一种蝶豆的组织培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种蝶豆的组织培养方法，该方法包括以下步骤：种子无菌萌发、初代培养、愈伤组织分化、生根培养和炼苗移栽。本发明的方法用于蝶豆的组织培养，具有繁殖速度快、繁殖系数大，繁殖后代整齐一致，移栽成活率高的优点。
【专利说明】一种蝶豆的组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物组织培养【技术领域】，具体的是一种蝶豆的组织培养方法。
【背景技术】
[0002]蝶豆(Clitoria ternatea L.)，又名蓝蝴蝶，蓝花豆，蝴蝶花豆，系蝶形花科(Papil1naceae)蝶豆属(Clitoria)植物,原产印度、印度尼西亚等地,在世界热带和亚热带地区广泛栽培。蝶豆具有广泛的经济价值，花可提取天然染料；嫩夹可食用；根可入药；此外，蝶豆还可调制成干草，用作饲料，尤其是近年来蝶豆作为庭园观赏植物，广泛用于园林植物造景配置中。
[0003]目前关于蝶豆的研究极少，国内的研究领域主要涉及一些特性的简单描述，以及种子萌发和栽培技术的研究。蝶豆种子的发芽率普遍较低，采用常规的种子繁殖方法速度慢。组织培养技术具有繁殖速度快、繁殖系数大，繁殖后代整齐一致，能保持原有品种的优良性状，不受季节的限制等优点，已广泛应用各种观赏植物中，目前尚未见有应用于蝶豆上。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种蝶豆的组织培养方法，解决了蝶豆因种子发芽率较低而繁殖速度慢的问题。本发明的方法用于蝶豆快速繁殖，具有繁殖速度快、繁殖系数大，繁殖后代整齐一致，移栽成活率高的优点。
[0005]本发明所提供的技术方案是:
[0006]一种蝶豆的组织培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤:
[0007](I)种子无菌萌发:选用饱满的蝶豆种子，经自来水冲洗、酒精灭菌、无菌水冲洗、升汞灭菌、无菌水冲洗和催芽处理，然后播种，种子萌发出小苗；
[0008](2)初代培养；将种子萌发后小苗的下胚轴切成长为5-10mm的小段，然后接种在改良MS培养基上，得到愈伤组织；
[0009](3)愈伤组织分化:将获得的愈伤组织切成0.5cmX0.5cm的小块，然后接种在含有6-BA和NAA的改良MS培养基上，得到组培小苗；
[0010](4)生根培养:当组培小苗长至高约2.0-4.0cm时，转接在含有IBA的改良MS培养基或者含有IBA的改良1/2MS培养基上，得到生根组培苗；
[0011](5)炼苗及移栽:将生根组培苗置于室温下炼苗ld，然后除去瓶盖再炼苗l-2d，洗去残余培养基，并将生根组培苗用50%多菌灵可湿性粉剂稀释800-1000倍或者0.5%高锰酸钾溶液浸泡1min后移栽至基质中。
[0012]其中，步骤(I)中所述播种，是将种子接入改良MS培养基中或播入经过灭菌处理保持湿润的沙子中。
[0013]其中，步骤(2)中所述改良MS培养基:是将MS培养基中的大量元素增加至20倍，以6.7g/L的无水CaCl2替代8.8g/L的CaCl2.2H20，将MS培养基中的微量元素增加至200倍，以 0.0032g/L 的 CuSO4 替代 0.005g/L 的 CuSO4 *5H20,MnSO4.4Η20 的用量改为为 3.38g/L，并以自来水替代去离子水，蔗糖为20g/L，琼脂3.5-4.0g/L，其余成分及用量不变，PH值为 5.8-6.0。
[0014]其中，步骤(3)中所述含有不同浓度6-BA和NAA的改良MS培养基为MS+6-BA0.1-1.0mg/L+NAA0.01-0.lmg/L。
[0015]其中，步骤(4)中所述所述改良1/2MS培养基:是在步骤⑵所述的改良MS培养基的基础上，将大量元素减至改良MS培养基中的1/2，蔗糖为10g/L，其余成分及用量与改良MS保持一致；所述含有IBA的改良MS培养基为MS+IBA0.1-0.3mg/L ;所述含有IBA的改良 1/2MS 培养基为 1/2MS+IBA0.1-0.3mg/L。
[0016]其中，步骤(4)中所述生根组培苗，为真叶已长出，主根约有3-4条，根长约为
2.5-4.5cm 的苗。
[0017]其中，步骤(5)中所述移栽，是将生根组培苗移栽至50-72孔育苗穴盘中，穴盘的尺寸为540mmX 280mm，该穴盘中装有基质。
[0018]作为优选，所述基质是由按体积比泥炭:珍珠岩=2:1所组成，其PH值为6.0_7.0 ο
[0019]作为优选，所述基质在移栽前I周需要用800-1000倍的多菌灵可湿性粉剂稀释液或0.5%高锰酸钾溶液进行消毒。
