本发明涉及生物材料学技术领域，具体涉及一种功能化的含银碳点的制备方法，以及该碳点在抑菌方面的应用。
背景技术：
由病原微生物引起的传染性疾病阻碍动植物正常生长繁殖，导致作物减产，动物患病，危害人类的身体健康。随着耐药菌的不断涌现，传统的抗菌类药物在卫生防预和疾病治疗方面面临着越来越严峻的挑战，人们对高效抗菌材料的需求日益迫切。
由于纳米材料具有广谱的杀菌性质，优良的抗菌性能，病原微生物难以对纳米材料产生抗药性，近年来，纳米材料被广泛地应用到抗菌领域。其中以纳米银抗菌剂应用最为广泛，纳米银抗菌剂因其极强的杀菌和抑制病原体的能力，常用于抗菌制品中。但纳米银也存在一些固有的缺陷，如暴露在空气中不稳定，易氧化，久置容易变色等，如金属离子型抗菌剂中ag的抗菌性能最强，但其易变色，成本高，抗菌性不稳定。银系抗菌剂中银的化学性质特别活泼，对光和热比较敏感，银离子很容易转变成棕色的氧化银，在紫外光的作用下变成黑色的单质银，出现变色问题(即耐候性)，严重影响着银系抗菌剂在白色或者其浅色制品中的应用。因此，寻找一种新的纳米材料应用于抗菌是人类亟需解决的重大议题。
量子点是一种尺寸在1-100nm之间特殊的纳米颗粒。目前，已有课题组将cd类量子点应用于抗菌方面的研究，他们认为可能的抗菌机制是cd类量子点中cd离子的毒性以及其表面产生的自由基改变了细胞膜渗透性进而促进了细菌死亡。然而cd类量子点生物相容性差，碳点因其良好的生物相容性在药物传递、医学诊断、双光子成像、离子检测和催化领域等应用中逐渐显示出了取代常规量子点的潜力。但是碳点在抗菌方面的应用，鲜有课题组涉及。本发明提出一种功能化的掺银碳点，其生物相容性良好，抑菌性能优异。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种原料便宜易得、操作简单环保、量子产率高的碳点的制备方法；另一目的是提供一种功能化碳点，具有较强的抑菌(细菌、真菌)作用，在空气中稳定等特性；本发明的再一目的是提供上述碳点在制备抗菌剂方面的应用，自身抗菌效果好，与抗菌药物配合后抗菌效果更佳。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
一种含银碳点的制备方法，其制备步骤如下：
(1)在惰性气体保护下将聚乙酰亚胺(pei)、硝酸银和柠檬酸溶于水中搅拌得混合溶液a，混合溶液a转入高压反应釜或微波反应釜中加热反应，反应结束后即得pei-ag碳点溶液；或者，
在惰性气体保护下将聚乙酰亚胺和柠檬酸溶于水中搅拌得到混合溶液b，混合溶液b转入高压反应釜或微波反应釜中加热反应，反应结束后的溶液中加入硝酸银，在惰性气体保护下搅拌均匀，得到pei-ag碳点溶液；
高压反应釜内的反应条件为140-220℃反应30min-5h，微波反应釜内的反应条件为140-220℃反应5-60min；
(2)pei-ag碳点溶液与有机溶剂混合，离心去除上清液，干燥；或者，pei-ag碳点溶液直接置于超滤离心管中，离心去除下层溶液，干燥；即得固体pei-ag碳点；
所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、二甲亚砜、乙酸乙酯、四氢呋喃或异丙醇。这几种有机溶剂都可以与水互溶，方便后期的分离。
