本发明涉及干巴菌、松茸等外生菌根真菌对几种松属植物幼苗侵染形成菌根的一种方法，属于人工外生菌根菌侵染育苗应用技术及农业栽培技术领域。
背景技术：
干巴菌（ThelephoraganbajunZang）和松茸（又称松口蘑）[Tricholomamatsutake(lto et lmai) Singer]是两种著名的美味野生菌，具有较高的营养价值和药用价值，深受人们的喜爱，随着人们生活水平的提高，目前市场上供不应求，价格昂贵，干巴菌鲜重最贵可达每1 Kg售价1800元。干巴菌香味浓郁、滋嫩香甜、肉质坚韧，干燥，回味醇香绵长，嚼味无穷，而且有一股酷似腌牛肉干的浓郁香味，腌牛肉干被当地群众称为干巴，因而此菌得名干巴菌。干巴菌含有多种氨基酸、蛋白质，营养极为丰富；具有香味芳醇、肉质脆嫩、嚼味无穷、食味异常佳美的特点，是野生食用菌中的上品。
松茸，具有独特的浓郁香味，是世界上最珍稀名贵的天然药用菌类，被誉为“菌中之王”，是我国二级濒危保护物种；其富含蛋白质，有18种氨基酸，14种人体必需微量元素、49种活性营养物质、5种不饱和脂肪酸，核酸衍生物，肽类物质等稀有元素。另含有3种珍贵的活性物质，分别是双链松茸多糖、松茸多肽和全世界独一无二的抗癌物质——松茸醇。松茸在日本被奉为“神菌”。日本人习惯于秋季食用松茸料理，信奉“以形补形”，食之具有强精补肾，健脑益智和抗癌等作用。
干巴菌和松茸两种野生菌属于典型的外生菌根真菌，目前尚不能进行人工栽培，难以开发利用，其子实体的生长发育与共生植物松属植物的关系密切。同时，干巴菌和松茸在几种松属植物育苗过程中对松属植物的生长起到促进作用，可使松属植物根系发达，生长旺盛，进而加快苗木的生长速度。实现干巴菌和松茸与松属植物根部的成功侵染产生菌根建立共生关系，不仅可为外生菌根真菌的研究中植物与真菌的共生关系提供研究实例，而且为其实现人工栽培奠定了坚实的科学基础。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供干巴菌、松茸等外生菌根真菌对几种松属植物幼苗的一种浸染方法，建立外生菌根真菌与几种松属植物的共生关系，促进苗木的生长，并为实现人工栽培干巴菌、松茸等奠定坚实的科学基础。
本发明采用如下技术方案实现：
一种外生菌根真菌与松属植物的共生关系建立方法，本发明的方法包含以下六个步骤：（1）松属（Pinus）植物无菌种子的获得及培养；（2）栽培基质的选择及处理；（3）育苗穴盘的选择及处理；（4）侵染处理前的准备；（5）外生菌根真菌的侵染处理；（6）侵染处理后的苗期管理。
本发明所述的外生菌根真菌为：干巴菌时；所述的松属植物为：云南松(Pinusyunnanensis）或思茅松（Pinuskesiya var.langbianensis）或华山松（Pinusarmandii）。
本发明所述的外生菌根真菌为：松茸时；所述的松属植物为：云南松(Pinusyunnanensis）或高山松（Pinusdensata）或赤松（Pinusdensiflora）。
