本发明涉及一种杨树不定芽染色体加倍的方法，尤其涉及一种通过肉眼观察离体培养叶片切口处愈伤发育状态来判断芽原基刚开始分化的时期，进而施加秋水仙碱诱导体细胞染色体加倍选育四倍体的方法，属于细胞工程组织培养
技术领域：
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背景技术：
：多倍体在许多表型特征上通常不同于二倍体，比如植物的生长，细胞的大小，叶片的大小(StebbinsGLChromosomalEvolutioninHigherPlants.London:EdwardArnold1971；RamseyJUnreducedgametesandneopolyploidsinnaturalpopulationsofAchilleaborealis(Asteraceae).Heredity2007，98(3):143-150；AllarioT,BrumosJ,Colmenero-FloresJM,etal.LargechangesinanatomyandphysiologybetweendiploidRangpurlime(Citruslimonia)anditsautotetraploidarenotassociatedwithlargechangesinleafgeneexpression.Journalofexperimentalbotany2011，62(8):2507-2519)。染色体加倍是创造林木新品种的重要育种策略。一些三倍体杨树在生长、木材品质、生物量生产等方面均具有优势(WeisgerberH,RauHM,GartnerEJ,BaumeisterG,KohnertH,KarnerL25yearsofforesttreebreedinginHessen.AllgemeineForstzeitschrift1980，26:665–712；ZhuZ.T.,LinH.B.,KangX.Y.StudiesonallotriploidbreedingofPopulustomentosaB301clones.ScientiaSilvaeSinicae1995，31:499–505；ZhangS.,QiL.,ChenC.,LiX.,SongW.,ChenR.,HanS..AreportoftriploidPopulusofthesectionAigeiros.SilvaeGenetica2004，53:69–75；ZhangS.G.,ChenC.B.,HanS.Y.,LiX.L.,RenJ.Z.,ZhouY.Q.,SongW.Q.,ChenR.Y.,QiL.W.；ChromosomenumbersofsomePopulustaxafromChina.ActaPhytotaxonomicaSinica2005，43:539–544)。最直接获得三倍体杨树的途径是四倍体和二倍体杂交，所以诱导获得丰富的四倍体是杨树三倍体育种的必要前提之一。四倍体可以通过施加有丝分裂抑制剂诱导体细胞染色体加倍来获得(CaiX,KangXYInvitrotetraploidinductionfromleafexplantsofPopuluspseudo-simoniiKitag.PlantCellRep2011，30:1771–1778)。种子，茎尖，叶片，愈伤都可以用来诱导体细胞染色体加倍(K,S,KaczmarekZ.ImpactofcolchicineapplicationduringcallusinductionandshootregenerationonmicropropagationandpolyploidisationratesintwoMiscanthusspecies.InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Plant2010，46(2):161-171；ZhangQ,LuoF,LiuL,GuoFInvitroinductionoftetraploidsincrapemyrtle(LagerstroemiaindicaL.).PlantCellTissueandOrganCulture2010，101(1):41-47；TavanM,MirjaliliMH,KarimzadehGInvitropolyploidyinduction:changesinmorphological,anatomicalandphytochemicalcharacteristicsofThymuspersicus(Lamiaceae).PlantCellTissueandOrganCulture2015，122(3):573-583；XuC,HuangZ,LiaoT,etal.InvitrotetraploidplantsregenerationfromleafexplantsofmultiplegenotypesinPopulus.PlantCellTissueandOrganCulture,2015，1-9)。