上述方法，所用原料都是无毒无害的，并且整个反应的溶剂都是水，对环境没有危害。反应过程中，反应物容易被空气所氧化，所以需要惰性气体保护。一般会将溶液倒在高压反应釜中，然后将高压反应釜置于已经到达一定温度的电热鼓风干燥箱中，一般我们设定的反应温度是高于100℃，如果不用高压反应釜，水会被蒸发掉。并且高温高压有利于碳点的合成。微波反应釜同样也是装载溶液的容器，将反应的溶剂倒入微波反应釜中，置于微波消解仪中，然后设定反应的时间及温度。温度设为140-220℃是比较合适的，温度太高或者太低，都不利于碳点的合成。反应所得到的溶液，其中可能含有没有反应完的原料，通过将碳点溶液与有机试剂相混合，离心后，下层为碳点，上层为没有反应完的原料。通过与有机溶剂混合，可有效去除没有反应完的原料。
经过检测，上述方法制备的含银碳点，在碳点合成后的5天，10天，15天，30天，60天测量其荧光强度，基本没有变化，并且碳点溶液的颜色也没有变化，表明所得的含银碳点具有良好的稳定性。
优选地，反应容器为微波反应釜。在最佳合成条件下，使用微波合成的碳点的量子产率高于水热合成的碳点的量子产率。于是，优选反应容器为微波反应釜。
优选地，最佳的反应温度及时间为200℃、30min。将微波反应釜置于微波消解仪器中，然后设定反应温度及反应时间。在200℃、30min的条件下，合成的碳点的量子产率是最高的。
作为其中一种优选方案，上述制备方法中，所述步骤(1)的原料加入顺序为：
将聚乙酰亚胺、柠檬酸和硝酸银同时溶于水中，搅拌20min后，得混合溶液a；或者，
先将聚乙酰亚胺和柠檬酸溶于水中，搅拌20min后，再加入硝酸银继续搅拌20min，得混合溶液a；或者，
先将聚乙酰亚胺与硝酸银溶解于水中，搅拌20min，再加入柠檬酸继续搅拌20min，得混合溶液a。
加入顺序的不同会影响碳点的量子产率。搅拌时间为20min时，合成的碳点的量子产率是最高的，而当继续增加搅拌时间时，碳点的量子产率基本没有增加，因此，我们选择搅拌时间为20min。
作为其中一种优选方案，上述制备方法中，所述聚乙酰亚胺和柠檬酸的加入量按质量比为1:1-20，硝酸银配制成0.1mol/l的储备液使用，加入量为每0.1g聚乙酸亚胺对应加入储备液不超过100μl。柠檬酸过多或过少，均不利于高量子产率碳点的合成。硝酸银容易氧化，所以将其配置成溶液，避光保存。
更优选地，上述制备方法中，所述聚乙酰亚胺和柠檬酸的加入量按质量比为：1:5，硝酸银储备液加入量为每0.1g聚乙酸亚胺对应加入储备液50μl。在该配比下，所合成的碳点的量子产率是最高的。
作为其中一种优选方案，上述制备方法中，所述聚乙酰亚胺的分子量为600、1800、10000或70000。聚乙酰亚胺可直接购买市售商品。
更优选地，所述聚乙酰亚胺的分子量为1800。聚乙酰亚胺为1800时，所合成碳点的量子产率最高。
优选地，上述方法中，超滤离心管的规格为3kd、10kd、30kd、50kd、100kd；离心使用的转速为5000-15000rmp，运作的时间为5-30min；所述的干燥的方法为用惰性气体(氮气或氩气)吹干、冷冻干燥、真空干燥。
作为其中一种优选方案，上述制备方法中，所述pei-ag碳点溶液与有机溶剂的体积比为1:2-10。有机溶剂过多过少，均不利于碳点的沉淀。
更优选地，上述制备方法中，所述最佳的有机溶剂为甲醇，pei-ag碳点溶液与甲醇的最佳体积比为1:5。甲醇可以最大程度的将碳点离心下来，当甲醇加入较少时，碳点只有少部分能沉淀下来，体积比为1:5时，使碳点能最大程度地沉淀下来。
以上任一方法制备获得的碳点也在本发明的保护范围内，所述碳点为pei-ag碳点。
本发明还提供了上述任一方法制备的含银碳点在制备抗菌剂中的应用，碳点单独作为有效成分，或者碳点与抗菌药物联合作为有效成分。
所述的抗菌药物优选为四环素、庆大霉素、头孢西丁、氨苄西林、罗红霉素、氧氟沙星、两性霉素、克霉唑、氟康唑、酮康唑中的一种或几种。所抵抗或抑制的微生物菌包括细菌和/或真菌，例如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌等菌。