本发明步骤（1）的内容为，（1）松属植物无菌种子的获得及培养：选择饱满、无病虫害的松属植物种子放置于75%乙醇溶液中，摇晃浸泡30 s，取出种子，用无菌水冲洗3次，每次冲洗时间30 s；再将种子放置于0.1%HgCl2溶液中，摇晃浸泡8 min，取出种子，用无菌水冲洗6次，每次冲洗时间1 min；将消毒处理过的种子放置于垫有滤纸和无菌水的无菌培养皿中培养。培养环境：光照2500~3000 Lux，温度25（±1）℃。10~15 天后，胚根生长至5~15 mm时备用。其中，当使用胚根生长至11~15 mm时的备用胚根时，后期的侵染成功率达85%以上；当使用胚根生长至5~10 mm时的备用胚根时，后期的侵染成功率达92%以上。经试验结果表明：胚根生长至5~10 mm时，干巴菌的侵染成功率达95.2%,松茸的侵染成功率达92.1%；胚根小于5 mm时，干巴菌和松茸的侵染成功率均小于30%；胚根生长至11~15 mm时，干巴菌的侵染成功率在85.7%以上，松茸的侵染成功率在85.1%以上；胚根大于15 mm时，干巴菌和松茸的侵染成功率均小于50%。
本发明步骤（2）至步骤（4）的内容为，（2）栽培基质的选择及处理：基质选择小于3 mm的细颗粒蛭石；将细颗粒蛭石用自来水浸透，在121℃的高压灭菌锅中消毒灭菌30 min，冷却24 h后，再放置于121℃的高压灭菌锅中消毒灭菌30 min，冷却后备用。
（3）育苗穴盘的选择及处理：育苗穴盘选择加深加厚50孔林木育苗穴盘，孔口径5 × 5 cm，深8.5 cm；将该育苗穴盘放置于75%乙醇溶液中，摇晃浸泡10 min，取出该育苗穴盘，用无菌水冲洗1次备用。
（4）侵染处理前的准备：将步骤（2）处理过的细颗粒蛭石置于步骤（3）处理过的育苗盘穴内，压紧实，深度标准以蛭石离孔口0.5 cm为宜，在装有蛭石的盘穴的正中央用直径0.5 cm的金属棒打1个深1~1.5 cm的孔穴；同时再准备一些无菌培养皿备用。
本发明步骤（5）的内容为，（5）侵染处理：将外生菌根真菌如：干巴菌或松茸菌丝体置于不同的无菌培养皿内，再将步骤（1）处理培养好的胚根生长至5~15 mm种子放置于有菌丝体的培养皿中，轻轻摇晃10~15 min后（轻轻摇晃的目的是使菌丝体与松属植物种子的胚根充分接触并粘附于胚根上，提高侵染成功率），将侵染过的种子栽种于步骤（4）准备好的装有细颗粒蛭石的育苗盘穴中，每穴1粒，胚根朝下，用少量细颗粒蛭石覆盖种子，再用无菌水浸透蛭石即可。
本发明步骤（6）的内容为，（6）侵染处理后的苗期管理：将步骤（5）侵染处理过的并栽种好的松属植物种子连同育苗穴盘置于小拱棚中，放置之前，小拱棚内用75%乙醇喷雾杀菌处理。拱架可用宽2～3 cm的竹片，长度和宽度根据拱高和育苗穴盘的大小而定，一般拱高60～80 cm，塑料薄膜用0.08 mm厚的白色薄膜；再盖上一层透光率为50%的遮阳网，减少蒸腾失水，40 天后移除遮阳网；每3～5 天检查一次拱棚内松属植物小苗的小环境，湿度以薄膜上有水珠而不滑落为宜（此时湿度为60~80%，该湿度会严重影响后期结果，湿度低于60%时侵染率低下，高于80%时容易烂苗，成活率低，同样导致侵染率低下）。若拱棚内过湿或温度过高，要在两头揭膜通风，过干及时浇水，但不要过湿以免烂苗。70 天后开始长出真叶，此时移除小拱棚，80～90 天后形成外生菌根。形成外生菌根的侵染成功率可达85%以上。
本发明优选的，步骤（1）中，胚根生长至5~10 mm时备用。
本发明的有益效果是：侵染成功形成外生菌根的苗比未侵染的苗生长健壮，叶色浓绿，提前长出真叶，抗病性增强，创新性地在可控条件下成功建立了外生菌根真菌与几种松属的共生关系如：干巴菌与云南松、思茅松、华山松以及松茸与云南松、高山松、赤松的共生体系，提供了外生菌根真菌与植物实验条件下共生关系的研究方法，为其它大型外生菌根真菌与共生植物的研究提供了方法借鉴，并为实现人工栽培干巴菌、松茸奠定了坚实的科学基础。
