一种续随子悬浮细胞的快速繁殖方法
【专利摘要】本发明研究了一种续随子悬浮细胞的快速繁殖方法，包括续随子无菌叶片的获得、愈伤组织的诱导、悬浮细胞的培养、悬浮细胞的诱变等步骤，本发明方法所制备的续随子细胞活性高，生长周期短，细胞形状均一稳定，为药用植物细胞工业化生产奠定基础。
【专利说明】 一种续随子悬浮细胞的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种续随子悬浮培养的快繁方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]续随子,又称千金子,大戟科,Z, 二年生草本,全株无毛。根柱状，茎直立。叶交互对生，线状披针形，全缘。花序单生，近钟状。雄花多数，雌花I枚。蒴果三棱状球形，光滑无毛。种子柱状至卵球状，褐色或灰褐色。花期4-7月，果期6-9月。产中国大部分省区，栽培或逸为野生广泛分布或栽培于欧洲、北非、中亚、东亚和南北美洲。全草有毒。具药用价值。续随子种子含油量一般达45%左右，高的可达48%以上。续随子油的脂肪酸组成与柴油替代品的分子组成相类似，其主要成分是倍半烯萜，富含巨大戟二萜醇3一十六烷酯，植株乳汁富含大量烯烃类碳氢化合物，续随子喜温暖，光照及中生环境，抗逆性较强，容易栽培，宜湿润，怕水涝，对土壤要求不严，沙壤土、黄土、白膳土、麦田土均可，但以砂壤腐殖土最佳。生于水田、低湿旱田及地边。续随子的种子、茎、叶及茎中白色乳汁均可入药、有逐水消肿、破症杀虫、导泻、镇静、镇痛、抗炎、抗菌、抗肿瘤等作用。临床报道、可治疗晚期血吸虫病腹水、毒蛇咬伤、妇女经闭等症。药材为大戟科植物续随子的种子。8?9月间，种子成熟后，割取全草，晒干，打下种子，去净杂质。性味辛，温，有毒。主要是种子繁殖。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供一种续随子悬浮细胞的快速繁殖方法，由该方法所制备的续随子细胞活性高，生长周期短，细胞形状均一稳定，为药用植物细胞工业化生产奠定基础。
[0004]本发明所要解决的技术问题是通过以下方案来实现的:
取续随子幼嫩的叶片，在漂白粉中静止15min，流水冲洗表面污垢，超净工作台上0.2%的升汞消毒lOmin，无菌水冲洗5次，吸干待用，消毒处理过的续随子幼嫩的叶片接入Miller+ZT0.5mg/L+KTl.5mg/L+0.4mg/ml青霉素培养基中进行愈伤组织诱导，附加鹿糖30g/L，琼脂6.5g/L，pH6.0，光照强度ΙΟΟΟΙχ，光照时间6h/d，温度22°C，诱导出来的愈伤组织放入液体培养基Miller+0.3mg/LIAA +1.0-1.5mg/L2ip+100mg/L水解乳蛋白进行液体悬浮细胞培养,恒温振荡器100r/min，接种量为2.5g，培养周期为40d，附加蔗糖30g/L，pH5.8，光照25001x，光照时间15h/d，温度24°C，培养一个月后的悬浮细胞放入过滤灭菌后的甲基磺酸乙酯溶液中，浓度为0.3%-1%，处理时间为l_5h，处理后加入新鲜的培养基中培养。
[0005]采用本发明制备的悬浮细胞活性高，周期短，产量大，污染小，利于大规模种植。
[0006]下面将结合【具体实施方式】对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
【具体实施方式】
[0007]实施例1
取续随子幼嫩的叶片，在漂白粉中静止15min，流水冲洗表面污垢，超净工作台上
0.2%的升汞消毒lOmin，无菌水冲洗5次，吸干待用，消毒处理过的续随子幼嫩的叶片接入Miller+ZT0.5mg/L+KTl.5mg/L+0.4mg/ml青霉素培养基中进行愈伤组织诱导，附加鹿糖30g/L，琼脂6.5g/L，pH6.0，光照强度ΙΟΟΟΙχ，光照时间6h/d，温度22°C，诱导出来的愈伤组织放入液体培养基Miller+0.3mg/LIAA +1.0mg/L2ip+100mg/L水解乳蛋白进行液体悬浮细胞培养，恒温振荡器100r/min，接种量为2.5g，培养周期为40d，附加蔗糖30g/L，pH5.8，光照25001x，光照时间15h/d，温度24°C，培养一个月后的悬浮细胞放入过滤灭菌后的甲基磺酸乙酯溶液中，浓度为0.3%，处理时间为lh，处理后加入新鲜的培养基中培养，增长率增加70%。