本发明的技术方案具备以下有益效果：
1、pei-ag碳点具有良好的光稳定性，制备方法具有高的量子产率，成本低，适用于工厂大规模生产。
2、pei-ag碳点单独作用，就可以有效抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌等菌的生长，抑菌功能强。
3、将pei-ag碳点与多种抗菌药物协同使用对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌等菌均有明显的抑菌作用(两者协同的抑菌效果强于单独一种药物的效果)，并且可以减小抗菌药物的使用浓度，避免抗菌药物的滥用对自然环境的危害。
4、在之前的方法中，pei碳点的量子产率为45％左右，而本发明的方法合成pei-ag碳点的量子产率为55％左右，高于现有方法。
附图说明
图1为实施例1制备的pei-ag碳点溶液对大肠杆菌抑菌效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
培养基配方：
mh肉汤液体培养基：称取2.1g肉汤于锥形瓶中，加100ml超纯水使其混合均匀。将锥形瓶置于灭菌锅里121℃灭菌15min，即得mh肉汤液体培养基。
改良马丁液体培养基：称取2.85g改良马丁于100ml的锥形瓶中，加100ml超纯水使其混合均匀。将锥形瓶置于灭菌锅里121℃灭菌15min，即得改良马丁液体培养基。
lb固体培养基：称取1.0g蛋白胨粉末、0.5g酵母提取物、1.0gnacl、1.5g琼脂于锥形瓶中，加100ml超纯水使其混合均匀。将锥形瓶置于灭菌锅里121℃灭菌15min，即得lb固体培养基。
lb液体培养基：称取1.0g蛋白胨粉末、0.5g酵母提取物、1.0gnacl于100ml的锥形瓶，加100ml超纯水使其混合均匀。将锥形瓶置于灭菌锅里121℃灭菌15min，即得lb液体培养基。
实施例1
(1)称取0.1gpei(分子量为1800)，0.5g柠檬酸于50ml的圆底烧瓶中，紧接着注入50μl0.1mol/l的硝酸银，再加入30ml的超纯水使其混合均匀，在氮气的保护下搅拌20min后得混合溶液。
(2)将步骤(1)得到的混合溶液转入微波反应釜中加热到200℃，反应30min，即可得到pei-ag碳点溶液。
(3)将步骤(2)得到的pei-ag碳点溶液与甲醇按1:5的体积比混合均匀,按5000rpm离心30min，去除上清液，将所得沉淀通过冷冻干燥得到固体pei-ag碳点。
以溶解于0.1mol/lh2so4溶液(折光系数(η)为1.33)中的硫酸喹啉为参照物(量子产率＝54％)。通过比较荧光面积(ex＝360nm)与吸光度的比值计算碳点的量子产率。所有的样品溶于水中(η＝1.33)，并控制其在320nm下的吸光度小于0.1，相对量子产率的计算公式如下：
φx＝φst(gradx/gradst)(ηx2/ηst2)
φ为量子产率、grad为荧光面积与吸光度的比值，η为溶剂的折光系数，st代表标准物质，x代表样品。
通过测量，实施例1所合成pei-ag碳点的量子产率为58.1％。
(4)将大肠杆菌菌种接种于lb液体培养基中，置于37℃恒温摇床中，180rpm培养12h,将活化好的菌种按5％的接种量接种于lb液体培养基中，置于37℃恒温摇床中，180rpm培养8-10h。
(5)将步骤(4)中100μl大肠杆菌菌液用三角扒涂在lb固体培养基的平板上，在平板上贴4个小纸片(直径为0.6cm)，在小纸片上依次加入的一系列浓度梯度的pei-ag碳点溶液(1-50mg/ml)。将平板置于37℃恒温箱培养12小时。观察并以直尺测量抑菌圈大小。