但是一个难点在于：四倍体诱导过程中的染色体加倍是单细胞事件，而施加秋水仙碱处理由多细胞组成的不定芽时，获得的往往是二倍体和四倍体组织混生的嵌合体。由于离体叶片培养产生的不定芽是单细胞起源，所以当离体叶片不定芽发生过程中有叶芽原基细胞形成时，施加理化处理使其染色体加倍，可以避免嵌合体的产生。在杨树中，蔡肖等首先将无菌苗叶片垂直于主脉一侧剪出两道伤口，分别接种含1.78μMBA和1.08μMNAA的培养基中，分别预培养0、6和12天后,放在秋水仙碱浓度分别为25、50和75μM的液体培养基(不含琼脂)中，然后处理24、48和72h。随后转到不含秋水仙碱的固体MS培养基(含1.78μMBA和1.08μMNAA的培养基)上，得到了离体叶片预培养6天后，在含75μM秋水仙碱浓度的液体培养基中处理3天可获得最高的四倍体得率的结论。(CaiX,KangXYInvitrotetraploidinductionfromleafexplantsofPopuluspseudo-simoniiKitag.PlantCellRep2011，30:1771–1778),该研究仅是针对单个基因型的青杨进行四倍体加倍，对于多基因型四倍体诱导并不能给出一般性的指导与建议。由于木本植物含有的基因数目极其庞大，因此当母本与父本杂交之后，所得到的子代中，每个子代所含的基因都是不同的，而每一个子代所有的基因加在一起就是一个基因型。即杂交后所获得的种子，每粒种子的基因型均不相同，每粒种子就是一个特定基因型的种子。基因型不同的植株在诱导过程中，其诱变效果各不相同，差异显著。现有诱导染色体加倍通常是以离体叶片培养时间来大概确定施加诱导剂的作用时间，但是由于不同基因型达到适宜诱导加倍时期所需的预培养时间是不同的，若仅通过预培养时间来确定何时施加诱导剂，会导致对多基因型进行四倍体诱导时，四倍体得率降低或产生大量的嵌合体，不利于高效率获得多基因型四倍体。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服现有杨树体细胞染色体加倍诱导技术所存在的不足，提供一种诱导杨树不定芽染色体加倍的方法，提高杨树四倍体诱导率，本发明方法根据离体培养叶片愈伤发育状态即时判别诱导杨树四倍体的适宜时期，诱导杨树体细胞加倍，增强施加诱导剂的时效性，获得杨树四倍体的比率显著提高，同时减少嵌合体的产生，对其他植物四倍体诱导等也具有重要借鉴意义。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：一种诱导杨树不定芽染色体加倍的方法，包括对外植体进行愈伤组织的分化培养后再对愈伤组织进行秋水仙碱诱导培养。其中，所述外植体选择杨树无菌苗叶片。特别是，所述外植体是将无菌苗叶片垂直于叶片主脉进行剪切并且剪切断主脉而成的叶片块。尤其是，所述叶片块的尺寸大小为(0.5±0.1)cm×(1±0.1)cm，优选为0.5cm×1cm。特别是，所述剪切后的叶片块沿着叶片主脉高度方向的长度为(0.5±0.1)cm；垂直于主脉方向的长度为(1±0.1)cm。尤其是，所述剪切后的叶片块沿着叶片主脉成轴对称结构。其中，所述无菌苗为杨树杂交子代无菌苗，母本是哲引3号杨(P.pseudo-simonii×P.nigra‘Zheyin3#’)，父本为北京杨(Populus×beijingensis)。其中，所述愈伤组织的分化培养是将外植体接种于叶片分化再生培养基中，进行愈伤组织分化培养，形成愈伤组织，其中所述叶片分化再生培养基为MS基本培养基+蔗糖3％+琼脂0.6％+6-BA0.4mg/L+NAA0.05mg/L。特别是，愈伤组织分化培养条件如下：培养温度为25±2℃，光照强度为1500-2000lux，光照周期为14-16小时光照/8-10小时黑暗，优选为培养温度为25±2℃，光照强度为2000lux，光照周期为14小时光照/10小时黑暗。