一种糖果鸢尾的组织培养方法与流程

本发明属于植物培养技术领域，具体涉及一种糖果鸢尾组培技术。

背景技术：

糖果鸢尾(×Pardancanda norrisii)是以野鸢尾(Iris dichotoma)和射干(Iris domestica)为亲本，经不断杂交、回交等方式获得的后代群体的统称。因其花被会在花朵闭合次日翻卷，连着子房就像糖果，故名Candy lily，中文译为糖果鸢尾。射干和野鸢尾均原产我国，于夏季少花时节开花，花期长达一个半月，具有耐旱、耐寒、耐瘠薄等优良抗逆性，是十分优良的育种材料。但花色比较单一，限制了它们在园林中的应用。通过种间杂交获得的杂交后代糖果鸢尾，花色变异十分丰富，除了野鸢尾的白色和射干的橙色外，还出现了亲本没有的黄色、红色、粉色、紫色等花色。创造出了很多特异新类型，是培育鸢尾新品种的有效手段。

鸢尾繁殖方式常采用种子繁殖，也可采用分株繁殖，但是，利用传统方式繁殖，其株型一致性较差，植株变异性较大，优良性状无法保持。因此，研究糖果鸢尾离体快繁技术，可以进一步选择和稳定优良性状，提升植株的观赏应用价值，使其更快地应用于园林绿化中。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种糖果鸢尾的组织培养方法，可保持糖果鸢尾的优良性状，进行快速大量地繁殖。

本发明所述的方法，包括如下步骤：

1)不定芽的诱导：选择糖果鸢尾的花托或茎节嫩叶作为外植体，将所属外植体接种到愈伤诱导培养基中，培养至分化出不定芽；

所述愈伤诱导培养基为：MS+6-BA0.8～1.2mg/L+2,4-D0.8～1.2mg/L+蔗糖25～35g/L+琼脂；

2)苗的分化：将所述不定芽转接到继代增殖培养基中至分化出苗；

所述继代增殖培养基为：MS+6-BA 0.8～1.2mg/L+NAA 0.4～0.6mg/L+蔗糖25～35g/L+琼脂；

3)生根培养：将所述苗转接到生根培养基中，培养生根后得糖果鸢尾幼苗；

所述生根培养基为：1/2MS+IBA 0.8～1.2mg/L+蔗糖25～35g/L+琼脂。

本发明所述的方法，选择在愈伤诱导培养基上直接培养得到不定芽，再将所述不定芽培养得分化苗，进一步生根得幼苗，进一步的，对愈伤诱导培养基、继代培养基和生根培养基的激素选择和用量进行优化，得到一种高诱导成功率的糖果鸢尾的组织培养方法。

优选的，本发明中，所述愈伤诱导培养基、继代增殖培养基和生根培养基的pH均为5.8～6.2。pH值与植物体液pH值一致，利于植物生长，所接外植体、愈伤组织、不定芽以及幼苗均形态正常。

优选的，所述愈伤诱导培养基、继代增殖培养基和生根培养基中琼脂的添加量均为6～7g/L。培养基硬度刚好，所有外植体、愈伤组织、不定芽以及幼苗均很好地固定在培养基中。

优选的，所述愈伤诱导培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D1.0mg/L+蔗糖30g/L+6.5g/L琼脂，pH为5.8～6.2；

所述愈伤诱导培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L+蔗糖30g/L+6.5g/L琼脂，pH为5.8～6.2和/或；

所述继代增殖培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+6.5g/L琼脂，pH为5.8～6.2和/或；

所述生根培养基为：1/2MS+IBA1.0mg/L+蔗糖30g/L+6.5g/L琼脂，pH为5.8～6.2。

优选的，选择花托作为外植体。

优选的，所述不定芽的诱导、苗的分化和生根培养过程中的培养条件均为温度23～27℃，光照时间11～13h/d，光照强度25～30μmol·m-2·s-1。在这种条件下，所有外植体、愈伤组织、不定芽以及幼苗均生长良好。