本发明实施例中pei-ag碳点溶液对大肠杆菌的抑菌效果见图1。4个纸片上滴加的浓度分别为1、5、25、50mg/ml，滴加量均为5μl，由图1可知，当pei-ag碳点溶液的浓度达到25mg/ml时，开始出现抑菌环，通过测量可知，当pei-ag碳点溶液为25mg/ml时，抑菌圈的宽度为5mm，当浓度为50mg/ml时，抑菌圈的宽度为7mm。抑菌圈的宽度是指抑菌大圈的半径减掉纸片的半径。
(6)先往96孔板的每孔中加入50μl一系列浓度梯度的pei-ag碳点(0.05-5mg/ml)，再往每孔中加入50μl步骤(4)中得到的大肠杆菌菌悬液。于37℃恒温培养8-12h后，然后向每孔中加入5μl5mg/ml的mtt溶液，继续37℃恒温20min后，最后往每孔中加入200μl二甲亚砜(dmso)，使用酶标仪测定其在570nm波长处的吸光度值，实验重复三次。通过计算，pei-ag碳点的mic值(最小抑菌浓度)为0.2-0.6mg/ml。
实施例2
(1)称取0.1gpei(分子量为600)，2g柠檬酸于50ml的圆底烧瓶中，加入30ml的超纯水使其混合均匀，在氮气的保护下搅拌20min后，往圆底烧瓶中注入100μl0.1mol/l的硝酸银，继续搅拌20min。
(2)将步骤(1)得到的混合溶液转入微波反应釜中加热到220℃，反应5min，即可得到pei-ag碳点溶液。
(3)将步骤(2)得到的pei-ag碳点溶液直接置于3kd超滤离心管中，按12000rpm离心10min，去除下层溶液，将上层溶液用氮气吹干，即得固体pei-ag碳点。通过测量，实施例2所合成pei-ag碳点的量子产率为55.5％。
(4)将金黄色葡萄球菌接种于mh肉汤液体培养基中，置于恒温摇床中，37℃，180rpm培养12h，将活化好的菌种，按5％的接种量接种于mh肉汤液体培养基中，置于恒温摇床中，37℃，180rpm培养8-10h。
(5)先向96孔板的每孔中加入50μl一系列浓度梯度的pei-ag碳点(0.05-5mg/ml)，再向每孔中加入50μl步骤5)中得到的金黄色葡萄球菌菌悬液。于37℃恒温培养8-12h后，然后每孔中加入5μl5mg/ml的mtt溶液，继续37℃恒温20min后，最后向每孔中加入200μl二甲亚砜(dmso)，使用酶标仪测定其在570nm波长处的吸光度值，实验重复三次。通过计算，pei-ag碳点的mic值为1.2-2.5mg/ml。
实施例3
(1)称取0.1gpei(分子量为10000)，1g柠檬酸于50ml的圆底烧瓶中，往圆底烧瓶中加入30ml的超纯水使其混合均匀，在氩气的保护下搅拌20min。
(2)将步骤(1)得到的混合溶液转入高压反应釜中加热到220℃，反应30min，即可得到pei碳点溶液。
(3)向pei碳点溶液中注入30μl0.1mol/l硝酸银，在氩气的保护下搅拌20min，即得pei-ag碳点溶液。
(3)将步骤(3)得到的pei-ag碳点溶液与乙腈按1:2的体积比例混合均匀,按15000rpm离心5min，去除上清液，将所得沉淀用氩气吹干得到固体pei-ag碳点。通过测量，实施例3所合成pei-ag碳点的量子产率为53.3％。
(4)将白色念珠菌菌种接种于改良马丁液体培养基中，置于28℃恒温摇床中，180rpm培养24h，将活化好的菌种按5％的接种量接种于改良马丁液体培养基中，置于28℃恒温摇床中，180rpm培养24-48h。
