一种黑曲霉泡腾片的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，特别涉及一种黑曲霉(Aspergillusnigerxj)泡腾片及其制备方法。
背景技术：
：黑曲霉是一种常见的真菌，属于半知类曲霉属。黑曲霉可以广泛用于加工蛋白制品，饲料加工和废物处理。本申请是利用黑曲霉在生长过程中所产生的次生代谢产物来对烟草青枯病菌进行抑制。现有技术中有通过黑曲霉防治烟草情况病的实例，如中国专利CN103146600A公开了利用黑曲霉(Aspergillusniger)Ty-3防治烟草青枯病。但该申请在病原菌分离以及真菌培养条件方面描述并不清楚，如烟草青枯病菌为细菌，为单菌落，不可能长出菌丝，而且细菌的种子培养基一般为NA或NB，培养条件偏碱性，而真菌的种子培养基一般为PDA，培养条件偏酸性。因此，上述文献中培养细菌的成分和条件来培养真菌并不合适。黑曲霉发酵液虽然有良好的抗菌活性，但因其液体的性质不宜大量储存与运输，长期储存时如保藏不当更会被杂菌污染，对生防效果及烟草生长产生未知的危害，因此我们对黑曲霉发酵液产品进行了进一步的加工和优化。根据烟草生长及大田生防的具体情况，将黑曲霉发酵液加工成生防泡腾片剂。泡腾片剂主要应用于烟草育苗期阶段，因其崩解快速、携带方便，按剂量置入水中后能迅速溶解、起效迅速生物利用度高，与单纯的液体制剂相比有着良好的储存运输优势。本发明人目的在于提供一种易于生产、剂型加工，又利于存活的拮抗菌制剂，将其用于烟草青枯病的防治。所述拮抗菌为黑曲霉(Aspergillusnigerxj)由贵州大学真菌资源研究所分离，已经于2006年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，(地址：中国武汉武汉大学)，保藏号：CCTCCNO：M206021。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是解决黑曲霉的稳定性和药效最优化，并且实现可控制释放。本发明提供了一种稳定的控释黑曲霉泡腾片。本发明还提供了所述泡腾片的生产方法。本发明还提供了所述泡腾片的使用方法。本发明还提供了所述泡腾片作为杀菌剂的应用。本发明是通过下述技术方案解决所述技术问题：为了实现上述目的，本发明提供了一种拮抗菌，所述拮抗菌为黑曲霉(Aspergillusnigerxj)由贵州大学真菌资源研究所分离，已经于2006年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，(地址：中国武汉武汉大学)，保藏号：CCTCCNO：M206021。一种黑曲霉泡腾片，其包括下述组分：黑曲霉，柠檬酸，碳酸氢钠，粘合剂和润滑剂。优选地，所述黑曲霉为发酵浓缩液粗提物粉剂，粘合剂选自质量分数50％～70％的蔗糖溶液、质量分数为10％的淀粉浆、PVP质量分数为10％的乙醇溶液中的一种或几种；润滑剂选自硬脂酸镁、滑石粉、微粉硅胶、聚乙二醇6000中的一种或几种；其中使用的乙醇的体积分数为75％。优选地，黑曲霉为8～20重量份，柠檬酸为30～50重量份，碳酸氢钠为30～45重量份，粘合剂为0.5～5重量份，润滑剂为0.5～10重量份。优选地，所述黑曲霉发酵浓缩液粗提物粉剂是通过下述方法制备得到：A.取灭菌发酵液过滤，浓缩至相对密度为1.12(25℃)，喷雾干燥，干燥条件为：进风温度150℃；排气温度95℃；流速20mL/s；或B.取灭菌发酵液过滤，浓缩至相对密度为1.12(25℃)，置70℃烘箱中，鼓风干燥36h，取出后使用高速粉碎机粉碎，过100目筛既得。