[0008]实施例2
取续随子幼嫩的叶片，在漂白粉中静止15min，流水冲洗表面污垢，超净工作台上
0.2%的升汞消毒lOmin，无菌水冲洗5次，吸干待用，消毒处理过的续随子幼嫩的叶片接入Miller+ZT0.5mg/L+KTl.5mg/L+0.4mg/ml青霉素培养基中进行愈伤组织诱导，附加鹿糖30g/L，琼脂6.5g/L，pH6.0，光照强度ΙΟΟΟΙχ，光照时间6h/d，温度22°C，诱导出来的愈伤组织放入液体培养基Miller+0.3mg/LIAA +1.5mg/L2ip+100mg/L水解乳蛋白进行液体悬浮细胞培养，恒温振荡器100r/min，接种量为2.5g，培养周期为40d，附加蔗糖30g/L，pH5.8，光照25001x，光照时间15h/d，温度24°C，培养一个月后的悬浮细胞放入过滤灭菌后的甲基磺酸乙酯溶液中，浓度为0.5%，处理时间为3h，处理后加入新鲜的培养基中培养，增长率增加68%。
[0009]实施例3
取续随子幼嫩的叶片，在漂白粉中静止15min，流水冲洗表面污垢，超净工作台上
0.2%的升汞消毒lOmin，无菌水冲洗5次，吸干待用，消毒处理过的续随子幼嫩的叶片接入Miller+ZT0.5mg/L+KTl.5mg/L+0.4mg/ml青霉素培养基中进行愈伤组织诱导，附加鹿糖30g/L，琼脂6.5g/L，pH6.0，光照强度ΙΟΟΟΙχ，光照时间6h/d，温度22°C，诱导出来的愈伤组织放入液体培养基Miller+0.3mg/LIAA +1.5mg/L2ip+100mg/L水解乳蛋白进行液体悬浮细胞培养，恒温振荡器100r/min，接种量为2.5g，培养周期为40d，附加蔗糖30g/L，pH5.8，光照25001x，光照时间15h/d，温度24°C，培养一个月后的悬浮细胞放入过滤灭菌后的甲基磺酸乙酯溶液中，浓度为1%，处理时间为5h，处理后加入新鲜的培养基中培养，增长率增加65%。
【权利要求】
1.一种续随子悬浮细胞的快速繁殖方法，包括续随子无菌叶片的获得、愈伤组织的诱导、悬浮细胞的培养、悬浮细胞的诱变等，其主要步骤如下: (1)取续随子幼嫩的叶片，进行消毒处理； (2)取步骤(I)消毒处理过的续随子幼嫩的叶片接入Miller+ZT0.5mg/L+KTl.5mg/L+0.4mg/ml青霉素培养基中进行愈伤组织诱导，附加鹿糖30g/L,琼脂6.5g/L,pH6.0,光照强度ΙΟΟΟΙχ，光照时间6h/d，温度220C ； (3)取步骤(2)诱导出来的愈伤组织放入液体培养基Miller+0.3mg/LIAA+l.0-1.5mg/L2ip+100mg/L水解乳蛋白进行液体悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，pH5.8，光照25001x，光照时间15h/d，温度240C ； (4)取步骤(3)培养一个月后的悬浮细胞放入过滤灭菌后的甲基磺酸乙酯溶液中，浓度为0.3%-1%，处理时间为l_5h，处理后加入新鲜的培养基中培养。
2.按照权利要求1所述的一种续随子悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(I)中所述续随子无菌叶片的获得为取续随子幼嫩的叶片，在漂白粉中静止15min，流水冲洗表面污垢，超净工作台上0.2%的升汞消毒lOmin，无菌水冲洗5次，吸干待用。
3.按照权利要求1所述的一种续随子悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(3)中续随子悬浮细胞培养的条件为恒温振荡器lOOr/min，接种量为2.5g，培养周期为40d。
【文档编号】A01H4/00GK104255517SQ201410540511
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年10月14日 优先权日:2014年10月14日
【发明者】刘东锋, 杨成东 申请人:南京帝道农业科技有限公司