其中，所述愈伤组织的秋水仙碱诱导培养是将愈伤组织转入到液体分化再生培养基中，进行愈伤组织的秋水仙碱诱导培养，愈伤组织体细胞染色体加倍，其中所述液体分化再生培养基为MS基本培养基+NAA0.05mg/L+6-BA0.4mg/L+蔗糖30g/L+秋水仙碱30-40mg/L，优选为MS基本培养基+NAA0.05mg/L+6-BA0.4mg/L+蔗糖30g/L+秋水仙碱30mg/L。特别是，所述愈伤组织秋水仙碱诱导培养条件如下：培养温度为25±2℃，黑暗下培养2-4天，优选为2-3天，进一步优选为3天。本发明另一技术方案为：一种诱导杨树不定芽染色体加倍的方法，包括如下顺序进行的步骤：1)将杨树无菌苗叶片剪切成无菌叶片块；2)将叶片块接种到叶片分化再生培养基中，进行愈伤组织分化培养，形成愈伤组织，在愈伤组织分化培养过程中，采用显微镜或放大镜观察离体外植体切口处愈伤组织的发育状态；3)在显微镜或放大镜观察离体叶片块切口处愈伤组织发育到第Ⅱ阶段时，将进行了愈伤组织分化培养后的离体叶片接种于液体分化再生培养基中，进行愈伤组织的秋水仙碱诱导培养，其中所述液体分化再生培养基为MS基本培养基+NAA0.05mg/L+6-BA0.4mg/L+蔗糖30g/L+秋水仙碱30-40mg/L；4)将秋水仙碱诱导培养2-4天后，将离体叶片取出并接种于不定芽再生培养基中，不定芽从叶片愈伤在中再生；5)将不定芽接种于生根培养基中，进行诱导生根培养，获得杨树再生植株。其中，步骤1)中所述无菌叶片块是将无菌苗叶片垂直于叶片主脉进行剪切，并且剪断主脉而成。特别是，所述叶片块的尺寸大小为(0.5±0.1)cm×(1±0.1)cm，优选为0.5cm×1cm。尤其是，所述剪切后的叶片块沿着叶片主脉高度方向的长度为(0.5±0.1)cm；垂直于主脉方向的长度为(1±0.1)cm。特别是，所述剪切后的叶片块沿着叶片主脉成轴对称结构。其中，步骤2)中所述叶片分化再生培养基为MS基本培养基+3％蔗糖+0.6％琼脂+0.4mg/L6-BA+0.05mg/LNAA。特别是，所述愈伤组织分化培养在以下条件下进行：培养温度为25±2℃，光照强度为1500-2000lux，光照周期为14-16小时光照/8-10小时黑暗，优选为培养温度为25±2℃，光照强度为2000lux，光照周期为14小时光照/10小时黑暗。特别是，步骤2)中采用体视显微镜观察离体外植体切口处愈伤组织的发育状态。其中，步骤3)中所述液体分化再生培养基为MS基本培养基+NAA0.05mg/L+6-BA0.4mg/L+蔗糖30g/L+秋水仙碱30-40mg/L，优选为MS基本培养基+NAA0.05mg/L+6-BA0.4mg/L+蔗糖30g/L+秋水仙碱30mg/L。特别是，所述愈伤组织秋水仙碱诱导培养在以下条件下进行：培养温度为25±2℃，黑暗下培养2-4天，优选为2-3天，进一步优选为3天。其中，步骤3)中所述愈伤组织发育阶段Ⅱ是离体叶片在叶片分化再生培养基中进行愈伤组织分化培养过程中，离体叶片切口处形成的愈伤组织宽度>0mm，且≤1mm的阶段。特别是，所述愈伤组织的宽度为沿着离体培养叶片横切面的方向测量的宽度。尤其是，采用不锈钢数显卡尺(0-150mm)测定离体叶片上的愈伤组织宽度。特别是，步骤3)中采用体视显微镜观察离体外植体切口处愈伤组织的发育状态。其中，步骤4)中所述不定芽再生培养基为MS基本培养基+NAA0.05mg/L+6-BA0.4mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L。特别是，所述不定芽再生培养在以下条件下进行：培养温度为25±2℃，光照强度为1500-2000lux，光照周期为14-16小时光照/8-10小时黑暗，优选为培养温度为25±2℃，光照强度为2000lux，光照周期为14小时光照/10小时黑暗。尤其是，不定芽再生培养时间为40±2天。特别是，还包括步骤4A)将在液体分化培养基中进行愈伤组织秋水仙碱诱导培养后的离体叶片先用无菌水清洗至少3次，再用无菌滤纸吸干离体叶片切口处愈伤组织表面的无菌水后，再接种于不定芽的再生培养基中，进行不定芽再生培养。其中，步骤5)中所述生根培养基为1/2MS基本培养基+IBA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L。特别是，所述不定芽生根培养在以下条件下进行：培养温度为25±2℃，光照强度为1500-2000lux，光照周期为14-16小时光照/8-10小时黑暗，优选为培养温度为25±2℃，光照强度为2000lux，光照周期为14小时光照/10小时黑暗。特别是，将大于1cm的不定芽接种于生根培养基中，进行所述的诱导生根培养。