具体实施方式
以下的实施例仅是对本发明的进一步说明，不是对本发明技术方案保护范围的限制。
一种外生菌根真菌与松属植物的共生关系建立方法，本发明的方法包含以下六个步骤：（1）松属植物无菌种子的获得及培养；（2）栽培基质的选择及处理；（3）育苗穴盘的选择及处理；（4）侵染处理前的准备；（5）外生菌根真菌的侵染处理；（6）侵染处理后的苗期管理。
本发明所述的外生菌根真菌为：干巴菌时；所述的松属植物为：云南松或思茅松或华山松。
本发明所述的外生菌根真菌为：松茸时；所述的松属植物为：云南松或高山松或赤松。
本发明步骤（1）的内容为，（1）松属植物无菌种子的获得及培养：选择饱满、无病虫害的松属植物种子放置于75%乙醇溶液中，摇晃浸泡30 s，取出种子，用无菌水冲洗3次，每次冲洗时间30 s；再将种子放置于0.1%HgCl2溶液中，摇晃浸泡8 min，取出种子，用无菌水冲洗6次，每次冲洗时间1 min；将消毒处理过的种子放置于垫有滤纸和无菌水的无菌培养皿中培养。培养环境：光照2500~3000 Lux，温度25（±1）℃。10~15 天后，胚根生长至5~15 mm时备用。其中，当使用胚根生长至11~15 mm时的备用胚根时，后期的侵染成功率达85%以上；当使用胚根生长至5~10 mm时的备用胚根时，后期的侵染成功率达92%以上。经试验结果表明：胚根生长至5~10 mm时，干巴菌的侵染成功率在95.2%,松茸的侵染成功率在92.1%；胚根小于5 mm时，干巴菌和松茸的侵染成功率均小于30%，仅为28.1%左右；胚根生长至11~15 mm时，干巴菌的侵染成功率在85.7%，松茸的侵染成功率在85.1%；胚根大于15 mm时，干巴菌和松茸的侵染成功率均小于50%。
本发明步骤（2）至步骤（4）的内容为，（2）栽培基质的选择及处理：基质选择小于3 mm的细颗粒蛭石；将细颗粒蛭石用自来水浸透，在121℃的高压灭菌锅中消毒灭菌30 min，冷却24 h后，再放置于121℃的高压灭菌锅中消毒灭菌30 min，冷却后备用。
（3）育苗穴盘的选择及处理：育苗穴盘选择加深加厚50孔林木育苗穴盘，孔口径5 × 5 cm，深8.5 cm；将该育苗穴盘放置于75%乙醇溶液中，摇晃浸泡10 min，取出该育苗穴盘，用无菌水冲洗1次备用。
（4）侵染处理前的准备：将步骤（2）处理过的细颗粒蛭石置于步骤（3）处理过的育苗盘穴内，压紧实，深度标准以蛭石离孔口0.5 cm为宜，在装有蛭石的盘穴的正中央用直径0.5 cm的金属棒打1个深1~1.5cm的孔穴；同时再准备一些无菌培养皿备用。
本发明步骤（5）的内容为，（5）侵染处理：将外生菌根真菌如：干巴菌或松茸菌丝体置于不同的无菌培养皿内，再将步骤（1）处理培养好的胚根生长至5~15 mm种子放置于有菌丝体的培养皿中，轻轻摇晃10~15 min后（轻轻摇晃的目的是使菌丝体与松属植物种子的胚根充分接触并粘附于胚根上，提高侵染成功率），将侵染过的种子栽种于步骤（4）准备好的装有细颗粒蛭石的育苗盘穴中，每穴1粒，胚根朝下，用少量细颗粒蛭石覆盖种子，再用无菌水浸透蛭石即可。
