的过程是先经过 BamHI和Sac I酶切，之后连入相应酶切的pBluescript II SK(+)载体（从宝生物工程有 限公司购得）中，构建成测序中间载体，称为PK79B2,然后用载体进行基因全长PCR扩增和 BamHI和Sac I酶切验证，最后进行序列测定，验证克隆序列的正确性。
[0023] 2.拟南芥糖基转移酶基因 UGT79B2的序列信息与特性分析
[0024] UGT79B2基因的编码区cDNA为1368bp，编码455个氨基酸的50. 6kDa蛋白，C端 具有44个氨基酸的PSPG盒，为植物次生代谢物糖基转移酶所共同具有的保守序列。
[0025] 3.拟南芥糖基转移酶基因 UGT79B2受盐和干旱的诱导表达分析
[0026] 为了调查UGT79B2基因表达是否受盐、干旱等逆境条件的诱导，第一阶段的工作 首先构建PUGT79B2启动子 ：：⑶S表达载体。做法是先克隆UGT79B2启动子区域1600bp 的片段，然后构建到pBI 121 (⑶S表达载体，从宝生物工程有限公司购得），取代该载体上的 35S启动子，即获得了 pUGT79B2启动子：：⑶S表达载体。第二阶段的工作是将该载体转入 农杆菌GV3101，借助于农杆菌转化拟南芥，对转基因植株进行筛选获得pUGT79B2启动子：： ⑶S纯系植株。第三阶段工作是⑶S染色分析。将两周大小的pUGT79B2启动子 ：：⑶S转 基因株系做逆境胁迫处理，一种处理是用150mM NaCl处理植株311、611、1211、2411，另一种处 理是用300禮甘露醇处理植株311、611、1211、2411。然后对处理的植株进行^3染色分析，不处 理的转基因株系作为对照同样进行⑶S染色。结果发现在NaCl、甘露醇处理之后，UGT79B2 基因的表达明显上调。说明了 UGT79B2基因受盐和干旱的诱导，参与植物的抗盐耐旱反应。
[0027] 实施例2拟南芥糖基转移酶基因 UGT79B2的转基因应用
[0028] 1.含有UGT79B2编码区cDNA表达载体的构建
[0029] 上述实施例1中获得了含有UGT79B2编码区cDNA的pK79B2中间测序载体，该 载体经过BamHI和Sac I双酶切后，获得带有酶切粘性末端的UGT79B2cDNA基因片段。 PBI121载体（从宝生物工程有限公司购得）也用同样的BamHI和Sac I双酶切，回收带有 CaMV35S启动子的载体片段。将UGT79B2cDNA基因片段与载体片段用连接酶进行连接，得到 以CaMV35S启动子驱动糖基转移酶基因过表达的植物表达载体，称为pB79B2。
[0030] 2.农杆菌介导植物的遗传转化
[0031] 农杆菌GV3101具有侵染植物和转移基因的能力，故将构建的UGT79B2植物表达载 体（PB79B2)转入农杆菌，然后进行PCR验证和酶切验证。利用浸花法（本领域公开的常规 方法），使含有植物表达载体的农杆菌GV3101浸染拟南芥花蕾。待其长出的角果成熟之后， 收集T1代种子并在筛选培养基（MS培养基附加30mg/L卡那霉素）上进行筛选，将能够正 常生长的绿色转化苗移栽至营养土中培养，分别收获其T2代种子再进行下一轮的卡那霉 素筛选，挑选出绿苗：白苗为3 :1的培养皿。将此培养皿上的绿苗移栽，单株收获种子（T3 代）。对每一单株的种子部分用于卡那霉素平皿筛选，直到选出在筛选培养基上为全绿的株 系，即为纯合转基因株系。
[0032] 3.转基因植株分子鉴定
[0033] 对上述转基因植株进行基因表达水平的检测。分别提取转基因植株和野生型 植株的RNA，反转录后进行RT-PCR扩增，分析过表达植株和野生型植株的基因表达差异。 UGT79B2在过表达植株中的表达量都明显高于野生型植株。利用两个UGT79B2表达量高的 株系，即79B20E7、79B20E18,来进行后续的工作。
[0034] 4. UGT79B2基因的抗盐抗旱性功能验证
[0035] (1)各株系在添加 NaCl的培养基中种子萌发情况。选取生长状态一致的种子，灭 菌后均匀铺在含100mM、125mM、150mM NaCl的MS培养基中黑暗低温（4°C )处理3天，然后 在正常情况下培养，培养一周并统计它们的萌发情况。在l〇〇mM NaCl中，对照野生型的萌 发率略低于过表达株系，在125mM和150mM NaCl中，对照野生型的萌发率明显低于过表达 株系。表明UGT79B2基因具有抗盐的作用。
[0036] (2) NaCl培养基中的子叶转绿实验。选取生长状态一致的种子，灭菌后均匀铺在含 0、100mM、125mM、150mM NaCl的MS培养基中生长10天，统计子叶的绿化率。在lOOmMNaCl 培养基中对照野生型略低于2个过表达株系，但是在含125mM NaCl和含150mM NaCl的培 养基中，过表达株系的子叶转绿比例明显比野生型多。表明UGT79B2基因具有抗盐的作用。
