青钱柳生根培养基及其培养方法与流程

本发明涉及植物的组织培养技术，具体涉及青钱柳生根培养基及其培养方法。

背景技术：

青钱柳[Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja]属胡桃科(Juglandaceae)青钱柳属植物，别名摇钱树、麻柳，青钱李、山麻柳、山化树。青钱柳被誉为“植物大熊猫”、“医学界的第三棵树”，是冰川四纪幸存下来的珍稀树种，仅存于中国，是国家重点保护的濒危植物。青钱柳主要分布于江西、浙江、江苏、安徽、福建、台湾、湖北、四川、贵州、云南等地，多零星分布于深山老林和一些自然保护区中。

青钱柳更具有独特的保健和药用价值。民间长期以来用青钱柳叶做茶，茶气清香，味甜。《中国中药资源志要》(1994)记载，青钱柳叶具清热消渴解毒之效。《全国中草药名鉴》(1996)记载，青钱柳树皮、叶、根有杀虫止痒，消炎止痛祛风之功效。现代药理学研究证明，青钱柳有降血压、降血脂和抗衰老等药用功效。研究发现，青钱柳叶含有大量的钾、钙、镁、磷等常量元素，还含有锰、铁、铜、铬、锌、硒、钒、锗等微量元素。其中，与糖代谢和胰岛素作用密切相关的元素铬、镍、锂、硒、钒的含量较高，能够协助胰岛素发挥降血糖作用，并能改善糖耐量。青钱柳叶还含有丰富的多糖、黄酮、三萜、甾体类、皂苷、香豆精等有机化合物，这些化合物能有效降低甘油三酯和胆固醇，使青钱柳具有降血压、降血糖、降血脂的功能，同时对增强人体免疫力、抗氧化、抗衰老等具有独特作用。

目前，市场上的青钱柳苗木多为野生资源移栽或人工培育的种子实生苗。由于青钱柳种源有限，种子饱满率低，还具有深休眠特性，采用常规播种育苗方法育种周期长，效率低，难以在短期内生产出大量种苗，不能满足市场的需求。近几年来，国内外研究人员以离体胚、叶片、嫩芽、茎段等为外植体相继开展青钱柳的组织培养与快速繁殖的研究，如谢寅峰等(谢寅峰等.青钱柳组培快繁体系的初步研究.西北植物学报，2009，29(11)：2331-2338)利用离体胚初步建立了青钱柳的快繁体系，采用WPM+0.2mg/L IBA+20g/L蔗糖培养基进行诱导，生根率为16.67％，经过15d暗诱导处理，生根率可提高到23.33％。乔卿梅等(乔卿梅,程茂高,魏志华.不同外源激素对青钱柳茎段组织培养的影响.北方园艺2009(7)：125-127)研究发现，在青钱柳茎段组织培养中，不定根诱导的适宜培养基为改良MS+5.0mg/L IBA，诱导率为40.00％。鲁萌等(鲁萌等.青钱柳茎段腋芽的离体培养技术.南京林业大学学报(自然科学版)，2013，37(6)：6-10)以WPM为基本培养基，研究IBA、GGR-6、ABT-1对青钱柳生根的影响，结果表明，10％GGR+1.0mg/L IBA组合处理效果最好，生根率为25％。已有的研究结果表明，青钱柳无菌苗已能成功扩繁，但其生根率低、生根质量差，难以满足工厂化育苗的要求。由此可见，青钱柳组培苗的壮苗生根技术已成为制约青钱柳种苗工厂化生产的关键环节，组培苗生根技术的突破，对建立青钱柳高效组培快繁体系、扩大种植规模具有重要意义。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种青钱柳生根培养基及其培养方法。采用本发明所述的生根培养基对常规青钱柳试管苗进行生根培养，可以获得70％以上的生根率，且根系发育良好，植株生长健壮，移栽成活率高。