[0020]本发明的有益.效果
[0021]本发明的方法用于蝶豆组织培养，具有繁殖速度快、繁殖系数大，繁殖后代整齐一致，移栽成活率高的优点。
【具体实施方式】
[0022]下面结合具体例对本发明作进一步详细的说明。
[0023]实施例1:
[0024]2012年7月2日，选用饱满的蝶豆种子，自来水冲洗后，先用75%的酒精灭菌40s，无菌水冲洗3遍，再用0.1 %升汞灭菌lOmin，用无菌水冲洗3遍后进行催芽。催芽用50°C无菌水浸种15min后置于室温下24h。然后接入改良MS培养基中并置于组培室中，温度28±2°C，光照每天12h。
[0025]经过一段时间观察，于7月17日进行统计:种子在第5d开始萌发，污染率为0，萌发率为36.7%。7月25日将种子萌发后的小苗(子叶已展开)的上胚轴、下胚轴和带子叶茎段切成长为5mm的小段，分别接种于改良的MS培养基上。
[0026]经过一段时间观察，于9月10日统计:上胚轴、下胚轴和带子叶茎段在改良MS培养基上均可直接从基部诱导出愈伤组织，愈伤组织在第15d开始形成，愈伤组织诱导率为100%，愈伤组织质地酥松，颜色为淡黄色。
[0027]9月22日将获得的愈伤组织切成0.5cmX0.5cm大小，接种到附加了不同激素种类和浓度的改良MS培养基上，发现不同部位的愈伤组织分化能力不同，上胚轴、下胚轴和带子叶茎段的愈伤组织分化能力从高到低的顺序为:下胚轴、上胚轴和带子叶茎段的愈伤分化率分别为81^^20%和0%。愈伤组织分化的最佳培养基为:改良MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.02mg/L,增殖系数达4.5，同时愈伤组织在继续变大，质地酥松，分化出的小苗长势好，健壮。愈伤组织分化所需时间约25-30d。当组培苗长至高约2.0-3.5cm时，转接于附加了不同浓度的6-BA和NAA的改良培养基中，结果为:最佳生根培养基为MS+IBA0.lmg/L,生根率100%，小苗长势好，主根平均数为3.5条，主根平均长度3.5cm，根系白色，部分偏黄，有少量须根。生根时间需要1cL
[0028]将生根良好的小苗(真叶已长出，主根有3条，根长约为4.5cm)置于室温下炼苗ld，然后除去瓶盖再炼苗ld，洗去残余培养基，并将小苗用1000倍多菌灵浸泡1min后，移栽入装有基质的50孔育苗穴盘中(基质体积比为泥炭:珍珠岩=2:1，PH = 7.0)。并浇透定根水，置于全光照间歇式喷灌系统中养护管理。白天每间隔4h喷雾I次，7d后即可正常生长，成活率100%。
[0029]实施例2:
[0030]2012年7月2日，选用饱满的蝶豆种子，自来水冲洗后，先用70%的酒精灭菌30s，无菌水冲洗4遍，再用0.1 %升汞灭菌lOmin，用无菌水冲洗4遍后进行催芽。催芽用60°C无菌水浸种15min后置于室温下24h。然后播入经过灭菌的湿润沙子中(种子萌发过程中，沙子要保持湿润，但不能有积水)，并置于组培室中，温度28±2°C，光照每天12h。
[0031]经过一段时间观察，于7月17日进行统计:种子在第7d开始萌发，污染率为0，萌发率为27.27%。7月25日将种子萌发后的小苗(子叶已展开)的上胚轴、下胚轴和带子叶茎段切成长为1mm的小段，分别接种于改良的MS培养基上。
[0032]经过一段时间观察，于9月10日统计:上胚轴、下胚轴和带子叶茎段在改良MS培养基上均可直接从基部诱导出愈伤组织，愈伤组织在第15d开始形成，愈伤组织诱导率为100%，愈伤组织质地酥松，颜色为淡黄色。
[0033]9月22日将获得的愈伤组织切成0.5cmX0.5cm大小，接种到附加了不同激素种类和浓度的改良MS培养基上，发现不同部位的愈伤组织分化能力不同，上胚轴、下胚轴和带子叶茎段的愈伤组织分化能力从高到低的顺序为:下胚轴、上胚轴和带子叶茎段的愈伤组织分化率分别为70%、25%和0%。愈伤组织分化的最佳培养基为:改良MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.lmg/L,增殖系数达4.0,同时愈伤组织在继续变大，质地酥松，分化出的小苗长势好，健壮。愈伤组织分化所需时间约25-30d。当组培苗长至高约2.0-3.5cm时，转接于附加了不同浓度的6-BA和NAA的改良培养基中。结果发现:最佳生根培养基为1/2MS+IBA0.2mg/L,生根率100%，小苗长势好，主根平均数为3.9条，主根平均长度4.1cm,根系白色，部分偏黄，有少量须根。生根时间需要12d。