优选地，所述泡腾片含有黑曲霉发酵浓缩液粗提物粉剂12重量份、NaHCO339.5重量份、柠檬酸45重量份、聚乙二醇60002重量份、PVP1.5重量份；所述泡腾片的发泡容量为15mL/g，崩解时间为1.2min，硬度在7.2Kg-7.7Kg之间。本发明所述泡腾片可以防治烟草青枯病。附图说明图1是浸膏粉及其与不同辅料配伍配方吸湿性的树状图；图2是粗提粉剂与辅料1∶1时，不同时间的吸湿率图；图3是三种辅料混合后的临界吸湿曲线图。实施例本发明根据下述实施例做进一步的描述，本领域技术人员可以明了的是，下述实施例对本发明仅仅起到说明的作用。在不背离本发明精神的前提下，对本发明所做的任意改进和替代均在本发明保护的范围之内。实施例1：泡腾片的制备仪器与试剂(如无特别说明，所有仪器与试剂均为常规市售产品)：电热真空干燥箱、电热恒温干燥箱、天平；LYO-1冷冻干燥设备(上海东富龙有限公司)、CS101-2A电热干燥箱(重庆银河实验仪器有限公司)、水浴锅(北京科伟永鑫实验仪器设备厂)、RE-52A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)、循环水多用真空泵(郑州杜甫仪器厂)、倾斜式高速万能粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司)、TDP1单冲压片机(上海天凡药机制造厂)、78X-Z型片剂四用测定仪(上海黄海药检仪器厂)。乳糖、甘露醇、MCC、β环糊精、磷酸氢、钙糊精、可溶性淀粉、羧甲基纤维素钠、羧丙甲基纤维素钠、乙基纤维素、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、丙烯酸树脂、NaHCO3、柠檬酸、发酵液粗提物、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇6000(PEG6000)、乙醇。黑曲霉发酵液粗提粉剂的制备：浓缩液制备：将灭菌后的黑曲霉发酵液过滤后，使用旋转蒸发仪浓缩至相对密度为1.12(25℃)，无菌条件下装瓶即用。发酵液粗提粉剂：A.取灭菌发酵液过滤，浓缩至相对密度为1.12(25℃)，喷雾干燥(干燥条件为：进风温度150℃；排气温度95℃；流速20mL/s)，即得。B.取灭菌发酵液过滤，浓缩至相对密度为1.12(25℃)，置70℃烘箱中，鼓风干燥36h。取出后使用高速粉碎机粉碎，过100目筛既得。配方的制作：将所制得的发酵液粗提物粉剂分别与乳糖、甘露醇、MCC、β环糊精、磷酸氢、钙糊精、可溶性淀粉、羧甲基纤维素钠、羧丙甲基纤维素、乙基纤维素、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、丙烯酸树脂按1∶1混合过100目筛，取适量，作为实验用的制剂配方。吸湿百分率的测定：将底部盛有氯化钠过饱和溶液的玻璃干燥器放入25℃，烘箱中恒温48h，此时干燥器内的相对湿度为75％，在已恒重的称量瓶底部放入2g的药粉，准确称重后置于氯化钠过饱和溶液的干燥器中(称量瓶盖打开)，于25℃的恒温箱中保存，定时取样称重，平行做3份，按下式计算吸湿百分率：吸湿百分率(％)＝(m吸湿后-m吸湿前)/m吸湿前×100％，取均值。制片：将柠檬酸粉碎，各原辅材料均过80目筛备用。柠檬酸加入粘合剂，用造粒机造粒，过12目筛；NaHCO3同法造粒。颗粒于45℃鼓风干燥4h后，用14目筛整粒。将所得酸粒、碱粒与润滑剂混合均匀，送入压片机压片，于45℃烘干，得成品。具体配方：黑曲霉发酵浓缩液粗提物粉剂12重量份、NaHCO339.5重量份、柠檬酸45重量份、聚乙二醇60002重量份、PVP1.5重量份。