本发明所述的青钱柳生根培养基的配方为：

改良MS+IBA 0.5～2.0mg/L+NAA 0～1.0mg/L+胺鲜酯0.02～0.1mg/L+蔗糖15～20g/L，pH5.5～6.0；

其中，改良MS的配方为：

大量元素的组分及浓度为：硝酸钾700mg/L、硝酸铵600mg/L、七水硫酸镁185mg/L、磷酸二氢钾60mg/L、二水氯化钙165mg/L；

有机化合物的组分及浓度为：肌醇100mg/L、盐酸1mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、盐酸硫胺素0.2mg/L、甘氨酸2mg/L；

微量元素的组分及浓度同MS培养基。

上述技术方案中，所述青钱柳生根培养基的配方优选为：改良MS+IBA 0.8～1.5mg/L+NAA 0.2～0.8mg/L+胺鲜酯0.05～0.08mg/L+蔗糖18～20g/L，pH5.5～6.0；最优选为改良MS+IBA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+胺鲜酯0.05mg/L+蔗糖20g/L，pH5.5～6.0。所述青钱柳生根培养基的pH值优选为5.8～6.0。

本发明还包括一种青钱柳的培养方法，该方法包括生根培养步骤，所述的生根培养步骤为：切取单株试管苗，接入生根培养基中培养至少25d；其中：

所述生根培养基的配方为：

改良MS+IBA 0.5～2.0mg/L+NAA 0～1.0mg/L+胺鲜酯0.02～0.1mg/L+蔗糖15～20g/L，pH5.5～6.0；

其中，改良MS的配方为：

大量元素的组分及浓度为：硝酸钾700mg/L、硝酸铵600mg/L、七水硫酸镁185mg/L、磷酸二氢钾60mg/L、二水氯化钙165mg/L；

有机化合物的组分及浓度为：肌醇100mg/L、盐酸1mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、盐酸硫胺素0.2mg/L、甘氨酸2mg/L；

微量元素的组分及浓度同MS培养基。

上述方法中，青钱柳试管苗的生根培养条件可以与现有技术中相同。优选如下：培养温度为20～30℃，光照周期为10～14h/d，光照强度为2000～3000Lx；进一步优选的培养条件为：培养温度为23～27℃，光照周期为10～12h/d，光照强度为2000～3000Lx。

上述方法中，青钱柳试管苗在生根培养基中在上述培养条件下培养25d时，试管苗的生根率即可达到70％以上，而且根系发育良好，植株生长健壮。本发明所述方法中，优选试管苗的生根培养时间为25～35d。

上述方法中，所述生根培养基的配方优选为：改良MS+IBA 0.8～1.5mg/L+NAA 0.2～0.8mg/L+胺鲜酯0.05～0.08mg/L+蔗糖18～20g/L，pH5.5～6.0；最优选为改良MS+IBA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+胺鲜酯0.05mg/L+蔗糖20g/L，pH5.5～6.0。所述青钱柳生根培养基的pH值优选为5.8～6.0。

本发明所述方法中，用于进行生根培养的试管苗按现有常规方法离体培养得到，优选是以青钱柳当年生枝条，按常规方法离体培养所得。优选是选取高度≥2cm的单株试管苗进行生根培养，更优选是选取高度≥3cm且长有3～4个复叶的单株试管苗进行生根培养，以提高植株的移栽成活率。

与现有技术相比，本发明的特点在于：通过改良基本培养基及成分、结合使用特定浓度的胺鲜酯、IBA以及NAA植物生长调节剂，使所得生根培养基可有效促进青钱柳试管苗的生根。利用该生根培养基对青钱柳试管苗进行生根培养，可使生根率达到70％以上(优选实施例可达84％)，且根系发育良好，植株生长健壮，移栽成活率高，为实现青钱柳组培产业化和推广应用提供了技术支撑。

附图说明

图1为实施例1中按常规方法获得的青钱柳试管苗的图片；

图2为采用本发明实施例1中所述生根培养基培养15d时的生根苗的图片；

图3为采用本发明实施例1中所述的生根培养基继续培养至30d时的生根苗的图片；

图4为将采用本发明实施例1中所述生根培养基培养得到的生根苗进行移栽，移栽成活后的图片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。