[0034]将生根良好的小苗(真叶已长出，主根约有3条，根长约为3.5cm)置于室温下炼苗ld，然后除去瓶盖再炼苗ld，洗去残余培养基，并将小苗用0.5%高锰酸钾溶液浸泡1min后，移栽入装有基质的50孔育苗穴盘中(基质按照体积比为泥炭:珍珠岩=2:1所组成，PH = 6.5)。并浇透定根水，置于全光照间歇式喷灌系统中养护管理。白天每间隔4h喷雾I次，1d后即可正常生长，成活率100%。
[0035]上述实施例中所涉及的公式如下:
[0036]污染率)=污染数/接种数X 100% ;
[0037]种子萌发率)=萌发数/接种数X 100% ;
[0038]愈伤组织诱导率(％ )=产生愈伤组织数/接种数X 100% ；
[0039]愈伤组织分化率(％ )=发生愈伤组织分化数/接种数X 100% ；
[0040]增殖系数=(增殖数+接种数)/接种数；
[0041]生根率(％ )=生根数/接种数X 100% ；
[0042]成活率)=成活的数量/总数量X 100%。
[0043]前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
【权利要求】
1.一种蝶豆的组织培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (1)种子无菌萌发:选用饱满的蝶豆种子，经自来水冲洗、酒精灭菌、无菌水冲洗、升汞灭菌、无菌水冲洗和催芽处理，然后播种，种子萌发出小苗； (2)初代培养；将种子萌发后小苗的下胚轴切成长为5-10皿的小段，然后接种在改良18培养基上，得到愈伤组织； (3)愈伤组织分化:将获得的愈伤组织切成0.5(311^0.50111的小块，然后接种在含有6-8八和嫩八的改良13培养基上，得到组培小苗； (4)生根培养:当组培小苗长至高约2.0-4.00111时，转接在含有18八的改良13培养基或者含有18八的改良1/213培养基上，得到生根组培苗； (5)炼苗及移栽:将生根组培苗置于室温下炼苗1山然后除去瓶盖再炼苗1-2(1，洗去残余培养基，并将生根组培苗用50%多菌灵可湿性粉剂稀释800-1000倍或者0.5%高锰酸钾溶液浸泡10111111后移栽至基质中。
2.如权利要求1所述蝶豆的组织培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述播种，是将种子接入改良13培养基中或播入经过灭菌处理保持湿润的沙子中。
3.如权利要求1所述蝶豆的组织培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述改良13培养基:是将13培养基中的大量元素增加至20倍，以6.7^/1的无水0^12替代8.8^/1的 ?2！！20，将13培养基中的微量元素增加至200倍，以0.0032^/1的。304替代0.005^/I的。304 ? 5！！20，111304 ?祖20的用量改为3.388凡，并以自来水替代去离子水，蔗糖为2(^/1,琼脂3.5?4.0^/1,其余成分及用量不变，？！！值为5.8-6.0。
4.如权利要求1所述蝶豆的组织培养方法，其特征在于，步骤(3)中所述含有不同浓度6-8八和嫩八的改良13培养基为13+6-840.1-1.0呢/1+嫩八0.01-0.1呢/1。
5.如权利要求1所述蝶豆的组织培养方法，其特征在于，步骤(4)中所述所述改良1/218培养基:是在步骤(2)所述的改良13培养基的基础上，将大量元素减至改良13培养基中的1/2，蔗糖为108/1，其余成分及用量与改良13保持一致；所述含有18八的改良13培养基为13+1840.1-0.3呢/1 ；所述含有18八的改良1/213培养基为1/213+18八0.1-0.3^/匕
6.如权利要求1所述蝶豆的组织培养方法，其特征在于，步骤(4)中所述生根组培苗，为真叶已长出，主根约有3-4条，根长约为2.5-4.50111的苗。
7.如权利要求1所述蝶豆的组织培养方法，其特征在于，步骤(5)中所述移栽，是将生根组培苗移栽至50-72孔育苗穴盘中，穴盘的尺寸为540111111X280111111，该穴盘中装有基质。
8.如权利要求7所述蝶豆的组织培养方法，其特征在于，所述基质是由按体积比泥炭:珍珠岩=2:1所组成，其值为6.0-7.0。
9.如权利要求7或8所述蝶豆的组织培养方法，其特征在于，所述基质在移栽前1周需要用800-1000倍的多菌灵可湿性粉剂稀释液或0.5%高锰酸钾溶液进行消毒。
【文档编号】A01H4/00GK104304033SQ201410628076
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年11月10日 优先权日:2014年11月10日
【发明者】闫海霞, 卜朝阳, 卢家仕, 黄昌艳, 何荆洲, 王晓国 申请人:广西壮族自治区农业科学院花卉研究所