观察离体培养叶片切口处愈伤组织发育状况；当离体培养叶片切口处刚形成可见的愈伤组织(用OlympusSZX12体视显微镜观察)，即愈伤组织宽度≤1mm，且>0mm(用不锈钢数显卡尺(0-150mm)沿着离体培养叶片横切面的方向测量愈伤组织宽度，为施加秋水仙碱溶液处理诱导体细胞染色体加倍的有效时期。所述愈伤组织诱导培养处理：在离体培养叶片切口愈伤组织刚刚形成，即愈伤组织宽度>0mm且≤1mm时，把叶片转移到添加了秋水仙碱液体分化再生培养基MS基本培养基+NAA0.05mg/L+6-BA0.4mg/L+蔗糖30g/L+秋水仙碱30-40mg/L)中，浸泡2-4天。(实验处理均在25-27℃的无菌操作间进行)。与现有技术相比，本发明的优点具体如下：1、本发明对离体培养叶片切口处愈伤发育状态用体式显微镜或放大镜进行观察，并根据离体培养叶片愈伤发育状态来判别芽原基开始分化的时期，并即时对这个阶段的叶片愈伤组织进行诱导分化培养处理；杨树四倍体植株的诱导效率高，几乎不产生嵌合体。2、本发明通过对离体培养叶片切口处愈伤组织的观察，在离体培养叶片切口处愈伤状态是刚有透明的愈伤组织形成，且愈伤组织宽度小于1mm时，进行愈伤组织诱导分化培养，可显著提高杨树四倍体的诱导率。3、本发明克服了现有诱变加倍以外植体离体培养时间来确定施加诱导剂进行诱导分化的技术缺陷，根据体式显微镜或放大镜的观察，以离体培养过程中愈伤组织发育状态为技术指标，指导施加诱导剂进行愈伤组织诱导分化培养的合适时机，不仅显著提高杨树四倍体的诱导率，而且还增强了施加诱导剂的时效性，同时减少嵌合体的产生，并且可以节约诱导试剂。4、本发明通过外植体离体培养的愈伤组织形态的变化来判别不同基因型体细胞染色体加倍处理的合适时期，提高了染色体加倍诱导处理时机的精确性，实现体细胞染色体加倍有效处理时期即时判别，对处于最适宜秋水仙碱诱导时期的愈伤组织外植体进行培养，这为提高四倍体诱导效果奠定基础。5、本发明方法可以即时判断外植体愈伤组织染色体诱导加倍的精确时机，建立高效诱导染色体加倍尤其是杨树四倍体选育方法。从而使杨树四倍体加倍的效率不会受到培养环境或基因型的影响，为进行杨树多基因型四倍体诱导奠定了重要的方法基础。6、对于杨树四倍体的方法，最新的方法是通过离体叶片定量的预培养时间来寻求最佳的诱导时间，但是通过在定量预培养时间进行诱导，有些基因型获得四倍体得率低且伴随有嵌合体的产生，有些基因型甚至没有四倍体的产生。这种方法不仅费钱，费时而且效果也不理想。所以用离体叶片定量的预培养时间来指导杨树四倍体的诱导显然不能满足多基因型的大群体四倍体育种；另外，根据预培养时间进行诱导培养四倍体容易受到外界环境的影响(如培养的温度，光照，培养基的成分)，不同基因型的诱导效果差异非常显著，而本发明方法避免了诱导过程中外界环境的变化和基因型不同带来的影响，适用于杨树所有基因型的诱导加倍，只要在外植体愈伤组织发育的第Ⅱ阶段进行诱导处理，四倍体诱导率高，无嵌合体产生。本发明方法实际是一种诱导杨树不定芽染色体加倍的方法，明确以离体培养叶片切口处愈伤组织发育状态为指示，当切口处愈伤组织刚刚形成，且愈伤组织宽度小于1mm时，转入到添加了秋水仙碱的液体分化培养基进行诱导培养处理，可显著提高杨树四倍体的诱导率，增强施加诱导剂的时效性，同时减少嵌合体的产生，并且可以节约诱导试剂等。本发明方法可以即时判别诱导杨树四倍体的合适时期，并实时进行诱导加倍处理，属于细胞工程组织培养
技术领域：
。该方法通过对离体培养叶片的愈伤发育状态的观察，从而即时判别施加秋水仙碱溶液处理离体培养叶片诱导杨树四倍体适宜时期，即当离体培养叶片切口处开始有愈伤形成，且愈伤组织宽度小于1mm时，即芽原基细胞开始分化，细胞排列疏松的时期施加秋水仙碱可有效进行体细胞染色体加倍，获得四倍体植株的效率高。附图说明图1为杨树离体培养叶片切口处愈伤组织达到阶段Ⅱ时显微镜观察图。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1一、试验材料1、本发明以北京杨(Populus×beijingensis)×哲引3号杨(P.pseudo-simonii×P.nigra‘Zheyin3#’)的杂交子代无菌苗为例，随机选取15个基因型(分别命名为G1,G2,G3,G4,G5，E1，E2，E3，E4，E5，E6，E7，E8，E9，E10)无菌苗叶片为外植体建立不定芽诱导技术体系。2、植物生长调节剂本发明中所使用的植物生长调节物质采用α-萘乙酸(NAA)，6-苄氨基嘌呤(6-BA)、吲哚-3-丁酸(IBA)。