本发明步骤（6）的内容为，（6）侵染处理后的苗期管理：将步骤（5）侵染处理过的并栽种好的松属植物种子连同育苗穴盘置于小拱棚中，放置之前，小拱棚内用75%乙醇喷雾杀菌处理。拱架可用宽2～3 cm的竹片，长度和宽度根据拱高和育苗穴盘的大小而定，一般拱高60～80 cm，塑料薄膜用0.08 mm厚的白色薄膜；再盖上一层透光率为50%的遮阳网，减少蒸腾失水，40 天后移除遮阳网；每3～5 天检查一次拱棚内松属植物小苗的小环境，湿度以薄膜上有水珠而不滑落为宜（此时湿度为60~80%，该湿度会严重影响后期结果，湿度低于60%时侵染率低下，高于80%时容易烂苗，成活率低，同样导致侵染率低下）。若拱棚内过湿或温度过高，要在两头揭膜通风，过干及时浇水，但不要过湿以免烂苗。70 天后开始长出真叶，此时移除小拱棚，80～90 天后形成外生菌根。形成外生菌根的侵染成功率可达85%以上。
本发明优选的，步骤（1）中，胚根生长至5~10 mm时备用。
干巴菌侵染实施例一
（1）云南松无菌种子的获得及培养：选择饱满、无病虫害的云南松植物种子放置于75%乙醇溶液中，摇晃浸泡30 s，取出种子，用无菌水冲洗3次，每次冲洗时间30 s；再将种子放置于0.1%HgCl2溶液中，摇晃浸泡8 min，取出种子，用无菌水冲洗6次，每次冲洗时间1 min；将消毒处理过的种子放置于垫有滤纸和无菌水的无菌培养皿中培养。培养环境：光照2500~3000 Lux，温度25（±1）℃。10~15 天后，胚根生长至5 mm时备用。
（2）栽培基质的选择及处理：基质选择小于3 mm的细颗粒蛭石；将细颗粒蛭石用自来水浸透，在121℃的高压灭菌锅中消毒灭菌30 min，冷却24 h后，再放置于121℃的高压灭菌锅中消毒灭菌30 min，冷却后备用。
（3）育苗穴盘的选择及处理：育苗穴盘选择加深加厚50孔林木育苗穴盘，孔口径5 × 5 cm，深8.5 cm；将育苗穴盘放置于75%乙醇溶液中，摇晃浸泡10 min，取出育苗穴盘，用无菌水冲洗1次备用。
（4）侵染处理前的准备：将步骤（2）处理过的细颗粒蛭石置于步骤（3）处理过的育苗盘穴内，压紧实，深度标准以蛭石离孔口0.5 cm为宜，在装有蛭石的盘穴的正中央用直径0.5 cm的金属棒打1个深1cm的孔穴；同时再准备一些无菌培养皿备用。
（5）侵染处理：将干巴菌菌丝体置于无菌培养皿内，再将步骤（1）处理培养好的胚根生长至5mm种子放置于有菌丝体的培养皿中，轻轻摇晃10~15min后，将侵染过的种子栽种于步骤（4）准备好的装有细颗粒蛭石的育苗盘穴中，每穴1粒，胚根朝下，用少量细颗粒蛭石覆盖种子，再用无菌水浸透蛭石即可。
（6）侵染处理后的苗期管理：将步骤（5）侵染处理过的并栽种好的云南松种子连同育苗穴盘置于小拱棚中，放置之前，小拱棚内用75%乙醇喷雾杀菌处理。拱架可用宽2～3 cm的竹片，长度和宽度根据拱高和育苗穴盘的大小而定，一般拱高60～80 cm，塑料薄膜用0.08 mm厚的白色薄膜；再盖上一层透光率为50%的遮阳网，减少蒸腾失水，40 天后移除遮阳网；每3～5 天检查一次拱棚内云南松小苗的小环境，湿度以薄膜上有水珠而不滑落为宜。若拱棚内过湿或温度过高，要在两头揭膜通风，过干及时浇水，但不要过湿以免烂苗。70 天后开始长出真叶，此时移除小拱棚，80 天后形成外生菌根。形成外生菌根的侵染成功率可达86.3%。
干巴菌侵染实施例二
（1）云南松无菌种子的获得及培养：选择饱满、无病虫害的云南松植物种子放置于75%乙醇溶液中，摇晃浸泡30 s，取出种子，用无菌水冲洗3次，每次冲洗时间30 s；再将种子放置于0.1%HgCl2溶液中，摇晃浸泡8 min，取出种子，用无菌水冲洗6次，每次冲洗时间1 min；将消毒处理过的种子放置于垫有滤纸和无菌水的无菌培养皿中培养。培养环境：光照2500~3000 Lux，温度25（±1）℃。10~15 天后，胚根生长至10 mm时备用。