实施例2：泡腾片的制备按照实施例1所述的方法，按照黑曲霉发酵浓缩液粗提物粉剂20重量份、NaHCO339.5重量份、柠檬酸45重量份、聚乙二醇60002重量份、PVP1.5重量份。实施例3：泡腾片的制备按照实施例1所述的方法，按照黑曲霉发酵浓缩液粗提物粉剂18重量份、NaHCO345重量份、柠檬酸50重量份、聚乙二醇60005重量份、PVP5重量份。实施例4：各组分选择的影响因素粘合剂的选择：为了防止柠檬酸和NaHCO3提前反应，需将其分开制粒。制粒所需的粘合剂主要有质量分数50％～70％的蔗糖溶液、质量分数10％淀粉浆、PVP质量分数为10％的乙醇溶液(乙醇的体积分数为75％)，分别进行制粒，考察结果。片剂粘合剂以物料可操作性、片剂溶解性为评判指标，选择质量分数50％～70％的蔗糖溶液、质量分数为10％的淀粉浆、PVP质量分数为10％的乙醇溶液(乙醇体积分数为75％)等不同粘合剂进行实验。结果表明，用PVP质量分数为10％的乙醇溶液作为粘合剂，柠檬酸在制粒过程中不易结块，颗粒干燥后不易吸潮，且溶于水后无混浊感，用量约为0.15mL/g。润滑剂的选择：在制好的颗粒中分别添加PEG6000、硬脂酸镁和微粉硅胶进行压片，比较实验结果。常用的片剂润滑剂有硬脂酸镁、滑石粉、微粉硅胶、聚乙二醇6000(PEG6000)等。硬脂酸镁、滑石粉、微粉硅胶为水不溶性润滑剂，影响产品的感官质量，不宜采用。水溶性润滑剂PEG6000润滑性及抗粘性优良，且对泡腾片在水中溶解后的澄清度无影响，宜选用，其添加量为1.5％～2％。泡腾片发泡容量的测定：取一只烧杯，加200mL热水，投入泡腾片1片(0.7g)，立即将所产生的气体导入一倒立的充满水的100mL量筒中，至不再有气体产生时，记录量筒中气体的体积，即为发泡容量。CO2是形成泡腾片发泡效果的主要成分，发泡成因源于片中含有的NaHCO3与柠檬酸溶于水后发生酸碱中和反应，产生CO2所致，同时还产生柠檬酸钠。柠檬酸钠为偏碱性的盐，如生成量过多则抑制发酵液粗提物的抑菌活性，为使泡腾片表现出一定的起泡效果，泡腾片中NaHCO3与柠檬酸添加量就要适量。泡腾片CO2发泡量以溶解量计一般为液体体积的1～1.5倍，经测定，泡腾片的发泡容量为15mL/g。崩解时限检查：取泡腾片1片，置250mL烧杯中加入20～55℃水200mL，有大量气泡放出，当气体停止逸出时，片剂应溶解或分散于水中，无聚集的颗粒残留。此泡腾片的崩解时间约为1.2min，满足大田施用条件，能迅速的溶解在常温的水中，其溶液清澈透明，无杂质沉淀。该泡腾片剂在30d内，硬度变化不大，在7.2Kg-7.7Kg之间。符合国家标准，投入水中自溶即可。硬度考察：将各试验条件下制得的泡腾片进行铝塑泡罩包装，分别于第0日和第30日取样，测定径向硬度。辅料吸湿百分率的测定：最短距离聚类法是聚类分析中较简便常用的方法，适用于中药领域内使用。将下表的实验结果，按照如下步骤，用最短距离聚类法对发酵液粗提粉剂及其与不同辅料配伍的吸湿性进行分类。全浸膏粉及其与其他13种辅料配伍配方，共计14种配方为14个样品，未聚类前它们自成一类(初始类)，用Gi(i＝1，2，......14)表示，取样品的吸湿率为指标，指标值间之差称为样品问的距离(相似度)，计算14个样品两两间的距离dij(ij分别为1，2......14)得初始距离矩阵D0(对称矩阵)。选择D0中非对角线上的最小数，设为dpq，于是将Gp与GQ合并，得一新GY即GY{Gp，GQ}。计算新类GY与其他类Gk(k≠p，q)的距离：DYk＝min{dh1/h∈GY，1∈Gk}＝min{Dpk，Dqk}将D0中的p，q行与p，q列划去，增加构成一个新行和新列，得一个新矩阵。