优选的，在接种到愈伤诱导培养基前先用70％的无水乙醇对所述外植体消毒25～35s，再用2％次氯酸钠消毒10～14min。在这种条件下进行消毒，既可充分地杀灭外植体表面的微生物，还不会对外植体造成过大的伤害，保证外植体的较强活性。优选的，将所述糖果鸢尾幼苗栽到草炭、珍珠岩和蛭石头的混合基质中得糖果鸢尾植株。

优选的，所述草炭：珍珠岩：蛭石＝5:1:1。采用这种比例，可保证所述植株具有较高的移栽成活率，最高可达95％。

优选的，本发明所述的方法包括如下步骤：

1)外植体的选择和消毒：选择糖果鸢尾的花托作为外植体，对其进行初步清洗后，先用70％的无水乙醇对所述外植体消毒25～35s，再用2％次氯酸钠消毒10～14min，得消毒后的外植体；

2)不定芽的诱导：将所述消毒后的外植体接种到愈伤诱导培养基中，至分化出不定芽，所述愈伤诱导培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L+蔗糖30g/L+6.5g/L琼脂，pH为5.8～6.2；

3)苗的分化：将所述不定芽接种至继代增殖培养基中，得分化苗，所述继代增殖培养基为：MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+6.5g/L琼脂，pH为5.8～6.2；

4)生根培养：将所述分化苗接种至生根培养基中，培养得糖果鸢尾幼苗，所述生根培养基为：1/2MS+IBA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+6.5g/L琼脂，pH为5.8～6.2；

5)移栽：将所述糖果鸢尾幼苗移栽到灭菌后的草炭：珍珠岩：蛭石＝5:1:1的基质中，培养得糖果鸢尾植株；

所述不定芽的诱导、苗的分化和生根培养过程中的培养条件均为温度23～27℃，光照时间11～13h/d，光照强度25～30μmol·m^-2·s^-1。

本发明所述的方法具有如下有益效果：

本发明对糖果鸢尾的花、茎节、嫩叶等外植体进行了系列组织培养研究，取得了较好的结果，其中以花托为外植体进行组织培养时，效果最优。本发明通过消毒外植体，得到无菌系，继而利用不同种类和不同浓度的外源激素配比，对外植体进行诱导、继代增殖以及生根进行筛选、调控，最后确定最佳的外植体与培养基配方，使其能保持优良性状，并能应用于工业化生产。所得愈伤组织都比较紧凑、呈球形、淡黄色，状态好。生根率高达96％。

附图说明

图1为糖果鸢尾外植体；

图2为糖果鸢尾在诱导培养基上诱导出愈伤组织情况；

图3为糖果鸢尾分化出不定芽情况；

图4为糖果鸢尾分化苗生根情况；

图5为糖果鸢尾组培苗移栽情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例所涉及的诱导培养基、继代增殖培养基和生根培养基中均添加30g/L的蔗糖，调节其pH至5.8～6.2；

以下实施例所涉及的不定芽的诱导分化、苗的分化和生根培养的培养条件均为温度为25℃，光照时间12h·d-1，光照强度25～30μmol·m-2·s-1。

实施例1

本实施例涉及一种糖果鸢尾的组织培养方法，包括如下步骤：

(1)外植体消毒播种糖果鸢尾的种子，得到播种苗，采集健壮的无病虫害的花托作为组织培养的外植体(如图1)，将采集到的外植体先用20％的洗洁剂水浸泡30min，再用流水冲洗1～2h；在超净工作台上用70％的无水乙醇消毒30s，无菌水冲洗3遍，再用2％次氯酸钠消毒12min，无菌水冲洗5遍；

(2)不定芽的诱导分化将消毒后的外植体接种到诱导培养基上，诱导培养基：MS+6-BA 1.0mg·L-1+2,4-D 1.0mg·L-1，送入培养室进行无菌培养，培养室的条件：温度为25℃，光照时间12h·d-1，光照强度25～30μmol·m-2·s-1，培养4周后，诱导出愈伤组织(如图2)，8周后，愈伤组织分化出不定芽(如图3)；所述愈伤组织的诱导率为55％，不定芽的发生率为70％；