（2）栽培基质的选择及处理：基质选择小于3 mm的细颗粒蛭石；将细颗粒蛭石用自来水浸透，在121℃的高压灭菌锅中消毒灭菌30 min，冷却24 h后，再放置于121℃的高压灭菌锅中消毒灭菌30 min，冷却后备用。
（3）育苗穴盘的选择及处理：育苗穴盘选择加深加厚50孔林木育苗穴盘，孔口径5 × 5 cm，深8.5 cm；将育苗穴盘放置于75%乙醇溶液中，摇晃浸泡10 min，取出育苗穴盘，用无菌水冲洗1次备用。
（4）侵染处理前的准备：将步骤（2）处理过的细颗粒蛭石置于步骤（3）处理过的育苗盘穴内，压紧实，深度标准以蛭石离孔口0.5 cm为宜，在装有蛭石的盘穴的正中央用直径0.5 cm的金属棒打1个深1cm的孔穴；同时再准备一些无菌培养皿备用。
（5）侵染处理：将干巴菌菌丝体置于无菌培养皿内，再将步骤（1）处理培养好的胚根生长至10 mm种子放置于有菌丝体的培养皿中，轻轻摇晃10 min后，将侵染过的种子栽种于步骤（4）准备好的装有细颗粒蛭石的育苗盘穴中，每穴1粒，胚根朝下，用少量细颗粒蛭石覆盖种子，再用无菌水浸透蛭石即可。
（6）侵染处理后的苗期管理：将步骤（5）侵染处理过的并栽种好的云南松种子连同育苗穴盘置于小拱棚中，放置之前，小拱棚内用75%乙醇喷雾杀菌处理。拱架可用宽2～3 cm的竹片，长度和宽度根据拱高和育苗穴盘的大小而定，一般拱高60～80 cm，塑料薄膜用0.08 mm厚的白色薄膜；再盖上一层透光率为50%的遮阳网，减少蒸腾失水，40 天后移除遮阳网；每3～5 天检查一次拱棚内云南松小苗的小环境，湿度以薄膜上有水珠而不滑落为宜。若拱棚内过湿或温度过高，要在两头揭膜通风，过干及时浇水，但不要过湿以免烂苗。70 天后开始长出真叶，此时移除小拱棚，80 天后形成外生菌根。形成外生菌根的侵染成功率可达95.2%。
干巴菌侵染实施例三
（1）云南松无菌种子的获得及培养：选择饱满、无病虫害的云南松植物种子放置于75%乙醇溶液中，摇晃浸泡30 s，取出种子，用无菌水冲洗3次，每次冲洗时间30 s；再将种子放置于0.1%HgCl2溶液中，摇晃浸泡8 min，取出种子，用无菌水冲洗6次，每次冲洗时间1 min；将消毒处理过的种子放置于垫有滤纸和无菌水的无菌培养皿中培养。培养环境：光照2500~3000 Lux，温度25（±1）℃。10~15 天后，胚根生长至15 mm时备用。
（2）栽培基质的选择及处理：基质选择小于3 mm的细颗粒蛭石；将细颗粒蛭石用自来水浸透，在121℃的高压灭菌锅中消毒灭菌30 min，冷却24 h后，再放置于121℃的高压灭菌锅中消毒灭菌30 min，冷却后备用。
（3）育苗穴盘的选择及处理：育苗穴盘选择加深加厚50孔林木育苗穴盘，孔口径5 × 5 cm，深8.5 cm；将育苗穴盘放置于75%乙醇溶液中，摇晃浸泡10 min，取出育苗穴盘，用无菌水冲洗1次备用。
（4）侵染处理前的准备：将步骤（2）处理过的细颗粒蛭石置于步骤（3）处理过的育苗盘穴内，压紧实，深度标准以蛭石离孔口0.5 cm为宜，在装有蛭石的盘穴的正中央用直径0.5 cm的金属棒打1个深1cm的孔穴；同时再准备一些无菌培养皿备用。
（5）侵染处理：将干巴菌菌丝体置于无菌培养皿内，再将步骤（1）处理培养好的胚根生长至15 mm种子放置于有菌丝体的培养皿中，轻轻摇晃15 min后，将侵染过的种子栽种于步骤（4）准备好的装有细颗粒蛭石的育苗盘穴中，每穴1粒，胚根朝下，用少量细颗粒蛭石覆盖种子，再用无菌水浸透蛭石即可。