(5)先往96孔板的每孔中加入50μl一系列浓度梯度的pei-ag碳点(0.05-5mg/ml)或者加入一系列浓度梯度的两性霉素(0.01-100μg/ml)或两者均加入，再往每孔中加入50μl步骤4)中得到的白色念珠菌菌悬液。于28℃恒温培养24-48h后，然后向每孔中加入5μl5mg/ml的mtt溶液，继续28℃恒温20min后，最后往每孔中加入200μl二甲亚砜(dmso)，使用酶标仪测定其在570nm波长处的吸光度值，实验重复三次。通过计算，pei-ag碳点和两性霉素协同使用时，两者的mic值分别为0.3-0.6mg/ml，0.03-0.9μg/ml。本实施例同时也测量了单独的pei-ag碳点和两性霉素的mic值分别为0.9-1.8mg/ml，0.1-2μg/ml。比较可知，pei-ag碳点和两性霉素的协同作用，可以明显降低两者的mic值。
实施例4
(1)称取0.1gpei(分子量为70000)，1.5g柠檬酸于50ml的圆底烧瓶中，加入30ml的超纯水使其混合均匀，在氮气的保护下搅拌20min后，往圆底烧瓶中注入10μl0.1mol/l硝酸银，继续搅拌20min。
(2)将步骤(1)得到的混合溶液转入微波反应釜中加热到140℃，反应60min，即可得到pei-ag碳点溶液。
(3)将步骤(2)得到的pei-ag碳点溶液直接置于100kd超滤离心管中，按8000rpm离心20min，去除下层溶液，将上层液体用氮气吹干即得固体pei-ag碳点。通过测量，实施例4所合成pei-ag碳点的量子产率为54.6％。
(4)将金黄色葡萄球菌接种于mh肉汤液体培养基中，置于恒温摇床中，37℃，180rpm培养12h,将活化好的菌种，按5％的接种量接种于含肉汤液体培养基中，置于恒温摇床中，37℃，180rpm培养8-10h；
(5)先向96孔板的每孔中加入50μl一系列浓度梯度的pei-ag碳点(0.05-5mg/ml)，或者每孔中加入一系列浓度梯度的庆大霉素(0.01-100μg/ml)，或两者均加入，再往每孔中加入50μl步骤(5)中得到的金黄色葡萄球菌菌悬液。于37℃恒温培养8-12h后，然后往每孔中加入5μl5mg/ml的mtt溶液，继续37℃恒温20min后，最后向每孔中加入200μl二甲亚砜(dmso)，使用酶标仪测定其在570nm波长处的吸光度值，实验重复三次。通过计算，pei-ag碳点和庆大霉素协同使用时，两者的mic值分别为0.2-0.5mg/ml、0.4-0.9μg/ml。本实施例同时也测量了单独的pei-ag碳点和庆大霉素的mic值分别为0.6-1.2mg/ml、0.9-2.0μg/ml。比较可知，pei-ag碳点和庆大霉素的协同作用，可以明显降低两者的mic值。
实施例5
(1)称取0.1gpei(分子量为10000)于50ml的圆底烧瓶中，紧接着注入80μl0.1mol/l硝酸银，再加入30ml的超纯水使其混合均匀，在氮气的保护下搅拌20min后，往圆底烧瓶加入1.2g柠檬酸后继续搅拌20min。
(2)将步骤(1)得到的混合溶液转入高压反应釜中加热到180℃，反应3h，即可得到pei-ag碳点溶液。
(3)将步骤(2)得到的pei-ag碳点溶液直接置于10kd超滤离心管中，按15000rpm离心10min，去除下层溶液，将上层溶液真空干燥，即得固体pei-ag碳点。通过测量，实施例5所合成pei-ag碳点的量子产率为52.1％。
(4)将白色念珠菌接种于改良马丁液体培养基中，置于恒温摇床中，28℃，180rpm培养24h，将活化好的菌种，按5％的接种量接种于含改良马丁液体培养基中，置于恒温摇床中，28℃，180rpm培养24-48h。