(3)苗的分化将不定芽继代到继代增殖培养基上进行继代培养，继代增殖培养基：MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1，经过3～4轮的继代培养，得到2～3倍数量的分化苗；所述分化苗的形成率为99％；

(4)生根培养将生长健壮，高6cm左右的分化苗转接到生根培养基上，6周后生根(如图4)，生根培养基：1/2MS+IBA 1.0mg·L-1，所述生根率为96％；

(5)移栽当分化苗生根长到2cm左右时，将三角瓶封口膜逐渐打开，炼苗3d，轻轻取出小苗，洗净根部残留的培养基，移栽到灭过菌的基质中基质中，所述基质草炭：珍珠岩：蛭石＝5:1:1，移栽成活率为95％(如图5)。

实施例2

本实施例涉及一种糖果鸢尾的组织培养方法，包括如下步骤：

(1)外植体消毒播种糖果鸢尾的种子，得到播种苗，采集健壮的无病虫害的茎节作为组织培养的外植体，将采集到的外植体先用20％的洗洁剂水浸泡30min，再用流水冲洗1～2h；在超净工作台上用70％的无水乙醇消毒30s，无菌水冲洗3遍，再用2％次氯酸钠消毒12min，无菌水冲洗5遍；

(2)不定芽的诱导分化将消毒后的外植体接种到诱导培养基上，诱导培养基：MS+6-BA 1.0mg·L-1+2,4-D 1.0mg·L-1，送入培养室进行无菌培养，培养室的条件：温度为25℃，光照时间12h·d-1，光照强度25～30μmol·m-2·s-1，培养4周后，诱导出愈伤组织，8周后，愈伤组织分化出不定芽；所述愈伤组织的诱导率为32％，不定芽的发生率为68％；

(3)苗的分化将不定芽继代到继代增殖培养基上进行继代培养，继代增殖培养基：MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1，经过3～4轮的继代培养，得到2～3倍数量的分化苗；所述分化苗的形成率为95％；

(4)生根培养将生长健壮，高6cm左右的分化苗转接到生根培养基上，6周后生根，生根培养基：1/2MS+IBA 1.0mg·L-1，所述生根率为96％；

(5)移栽当分化苗生根长到2cm左右时，将三角瓶封口膜逐渐打开，炼苗3d，轻轻取出小苗，洗净根部残留的培养基，移栽到灭过菌的基质中基质：草炭：珍珠岩：蛭石＝5:1:1，移栽成活率为98％。

实施例3

本实施例涉及一种糖果鸢尾的组织培养方法，包括如下步骤：

(1)外植体消毒播种糖果鸢尾的种子，得到播种苗，采集健壮的无病虫害的花托作为组织培养的外植体，将采集到的外植体先用20％的洗洁剂水浸泡30min，再用流水冲洗1～2h；在超净工作台上用70％的无水乙醇消毒25s，无菌水冲洗3遍，再用2％次氯酸钠消毒14min，无菌水冲洗5遍；

(2)不定芽的诱导分化将消毒后的外植体接种到诱导培养基上，诱导培养基：MS+6-BA 0.8mg·L-1+2,4-D 1.2mg·L-1，送入培养室进行无菌培养，培养室的条件：温度为25℃，光照时间12h·d-1，光照强度25～30μmol·m-2·s-1，培养4周后，诱导出愈伤组织，8周后，愈伤组织分化出不定芽；所述愈伤组织的诱导率为43％，不定芽的发生率为51％；

(3)苗的分化将不定芽继代到继代增殖培养基上进行继代培养，继代增殖培养基：MS+6-BA 0.8mg·L-1+NAA0.4mg·L-1，经过3～4轮的继代培养，得到2～3倍数量的分化苗；所述分化苗的形成率为85％；

(4)生根培养将生长健壮，高6cm左右的分化苗转接到生根培养基上，8周后生根，生根培养基：1/2MS+IBA0.8mg·L-1，所述生根率为87％；

(5)移栽当分化苗生根长到2cm左右时，将三角瓶封口膜逐渐打开，炼苗3d，轻轻取出小苗，洗净根部残留的培养基，移栽到灭过菌的基质中基质：草炭：珍珠岩：蛭石＝5:1:1，移栽成活率为97％。