（6）侵染处理后的苗期管理：将步骤（5）侵染处理过的并栽种好的云南松种子连同育苗穴盘置于小拱棚中，放置之前，小拱棚内用75%乙醇喷雾杀菌处理。拱架可用宽2～3 cm的竹片，长度和宽度根据拱高和育苗穴盘的大小而定，一般拱高60～80 cm，塑料薄膜用0.08 mm厚的白色薄膜；再盖上一层透光率为50%的遮阳网，减少蒸腾失水，40 天后移除遮阳网；每3～5 天检查一次拱棚内云南松小苗的小环境，湿度以薄膜上有水珠而不滑落为宜。若拱棚内过湿或温度过高，要在两头揭膜通风，过干及时浇水，但不要过湿以免烂苗。70 天后开始长出真叶，此时移除小拱棚，80 天后形成外生菌根。形成外生菌根的侵染成功率可达85.7%。
干巴菌侵染实施例四
步骤（1）至步骤（6）的内容及参数同干巴菌实施例一，松属植物为思茅松，最后形成外生菌根的侵染成功率可达88.7%。
干巴菌侵染实施例五
步骤（1）至步骤（6）的内容及参数同干巴菌实施例二，松属植物为思茅松，最后形成外生菌根的侵染成功率可达97.1%。
干巴菌侵染实施例六
步骤（1）至步骤（6）的内容及参数同干巴菌实施例三，松属植物为思茅松，最后形成外生菌根的侵染成功率可达86.4%。
干巴菌侵染实施例七
步骤（1）至步骤（6）的内容及参数同干巴菌实施例一，松属植物为华山松，最后形成外生菌根的侵染成功率可达85.4%。
干巴菌侵染实施例八
步骤（1）至步骤（6）的内容及参数同干巴菌实施例二，松属植物为华山松，最后形成外生菌根的侵染成功率可达91.3%。
干巴菌侵染实施例九
步骤（1）至步骤（6）的内容及参数同干巴菌实施例三，松属植物为华山松，最后形成外生菌根的侵染成功率可达85.1%。
另：胚根小于5 mm，思茅松和华山松的侵染成功率均低于30%；胚根大于15mm，思茅松侵染成功率均低于50%，华山松的低于40%。
松茸侵染实施例一
步骤（1）至步骤（6）的内容及参数同干巴菌实施例一，松属植物为云南松，最后形成外生菌根的侵染成功率可达85.8%。
松茸侵染实施例二
步骤（1）至步骤（6）的内容及参数同干巴菌实施例二，松属植物为云南松，最后形成外生菌根的侵染成功率可达92.1%。
松茸侵染实施例三
步骤（1）至步骤（6）的内容及参数同干巴菌实施例三，松属植物为云南松，最后形成外生菌根的侵染成功率可达85.1%。
松茸侵染实施例四
步骤（1）至步骤（6）的内容及参数同干巴菌实施例一，松属植物为高山松，最后形成外生菌根的侵染成功率可达87.5%。
松茸侵染实施例五
步骤（1）至步骤（6）的内容及参数同干巴菌实施例二，松属植物为高山松，最后形成外生菌根的侵染成功率可达96.2%。
松茸侵染实施例六
步骤（1）至步骤（6）的内容及参数同干巴菌实施例三，松属植物为高山松，最后形成外生菌根的侵染成功率可达85.7%。
松茸侵染实施例七
步骤（1）至步骤（6）的内容及参数同干巴菌实施例一，松属植物为赤松，最后形成外生菌根的侵染成功率可达86.1%。
松茸侵染实施例八
步骤（1）至步骤（6）的内容及参数同干巴菌实施例二，松属植物为赤松，最后形成外生菌根的侵染成功率可达93.3%。
松茸侵染实施例九
步骤（1）至步骤（6）的内容及参数同干巴菌实施例三，松属植物为赤松，最后形成外生菌根的侵染成功率可达85.2%。
另：胚根小于5 mm，高山松和赤松的侵染成功率均低于30%；胚根大于15mm，高山松和赤松的侵染成功率均低于50%。