(5)先向96孔板的每孔中加入50μl一系列浓度梯度的pei-ag碳点(0.05-5mg/ml)，或者向每孔中加入一系列浓度梯度的酮康唑(0.1-100μg/ml)或两者均加入，再向每孔中加入50μl步骤(4)中得到的白色念珠菌菌悬液。于28℃恒温培养24-48h后，然后往每孔中加入5μl5mg/ml的mtt溶液，继续28℃恒温20min后,最后向每孔中加入200μl二甲亚砜(dmso)，使用酶标仪测定其在570nm波长处的吸光度值，实验重复三次。通过计算，pei-ag碳点和庆大霉素协同使用时，两者的mic值分别为0.05-0.2mg/ml、0.3-0.8μg/ml。本实施例同时也测量了单独的pei-ag碳点和酮康唑的mic值分别为0.5-0.8mg/ml、0.9-1.8μg/ml。比较可知，pei-ag碳点和酮康唑的协同作用，可以明显降低两者的mic值。
实施例6
(1)称取0.1gpei(分子量为1800)，0.8g柠檬酸于50ml的圆底烧瓶中，加入30ml的超纯水使其混合均匀，在氩气的保护下搅拌20min。
(2)将步骤(1)得到的混合溶液转入高压反应釜中加热到140℃，反应5h，即可得到pei碳点溶液。
(3)向pei碳点溶液中注入80μl0.1mol/l硝酸银，在氩气的保护下搅拌20min，即得pei-ag碳点溶液。
(4)将步骤(3)得到的pei-ag碳点溶液与异丙醇按1:10的体积比混合，调至13000rpm离心10min，去除上清液，将所得沉淀用氮气吹至干燥，即得固体pei-ag碳点。通过测量，实施例6所合成pei-ag碳点的量子产率为52.8％。
(5)将大肠杆菌菌种接种于lb液体培养基中，置于37℃恒温摇床中，180rpm培养12h，将活化好的菌种按5％的接种量接种于lb液体培养基中，置于37℃恒温摇床中，180rpm培养8-10h。
(6)往96孔板中每孔加入50μl一系列浓度梯度的pei-ag碳点(0.05-5g/ml)，或者加入一系列浓度梯度的罗红霉素(0.1-100μg/ml)，或两者均加入，再往每孔中加入50μl步骤(5)中得到的大肠杆菌菌悬液。于37℃恒温培养8-12h后，然后往每孔中加入5μl5mg/ml的mtt溶液，继续37℃恒温20min后，每孔加入200μl二甲亚砜(dmso)，使用酶标仪测定其在570nm波长处的吸光度值，实验重复三次。通过计算，pei-ag碳点和罗红霉素协同使用时，两者的mic值分别为0.1-0.3mg/ml，0.02-1μg/ml。本实施例同时也测量了单独的pei-ag碳点和罗红霉素的mic值分别为0.4-0.8mg/ml，0.05-3μg/ml。比较可知，pei-ag碳点和罗红霉素的协同作用，可以明显降低的两者的mic值。
对比例1(非含银碳点)
(1)称取0.1gpei(分子量为1000)，1g柠檬酸于50ml的圆底烧瓶中，往圆底烧瓶中加入30ml的超纯水使其混合均匀，在氩气的保护下搅拌20min。
(2)将步骤(1)得到的混合溶液转入高压反应釜中加热到220℃，反应30min，即可得到pei碳点溶液。
(3)将步骤(2)得到的pei碳点溶液与乙腈按1:2的体积比例混合均匀,按15000rpm离心5min，去除上清液，将所得沉淀用氩气吹干得到固体pei碳点。通过计算，该对比例合成的pei碳点的量子产率为45.2％，低于实施例1合成的pei-ag碳点的量子产率58.1％。
所得pei碳点，参照实施例1的方法，对大肠杆菌的抑菌效果进行检测，该对比例合成的pei碳点的mic值为0.8-1.6mg/ml。可见，pei-ag碳点的抑菌效果，明显优于pei碳点。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。