3、培养基的配制：(1)“MS基本培养基”的组成或配制方法；表1MS培养基(MurashigeandSkoog，1962)上述MS培养基母液配好后，储存于4℃冰箱待用。根据配置培养基的数量，称量所需琼脂和蔗糖，将其倒入欲配培养基体积3/4的无菌水中，顺序加入所需的大量元素母液、微量元素母液和有机成分母液，每加入一种都充分搅拌，最后加水定容至培养基最终体积，用pH计测试培养基酸碱度，用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl将pH值调整至5.8-6.2。(2)叶片分化再生培养基(即固体MS分化培养基)：MS基本培养基添加NAA0.05mg/L、6-BA0.4mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L，调节pH值为5.8-6.2，培养基在121℃下恒温灭菌15分钟。(3)液体分化再生培养基(即液体MS分化培养基)：MS基本培养基添加NAA0.05mg/L、6-BA0.4mg/L蔗糖30g/L、秋水仙碱30-40mg/L，调节pH值5.8-6.2。培养基在121℃下恒温灭菌15分钟。(4)不定芽再生培养基(固体MS再生培养基)：MS基本培养基添加NAA0.05mg/L、6-BA0.4mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L，调节pH值为5.8-6.2，培养基在121℃下恒温灭菌15分钟。(5)生根培养基：1/2MS基本培养基添加IBA0.5mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L，调节pH值为5.8-6.2，培养基在121℃下恒温灭菌15分钟。实施例2外植体愈伤组织观察1、愈伤组织分化培养分别将5个基因型(G1,G2,G3,G4,G5)无菌苗叶片垂直于主脉剪切、并剪断通过主脉，剪切后的叶片块沿着主脉高度方向的长度为0.5cm，垂直于主脉方向的长度为1.0cm，且形成的叶片块基本沿着叶片主脉成轴对称结构；将剪成0.5cm×1.0cm的叶片块，接着将剪切后的叶片方块分别平铺到装有50mL的固体MS分化培养基(3％蔗糖，0.6％琼脂，0.4mg/L6-BA，0.05mg/LNAA)的培养皿(直径为9cm)中，进行愈伤组织的分化培养；其中，分化培养条件如下：培养温度为25±2℃，光照为2000lx，光照周期为14h光/10h暗。通常：为了使秋水仙碱溶液更好的浸入叶片，需要将叶片剪成尺寸为(0.5±0.1)cm×(1±0.1)cm的叶片块，即叶片块沿着主脉高度方向的长度为(0.5±0.1)cm；垂直于主脉方向的长度为(1±0.1)；通常优选为0.5cm×1cm的块状；并且剪切成的叶片块沿着叶片主脉基本成轴对称结构。每个处理分3个皿，共接种15个外植体，重复3次。2、愈伤组织的显微镜观察在愈伤组织分化培养过程中将不同基因型的离体培养叶片块分别置于体视显微镜(OlympusSZX12)下观察，记录五个基因型的离体培养叶片切口处的愈伤组织发育状态以及离体培养叶片切口发育到不同阶段所需要培养的时间。其中：离体培养叶片切口愈伤的形态以及对应的细胞学发育特征如表2；离体培养叶片切口状态发育到不同阶段的时间如表3。离体培养叶片切口处的愈伤组织发育进程划分为5个阶段，分别为：阶段Ⅰ：没有愈伤形成；阶段Ⅱ：切口边缘出现少量的愈伤组织；阶段Ⅲ：愈伤快速生长的阶段，大量的愈伤组织形成；阶段Ⅳ：愈伤组织缓慢生长，有微小的颗粒出现，阶段V：愈伤组织的颜色变为灰色，在上面有不定芽形成。表2离体培养叶片切口愈伤的形态以及对应的细胞学发育特点本发明将离体叶片切口处从没有愈伤到开始形成愈伤组织再到再生出不定芽的这一过程，按愈伤组织的发育状态划分成五个阶段并对这五个阶段进行细胞学观察，这能够准备对五个阶段进行准确的判别，如表2。表3五个基因型的离体培养叶片切口状态发育到不同阶段的时间(天)记录基因型阶段Ⅰ(天)阶段Ⅱ(天)阶段Ⅲ(天)阶段Ⅳ(天)阶段Ⅴ(天)E1-G10-23-3.54.5-68-1013.5-15E1-G20-45-5.56-710.5-1216-19E1-G30-55.5-6.56.5-89-1120-23E1-G40-78-99-10.513-15.526-28E1-G50-33.5-45.5-78-915-183、愈伤组织固定、石蜡制片及显微镜观察对5个基因型离体叶片的每个阶段的叶片愈伤组织的形态学特征用体视显微镜(OlympusSZX12)来拍摄记录，并将分别处于如表1所述的5个发育阶段的离体叶片分别置于4℃的FAA固定液(5mL38％甲醛+5mL冰醋酸+90mL50％乙醇)中固定24h；接着按常规石蜡制片，切片厚8um，切片用铁矾-苏木精染色；然后将各个阶段的愈伤组织切片均在OlympusBX-51显微镜下观察并拍摄。