[0037] (3)NaCl培养基中的垂直培养实验。选取生长状态一致的种子，灭菌后均匀铺 在MS培养基中垂直生长3天，然后选择根长长度一致的幼苗移栽到含0、100mM、125mM、 150mMNaCl的MS培养基中生长14天，统计对照野生型和过表达株系的根长。在不同浓度的 NaCl培养基上，过表达株系的根的生长明显超过野生型（见图1)。表明UGT79B2基因具有 明显的抗盐作用。
[0038] (4)含盐培养基中水平培养实验。选取生长状态一致的种子，灭菌后均匀铺在MS 培养基中水平培养14天，然后将生长状态一致的幼苗移栽到含OmM、125mM、150mM、175mM NaCl的MS培养基中生长14天，观察对照野生型和过表达株系的生长状态。在不同浓度的 NaCl培养基上，过表达株系的生长状态要比野生型好，野生型叶片多有白化，而过表达体叶 片多数保持绿色（见图2)。表明UGT79B2基因具有明显的抗盐作用。
[0039] (5) 土壤中浇盐水实验。选取生长状态一致的种子，灭菌后点种在培养盘中，正常 培养三周，停止浇水（停止浇水前一周，在培养盘中充分浇水后过夜。第二天早上，将培养 盘中多余的水分倒出，停止浇灌）。随后两周进行盐水浇灌，第四周的第一天在培养盘中充 分浇灌含150mM NaCl的盐水1次。第五周的第一天在培养盘中充分浇灌含200mM NaCl的 盐水1次。第六周停止浇盐水，并观察表型。在浇灌盐水实验中，观察到过表达株系的生长 状态明显好于野生型，野生型植株已经接近死亡，而过表达体仍然生长良好（见图3)。表明 UGT79B2基因具有明显的抗盐作用。
[0040] (6)各株系在添加甘露醇的培养基中种子萌发情况。甘露醇添加在培养基中可以 模拟干旱环境，是一种常用的检测植物抗旱性的方法。选取生长状态一致的种子，灭菌后均 匀铺在含150mM、200mM、300mM甘露醇的MS培养基中黑暗低温（4°C )处理3天，然后在正常 情况下培养，培养一周并统计它们的萌发情况。在低浓度甘露醇培养基中对照野生型的萌 发率略低于过表达株系0E-7、0E-18,在300mM的甘露醇培养基中，过表达株系的萌发率明 显高于对照野生型，表明UGT79B2基因具有增强抗旱性的作用。
[0041] (7)甘露醇培养基中的水平培养实验。选取生长状态一致的种子，灭菌后均匀铺在 含0、200mM、250mM、300mM甘露醇的MS培养基中生长10天，统计子叶的绿化率。在不同浓 度的甘露醇培养基上，过表达株系的子叶转绿都明显比野生型多。表明UGT79B2基因具有 明显的抗旱作用。
[0042] (8)甘露醇培养基中的垂直培养实验。选取生长状态一致的种子，灭菌后均匀铺在 MS培养基中垂直生长3天，然后选择根长长度一致的幼苗移栽到含0、200mM、250mM、300mM 甘露醇的MS培养基中生长14天，统计对照野生型和过表达株系的根长。在不同浓度的甘 露醇培养基上，过表达株系的根长要比野生型长（见图4)。表明UGT79B2基因具有明显的 抗旱作用。
[0043] (9)含甘露醇培养基中水平培养实验。选取生长状态一致的种子，灭菌后均匀铺在 MS培养基中水平培养14天，然后将生长状态一致的幼苗移栽到含0、300mM、350mM、400mM甘 露醇的MS培养基中生长14天，观察对照野生型和过表达株系的生长状态。在不同浓度的 甘露醇培养基上，过表达株系多数叶片保持绿色，生长状态要比野生型好（见图5)。表明 UGT79B2基因具有明显的抗旱作用。
[0044] (10) 土壤中干旱实验。选取生长状态一致的种子，灭菌后点种在培养盘中，正常培 养三周，停止浇水（停止浇水前一周，在培养盘中充分浇水后过夜。第二天早上，将培养盘 中多余的水分倒出，停止浇灌）。为了防止幼苗在空气中直接干燥，在停止浇水的第一天培 养盘上盖上透明的塑料盖。干旱处理两周左右，再在培养盘中充分浇水，正常培养三天后观 察幼苗生长的恢复情况。在土壤干旱实验中，观察到过表达株系生长良好，而野生型对照已 经接近死亡（见图6)。表明UGT79B2基因具有明显的抗旱作用。
【权利要求】
1. 拟南芥糖基转移酶基因 UGT79B2在提高植物抗盐耐旱性中的应用。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述糖基转移酶基因 UGT79B2的核苷酸序 列如SEQ ID No. 1所示。
3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述植物是十字花科植物。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述十字花科植物是拟南芥、芥菜、油菜、白 菜或甘蓝。
【文档编号】A01H5/00GK104195150SQ201410498089
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月25日 优先权日:2014年9月25日
【发明者】侯丙凯, 李攀, 李燕洁 申请人:山东大学