在新的矩阵中重复(2)，(3)的工作，最后可把所有样品都聚成一类。将整个聚类过程用聚类树枝图表示，选定一个相似度(距离)的临界水平(阈值)T，并规定距离比T大的不再聚类，在此水平上可得若干类。由不同时间的吸湿率图的结果可看出，如取相似度的临界水平T＝2.64，则可分为五类：交联羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、交联聚维酮为一类，吸湿性最大，粗提粉剂为一类，前期吸湿性较小，后期变化较大，羧丙甲基纤维素、糊精、乙基纤维素、丙烯酸树脂2、丙烯酸树脂3可溶性淀粉为一类，吸湿性其次，β环糊精、甘露醇、MCC、乳糖为一类，前期吸湿性较小，后期小幅度升高。磷酸氢钙为一类，吸湿性最差。如下表所示。粗提粉剂∶辅料＝1∶1时，48h内吸湿率变化表辅料加入全浸膏药粉后，吸湿特性都有所改变使用最短距离聚类分析法分析数据，借助统计软件SPSS19操作，做出不同类配方的吸湿率关于时间变化的折线规律(如上图)。考虑到微丸的脆度及崩解速率，选取了防潮性较好的MCC、乳糖、羟丙基甲基纤维素(HPMCK4M)作为本次实验的辅料。三种辅料混合后的临界吸湿度为85％，其临界吸湿曲线见附图3。经过对泡腾片剂的发泡量、崩解时限、硬度等指标进行测定后，确定了配方为发酵浓缩液粗提物粉剂12重量份、NaHCO339.5重量份、柠檬酸45重量份、聚乙二醇60002重量份、PVP1.5重量份。经测定，泡腾片的发泡容量为15mL/g，崩解时间为1.2min，硬度在7.2Kg-7.7Kg之间。实施例5：防治烟草青枯病实施地点：2012年在毕节市黔西县对拮抗真菌进行小区浓度筛选实验。小区浓度筛选实验显示：拮抗真菌xj菌株的无菌发酵液5000倍稀释，相对防效为58.5％，优于化学药农药链霉素的防效(52.6％)，当无菌发酵液1000倍稀释(10-3)，田间相对防效达到了86.8％，当无菌发酵液100倍稀释(10-2)，田间相对防效达到了95.7％。可见，拮抗真菌xj菌株的防治效果突出，但从节约生产成本考虑，我们在进行大田推广时，仅发病严重的地块，采用100倍稀释，其余的采用1000倍稀释。2013年在毕节市的大方县响水镇和七星关区燕子口镇进行拮抗菌的推广应用实验。在自然感病的情况下，拮抗真菌的防效都达到了90％以上。苗期施用方法：将黑曲霉xj发酵液灭菌后(无菌发酵液)与基质按1∶10搅拌混匀，然后植苗，所述基质为烟草基质育苗标准YC/T310-2009中所用基质，另外，所述比例为：1ml发酵液加到10g基质中。将实施例1中的沸腾片与基质按1∶10搅拌混匀。基质：特指由有机物料(包括草炭、腐熟植物秸秆)及天然矿物(珍珠岩、蛭石)为主配制的、用于烟草漂浮育苗生产的人造土壤。最常用的基质配方为：泥炭、珍珠岩、园艺蛭石(按体积)1∶1∶1。或7份泥炭+3份蛭石。烟草漂浮育苗基质理化指标项目要求pH值5.0～7.01-5mm粒径％≥40容重g/cm30.10～0.35总孔隙度％80～95有机质含量％≥15腐植酸％10～40电导率μs/cm≤1000有效铁离子含量mg/kg≤1000水分％20～45大田施用方法：将无菌发酵液按比例1∶100(体积比)与水冲兑后，采用灌根的方式进行田间施用2次，每株灌根20毫升。将实施例1中的沸腾片与水按1∶100(体积比)与水冲兑。病情调查：病情指数的调查共分3次，第1次调查在大田移栽前，第2次和第3次调查分别在施药后7～14天。方法为每块试验地采用对角线取样，取5点，每点100株烟株，记录下烟株的为害级数，并计算病情指数。病害分级标准按国家行业标准YC/T39-1996规定执行。各种形式的黑曲霉防治烟草青枯病的效果如下表所示。当前第1页1 2 3