从五个阶段的愈伤组织切片中，可以观察到芽原基形成及发育的过程。表明离体培养叶片切口愈伤组织的发育状态与芽原基的发育进程存在密切的关系(表1)。采用本领域人员所习知或熟悉的技术进行所的常规石蜡切片。离体叶片固定，石蜡切片等方法或技术均为本领域人员所习知或熟悉的常规技术。采用FAA固定的目的和作用：迅速杀死离体培养叶片切口处的愈伤组织，使其形态结构尽可能保持在接近生活时的状态，能显示其原来的细微结构。本发明对愈伤组织进行FAA固定处理：及对离体培养叶片切口处的5个不同发育阶段的愈伤组织进行固定后，能分析不同愈伤形态对应的细胞学发育特点，明确了离体叶片施加秋水仙碱处理诱导体细胞染色体加倍的有效时期以及这个时期的具体细胞学特征。实施例3外植体愈伤组织诱导1、愈伤组织培养分别将5个基因型(G1,G2,G3,G4,G5)无菌苗叶片垂直于主脉剪切并且剪断主脉，剪切后的叶片块沿着主脉高度方向的长度为0.5cm，垂直于主脉方向的长度为1.0cm，且形成的叶片块基本沿着叶片主脉成轴对称结构；将叶片剪成0.5cm×1.0cm的叶片块，接着将剪切后的叶片块平铺到装有50mL的叶片分化再生培养基(即固体MS分化培养基：MS基本培养基，3％蔗糖，0.6％琼脂，0.4mg/L6-BA，0.05mg/LNAA)的培养皿(直径为9cm)中，进行愈伤组织的分化培养；其中，分化培养条件如下：培养温度为25±2℃，光照为2000lx，光照周期为14h光/10h暗。每个处理分3个皿，共接种15个外植体，重复3次。2、愈伤组织秋水仙碱诱导处理在愈伤组织分化培养过程中将5种不同基因型的离体培养叶片块分别置于体视显微镜(OlympusSZX12)下观察(即每个基因型有3个培养皿，每个皿放5片离体叶片块，在预培养的过程中，将密封好的培养皿放置在体式显微镜观察台上观察离体叶片块切口处愈伤发育状态)，并用不锈钢数显卡尺(0-150mm)沿着离体培养叶片横切面的方向进行测量愈伤组织的宽度，将5种基因型离体叶片的分别处于5种愈伤组织发育状态的离体培养叶片分别置于液体分化再生培养基(即液体MS分化培养基：MS基本培养基，3％蔗糖，BA0.4毫克/升,NAA0.05毫克/升，秋水仙碱30mg/L)中，进行秋水仙碱处理，即进行愈伤组织的秋水仙碱诱导培养，即将5个基因型的分别处于5种愈伤组织发育状态的离体培养叶片分别浸泡于添加了30mg/L秋水仙碱的液体MS分化培养基(3％蔗糖，BA0.4毫克/升,NAA0.05毫克/升)中，在黑暗条件下浸泡3天，进行愈伤组织秋水仙碱诱导培养，其中愈伤组织秋水仙碱诱导培养条件如下：培养温度为25±2℃，黑暗处理3天。3、不定芽再生培养将诱导培养后的离体叶片从液体分化再生培养基中取出，先用无菌水清洗外植体3次，再用无菌滤纸吸干外植体表面的液体；接着将其转入不含秋水仙碱的固体MS再生培养基(即不定芽再生培养基：MS基本培养基，3％蔗糖，0.6％琼脂，BA0.4毫克/升,NAA0.05毫克/升)中，进行不定芽的再生培养，培养条件如下：培养温度为25±2℃，光照为2000lx，光照周期为14h光/10h暗。经过40±2天培养后，不定芽从叶片愈伤中再生。每个处理分3个皿，共接种15个外植体，重复3次。4、生根培养选取单个大于1厘米的不定芽芽转入生根培养基(1/2MS+3％蔗糖，0.6％琼脂+IBA0.5mg/L)中，进行诱导生根培养，诱导生根培养的培养条件如下：培养温度为25±2℃，光照为2000lx，光照周期为14h光/10h暗。诱导生根培养30天之后，获得杨树再生植株。5、倍性分析、染色体倍数确认采用流式细胞仪分析再生植株的倍性，然后用根尖压片显微镜观察确定染色体的数目，具体操作步骤如下：5-1)流式细胞仪分析再生植株倍性5-1A)将诱导生根培养获得的再生植株在无菌操作台里剪取长度大于1cm的组培苗顶端，只留顶端两片叶子其余全部剪掉后，接种于新的生根培养基(1/2MS+3％蔗糖，0.6％琼脂+IBA0.5mg/L)中再次诱导生根。