实施例4

本实施例涉及一种糖果鸢尾的组织培养方法，包括如下步骤：

(1)外植体消毒播种糖果鸢尾的种子，得到播种苗，采集健壮的无病虫害的花托作为组织培养的外植体，将采集到的外植体先用20％的洗洁剂水浸泡30min，再用流水冲洗1～2h；在超净工作台上用70％的无水乙醇消毒30s，无菌水冲洗3遍，再用2％次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗5遍；

(2)不定芽的诱导分化将消毒后的外植体接种到诱导培养基上，诱导培养基：MS+6-BA 1.2mg·L-1+2,4-D 0.8mg·L-1，送入培养室进行无菌培养，培养室的条件：温度为25℃，光照时间12h·d-1，光照强度25～30μmol·m-2·s-1，培养5周后，诱导出愈伤组织，8周后，愈伤组织分化出不定芽；所述愈伤组织的诱导率为38％，不定芽的发生率为60％；

(3)苗的分化将不定芽继代到继代增殖培养基上进行继代培养，继代增殖培养基：MS+6-BA 1.2mg·L-1+NAA0.6mg·L-1，经过3～4轮的继代培养，得到2～3倍数量的分化苗；所述分化苗的形成率为87％；

(4)生根培养将生长健壮，高6cm左右的分化苗转接到生根培养基上，6周后生根，生根培养基：1/2MS+IBA 1.2mg·L-1，所述生根率为80％；

(5)移栽当分化苗生根长到2cm左右时，将三角瓶封口膜逐渐打开，炼苗3d，轻轻取出小苗，洗净根部残留的培养基，移栽到灭过菌的基质中基质：草炭：珍珠岩：蛭石＝5:1:1，移栽成活率为97％％。

实施例5

本实施例涉及一种糖果鸢尾的组织培养方法，与实施例1相比，其区别在于，愈伤诱导培养基为MS+6-BA 0.9mg/L+2,4-D 1.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L。其愈伤诱导成功率为40％，最终成活率为91％。

实施例6

本实施例涉及一种糖果鸢尾的组织培养方法，与实施例1相比，其区别在于，所述继代增殖培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.4mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L。苗分化的成功率为87％，最终成活率为93％。

实施例7

本实施例涉及一种糖果鸢尾的组织培养方法，与实施例1相比，其区别在于，所述生根培养基为：1/2MS+IBA 0.9mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L，生根率为89％，最终成活率为95％。

对比例1

本实施例涉及一种糖果鸢尾的组织培养方法，与实施例1相比，其区别在于，对外植体消毒的具体操作为:将采集到的外植体先用20％的洗洁剂水浸泡30min，再用流水冲洗1～2h；在超净工作台上用70％的无水乙醇消毒30s，无菌水冲洗3遍。结果为外植体污染率为89％。

对比例2

本实施例涉及一种糖果鸢尾的组织培养方法，与实施例1相比，其区别在于，对鸢尾幼苗进行移栽过程中选择的基质为，草炭：珍珠岩：蛭石＝1:1:1，移栽成活率为79％

对比例3

本实施例涉及一种糖果鸢尾的组织培养方法，包括如下步骤：

(1)外植体消毒播种糖果鸢尾的种子，得到播种苗，采集健壮的无病虫害的花蕾作为组织培养的外植体，将采集到的外植体先用20％的洗洁剂水浸泡30min，再用流水冲洗1～2h；在超净工作台上用70％的无水乙醇消毒30s，无菌水冲洗3遍，再用2％次氯酸钠消毒12min，无菌水冲洗5遍；

(2)不定芽的诱导分化将消毒后的外植体接种到诱导培养基上，诱导培养基：MS+6-BA 1.0mg·L-1+2,4-D 1.0mg·L-1，送入培养室进行无菌培养，培养室的条件：温度为25℃，光照时间12h·d-1，光照强度25～30μmol·m-2·s-1，培养6周后，没有诱导出愈伤组织。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。