以下各实施例中，所涉及的改良MS包括大量元素、微量元素和有机化合物，具体的配方如下：

大量元素的组分及浓度为：硝酸钾700mg/L、硝酸铵600mg/L、七水硫酸镁185mg/L、磷酸二氢钾60mg/L、二水氯化钙165mg/L；

微量元素的组分及浓度为：碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L。其中，七水硫酸亚铁与乙二胺四乙酸二钠螯合，乙二胺四乙酸二钠浓度为37.3mg/L。

有机化合物的组分及浓度为：肌醇100mg/L、烟酸1mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、盐酸硫胺素0.2mg/L、甘氨酸2mg/L。

实施例1

1)取青钱柳当年生枝条，按常规方法离体培养获得试管苗，如图1所示；

2)生根培养：切取高于3.5cm且长有3～4个复叶的单株试管苗，接入生根培养基中培养30d(在培养15d时如图2所示，在培养30d如图3所示)；其中：

所述生根培养基的配方为：改良MS+IBA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+胺鲜酯0.05mg/L+蔗糖20g/L，pH5.8，采用滤纸桥为支撑物。

在生根培养基中的培养条件为：温度为23～25℃，光照周期为12h/d，光照强度为2000Lx。

按生根株数/接种株数×100％来计算生根率(以下相同)，生根率为84％。

进一步将按本实施例方法培养得到的生根苗进行移栽，移栽成活后的图片如图4所示。

对比例1

重复实施例1的方法，只是将生根培养基配方修改为：改良MS+IBA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L，pH5.8。

经计算，生根率为32％。

对比例2

重复实施例1的方法，只是将生根培养基配方修改为：改良MS+IBA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+胺鲜酯0.01mg/L+蔗糖20g/L，pH5.8。

经计算，生根率为36％。

对比例3

重复实施例1的方法，只是将生根培养基配方修改为：改良MS+IBA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+胺鲜酯0.15mg/L+蔗糖20g/L，pH5.8。

经计算，生根率为2％。

实施例2

1)取青钱柳当年生枝条，按常规方法离体培养获得试管苗；

2)生根培养：切取高于2.5cm且长有2～3个复叶的单株试管苗，接入生根培养基中培养25d；其中：

所述生根培养基的配方为：改良MS+IBA0.5mg/L+NAA1.0mg/L+胺鲜酯0.1mg/L+蔗糖20g/L，pH6.0，采用滤纸桥为支撑物。

在生根培养基中的培养条件为：温度为25℃，光照周期为10h/d，光照强度为3000Lx。

经计算，生根率为70％。

实施例3

1)取青钱柳当年生枝条，按常规方法离体培养获得试管苗；

2)生根培养：选取高度大于3cm且长有2～3个复叶的单株试管苗，切去基部的愈伤组织，然后接入生根培养基中培养28d；其中：

所述生根培养基的配方为：改良MS+IBA2.0mg/L+胺鲜酯0.08mg/L+蔗糖16g/L，pH6.0，采用滤纸桥为支撑物；

在生根培养基中的培养条件为：温度为27℃，光照周期为10h/d，光照强度为2800Lx。

经计算，生根率为78％。

实施例4

1)取青钱柳当年生枝条，按常规方法离体培养获得试管苗；

2)生根培养：选取高度大于2.5cm且长有2个复叶的单株试管苗，切去基部的愈伤组织，然后接入生根培养基中培养27d；其中：

所述生根培养基的配方为：改良MS+IBA1.5mg/L+NAA0.2mg/L+胺鲜酯0.05mg/L+蔗糖18g/L，pH5.5，采用滤纸桥为支撑物。

在生根培养基中的培养条件为：温度为20℃，光照周期为14h/d，光照强度为2500Lx。

经计算，生根率为82％。

实施例5

1)取青钱柳当年生枝条，按常规方法离体培养获得试管苗；

2)生根培养：切取高于2.5cm且长有3～4个复叶的单株试管苗，切去基部的愈伤组织，然后接入生根培养基中培养28d；其中：

所述生根培养基的配方为：改良MS+IBA0.8mg/L+NAA0.8mg/L+胺鲜酯0.03mg/L+蔗糖15g/L，pH5.9，采用滤纸桥为支撑物。

在生根培养基中的培养条件为：温度为30℃，光照周期为12h/d，光照强度为2000～2200Lx。

经计算，生根率为80％。