再生植株剩余部分剪成大于1cm的带单芽茎段，接种于叶片分化再生培养基中，继续分化形成的不定芽，将第4次继代苗培养到30天时，剪取顶端的第2、3片幼嫩叶作为检测材料，叶片被锋利的刀片垂直切割成2mm×2mm小块后，加入1mL裂解液(45mMMgCl2·6H2O，20mMMOPS,30mM柠檬酸钠，0.1％TritonX-100；pH7.0)，用40um孔径的塑料滤网过滤，向收集到的滤液中加入80uL浓度为5ug/mL的DAPI溶液后使用流式细胞仪【Ploidyanalyser(Patec)】进行检测。5-1B)以二倍体杂种子代苗上的幼叶作为调节流式细胞仪的标样，即将二倍体杂种子代苗上的幼叶垂直切割成2mm×2mm小块后加入裂解液，过滤，向滤液中加入5ug/mL的DAPI溶液，然后使用流式细胞仪进行检测，通过调节上样电压和光电倍增管灵敏度调节标样出峰的位置，峰值设为50。再生植株用流式细胞仪上样检测后，若峰值为50，则为二倍体；峰值为100，则为四倍体；若为双峰，峰值分别为50，100，则为嵌合体；5-2)根尖压片法计数根尖细胞染色体数目5-2A)将分析植株倍性后的二倍体杂种子代苗的根尖在质量分数0.2％的秋水仙素溶液中处理3h，接着用蒸馏水洗3次后置于卡诺固定液于4℃下(无水乙醇：醋酸＝3:1)固定24h，然后取出根尖置于1N盐酸溶液中，于60℃下解离10min后用蒸馏水中清洗10min；最后用解剖刀切取根尖0.5mm左右的分生区组织，用镊子夹取放置在干净的载玻片上，滴入改良苯酚染色，并使根尖细胞在载玻片上充分的散开后用OlympusBX51显微镜观察并拍照，记录根尖细胞染色体数量。5-2B)将步骤5-1A)中分析植株倍性为四倍体后的再生植株的叶片接种于生根培养基(1/2MS+3％蔗糖，0.6％琼脂+IBA0.5mg/L)中，继续培养，取7-10天的根尖，将其在质量分数0.2％的秋水仙素溶液中处理3h，接着用蒸馏水洗3次后置于卡诺固定液于4℃下(无水乙醇：醋酸＝3:1)固定24h，然后取出根尖置于1N盐酸溶液中，于60℃下解离10min后用蒸馏水中清洗10min；最后用解剖刀切取根尖0.5mm左右的分生区组织，用镊子夹取放置在干净的载玻片上，滴入改良苯酚染色，并使根尖细胞在载玻片上充分的散开后用OlympusBX51显微镜观察并拍照，记录根尖细胞染色体数量。显微镜观察根尖染色体数目与流式细胞仪倍性分析完全一致，根尖压片法计数染色体数目为2n＝4x＝76。四倍体及嵌合体的数量统计结果如表4。表4不同切口愈伤发育阶段施加秋水仙碱对五种基因型杂种子代的四倍体和嵌合体诱导率注明：五种基因型的杨树杂种子代在愈伤发育阶段I，Ⅳ，Ⅴ施加秋水仙碱时四倍体以及嵌合体得率均为0。从表4的实验结果可知：施加秋水仙碱处理的最佳时期为愈伤发育阶段Ⅱ(愈伤组织的宽度≤1mm，且>0mm)，即切口处分化为一团活跃分裂的细胞，细胞排列疏松，细胞核清晰可见的时期。当离体培养叶片切口处开始形成可见的少量愈伤组织(愈伤组织的宽度≤1mm，且>0mm时，如图1)，即芽原基细胞开始分化，细胞排列疏松，细胞核清晰可见的时期为最佳处理时期，也就是在愈伤组织发育到第Ⅱ阶段时，将叶片浸泡在施加30-40mg/L的秋水仙碱的液体分化培养基中，浸泡2-4天，可取的较好的四倍体诱导效果。关于愈伤组织宽度：用不锈钢数显卡尺(0-150mm)沿着离体培养叶片横切面的方向测量愈伤组织宽度，当愈伤组织的宽度≤1mm，且>0mm时，是施加秋水仙碱溶诱导体细胞染色体加倍的有效时期。在进行离体培养叶片体细胞染色体加倍时，需要考虑染色体加倍的处理时机。由于基因型不同也是产生愈伤发育状态不同步性的重要原因，不同基因型的青杨杂种子代无菌苗获得的染色体加倍最佳处理条件并不相同。本发明中在5个基因型的青杨杂种离体培养叶片愈伤组织发育状态与四倍体诱导效果关系研究中，发现无论是何种基因型，当离体培养叶片愈伤状态发育至阶段II时，即切口开始有愈伤形成，且愈伤组织宽度小于1mm时，最适合对离体培养叶片进行体细胞染色体加倍诱导四倍体。愈伤组织发育状态过早或过晚于该时期进行染色体加倍处理，均难以获得较好的四倍体诱导效果，甚至难以获得四倍体。本发明方法确定了杨树四倍体诱导时期的即时判别，诱导杨树不定芽染色体加倍，有效解决以往体细胞染色体加倍容易产生混倍体的问题，提高四倍体诱导效率和效果，而且可以降低染色体加倍处理的工作量，对于杨树乃至类似植物多倍体育种具有重要的参考价值。实施例4外植体愈伤组织诱导除了步骤2)愈伤组织秋水仙碱诱导处理步骤中，5个基因型的分别处于5种愈伤组织发育状态的离体培养叶片分别浸泡于添加了40mg/L秋水仙碱的液体MS分化培养基(3％蔗糖，BA0.4毫克/升,NAA0.05毫克/升)中，在黑暗条件下浸泡2天，进行愈伤组织秋水仙碱诱导培养，即将5种基因型离体叶片的分别处于5种愈伤组织发育状态的离体培养叶片分别置于液体分化再生培养基(即液体MS分化培养基：MS基本培养基，3％蔗糖，BA0.4毫克/升,NAA0.05毫克/升，秋水仙碱40mg/L)中，进行秋水仙碱处理，即进行愈伤组织的秋水仙碱诱导培养2天之外，其余与实施例3相同。采用流式细胞仪分析再生植株的倍性；采用根尖压片法确认再生植株根尖细胞染色体数目，二者分析结果完全一致，四倍体及嵌合体的数量统计结果如表5。表5不同切口愈伤发育阶段施加秋水仙碱对五种基因型杂种子代的四倍体和嵌合体诱导率注明：五种基因型的杨树杂种子代在愈伤发育阶段I，Ⅳ，Ⅴ施加秋水仙碱时四倍体以及嵌合体得率均为0。表5的实验结果与表4的实验结果相一致。施加秋水仙碱处理的最佳时期为愈伤发育阶段Ⅱ(愈伤组织的宽度≤1mm，且>0mm)，即切口处分化为一团活跃分裂的细胞，细胞排列疏松，细胞核清晰可见的时期。当离体培养叶片切口处开始形成可见的少量愈伤组织(愈伤组织的宽度≤1mm，且>0mm时，如图1)，即芽原基细胞开始分化，细胞排列疏松，细胞核清晰可见的时期为最佳处理时期，也就是在愈伤组织发育到第Ⅱ阶段时，将叶片浸泡在施加30-40mg/L的秋水仙碱的液体分化培养基中，浸泡2-4天，可取的较好的四倍体诱导效果。实施例5外植体愈伤组织诱导1、愈伤组织培养分别将10个基因型(E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、E10)无菌苗叶片垂直于主脉剪切并且剪断主脉，剪切后的叶片块沿着主脉高度方向的长度为0.5cm，垂直于主脉方向的长度为1.0cm，且形成的叶片块基本沿着叶片主脉成轴对称结构；将叶片剪成尺寸约为0.5cm×1.0cm的叶片块后，将剪切后的叶片块分别平铺到装有50mL的固体MS分化培养基(MS基本培养基，3％蔗糖，0.6％琼脂，0.4mg/LBA，0.05mg/LNAA)的培养皿(直径为9cm)中，进行愈伤组织的分化培养；其中，分化培养条件如下：培养温度为25±2℃，光照为2000lx，光照周期为14h光/10h暗。每个处理分3个皿，共接种15个外植体，重复3次。2、愈伤组织的秋水仙碱诱导处理在体视显微镜观察指导下，显微镜下观察到10个基因型外植体的叶片切口处愈伤组织发育至阶段II时(即离体培养叶片横切面方向愈伤组织宽度>0mm，且≤1mm时)，将叶片上愈伤组织发育至阶段II时的离体培养叶片分别接种至液体分化再生培养基(即液体MS分化培养基：MS基本培养基，3％蔗糖，BA0.4毫克/升,NAA0.05毫克/升，秋水仙碱30mg/L)中，即将离体培养叶片浸泡于添加了30mg/L秋水仙碱的愈伤组织诱导分化培养基(即液体MS分化培养基)中，进行愈伤组织的秋水仙碱诱导培养，其中诱导培养条件如下：培养温度为25±2℃，黑暗处理3天。本发明愈伤组织秋水仙碱诱导培养时间除了黑暗条件下浸泡3天之外，浸泡2-4天也适用于本发明。3、不定芽再生培养取出秋水仙碱诱导培养3天后的离体叶片，先用无菌水清洗外植体3次，再用无菌滤纸吸干离体叶片愈伤组织表面的液体；然后将其转入不含秋水仙碱的固体MS再生培养基(即不定芽再生培养基：MS基本培养基，3％蔗糖，0.6％琼脂，BA0.4毫克/升,NAA0.05毫克/升)中，也就是将吸干表面液体的外植体接种与不定芽再生培养基中，进行不定芽的再生培养，培养条件如下：培养温度为25±2℃，光照为2000lx，光照周期为14h光/10h暗。经过40±2天培养后，不定芽从叶片愈伤中再生。4、生根培养选取单个大于1厘米的不定芽转入生根培养基(1/2MS+3％蔗糖，0.6％琼脂+IBA0.5mg/L)中，进行诱导生根培养，诱导生根培养的培养条件如下：培养温度为25±2℃，光照为2000lx，光照周期为14h光/10h暗。诱导生根培养30天之后，获得杨树再生植株。5、倍性分析、染色体倍数确认参照实施例3步骤5中的操作步骤、操作条件，采用流式细胞仪分析再生植株的倍性，然后采用显微镜下根尖压片法来确定染色体的数目。对四倍体及嵌合体的数量进行统计，四倍体植株的根尖染色体数目与流式细胞仪倍性分析的四倍体再生植株完全一致，实验结果如表4。表4十个基因型杨树杂种子代在离体叶片切口处愈伤发育至第二阶段施加秋水仙碱诱导处理的结果由表4的统计结果可知：10个基因型杂交子代的叶片在阶段Ⅱ施加秋水仙碱处理，再生植株四倍体诱导率高，均获得了四倍体且没有嵌合体的产生。当前第1页1 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