一种嵌合抗原受体修饰的T细胞（CAR-T）的储存液的制作方法

本发明属于医学生物技术领域，具体涉及嵌合抗原受体修饰的t细胞(car-t)的储存液。

背景技术

随着环境污染、人口老龄化、不良生活方式以及心理和精神等复合因素的影响，癌症的发病率在全世界范围内逐年上升，中国癌症的发病形势严峻，发病率与死亡率呈持续上升趋势，每年新发癌症病例约429.2万，因癌症死亡病例约281.4万。肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌和食道癌是目前中国最普遍的恶性肿瘤类型，占所有癌症的64%；乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、甲状腺癌和血液肿瘤则是发病率增长最快的几种类型。总体上看，各肿瘤发病率差别较大，缺乏有效的治疗手段。这些年，生物疗法包括细胞治疗在内的靶向治疗手段在肿瘤治疗领域产生了巨大的影响，成为了继手术、化疗、放疗后的新型肿瘤治疗方法，其中以嵌合抗原受体（chimericantigenreceptor，car）修饰的t细胞（cartcells，car-t）靶向性治疗各种肿瘤的研究最为突出，在体外和临床试验中均表现出对肿瘤细胞良好的靶向杀伤效果。

car的结构和生理性的t细胞表面受体（tcellreceptor，tcr）相似，但t细胞以tcr引导杀伤肿瘤细胞时常受到人类白细胞抗原分子（humanleukocyteantigen，hla）的限制,而肿瘤细胞限制hla的表达，或通过改变肿瘤免疫微环境来逃避免疫系统的监视和攻击，从而限制t细胞的活化来抑制对肿瘤细胞的杀伤作用，也因此限制了tcr的进一步发展。但是car-t细胞与肿瘤抗原接触识别是通过表达于其表面的特定蛋白与肿瘤抗原特异性结合来识别肿瘤抗原，不需要依赖于抗原提呈细胞（antigenpresentingcell，apc）的加工和mhc的表达，克服了在抗原提呈过程中的免疫逃逸，增强其识别和杀伤肿瘤细胞的作用。目前，血液肿瘤和实体瘤方面都在进行着各种临床前和临床阶段的研究。

在临床应用过程中，car-t细胞需要保存在专门配制的储存液中，随储存液一起输进患者体内。良好的储存液必须保持car-t细胞的活率及表型，并且不受运输时间和运输条件的限制。现有的储存液是沿用普通免疫细胞的储存液，在保存和运输过程中会影响细胞活性，进而影响car-t细胞的治疗效果。

因此需要一种专门配置的储存液能实现以下优势，在24小时内实现4-8℃保存的car-t细胞的活性保持96%以上，在48小时内实现4-8℃保存的car-t细胞的活性保持90%以上，并且储存液的成分符合医用标准对人体安全可靠，这样储存的car-t细胞制剂可直接应用人体，在应用上将能够实现远距离运送和临床推广。

技术实现要素：

为了解决car-t细胞制剂储存液的应用问题，本发明提供了一种car-t细胞制剂储存液的配比方案，使用该储存液能够实现car-t细胞制剂在4-8℃储存48小时而活率保持在90%以上，并且该储存液成分均为临床验证可应用的成分或注射试剂。

本发明的技术方案如下：

一种car-t细胞制剂的低温储存方法，其中采用多个活性成分对细胞储存条件进行优化，是含有腺苷、氯化钠、白蛋白、血管紧张素-ii、细胞来源的短肽和多肽类化合物、抗体t1，抗体t2，抗体t3，细胞因子白介素-6的拮抗剂托珠单抗，细胞因子白介素-15的水溶液。各成分的浓度可以为：

1）腺苷，0.5-2mmol/l；

2）氯化钠，8.5-10g/l；

3）白蛋白，10-100g/l；

4）血管紧张素-ii，50-400ng/ml；

5）细胞的条件培养基中分离出的短肽和多肽类化合物，50-400ng/ml；

6）抗体t1，10ng/ml-100ng/ml；

7）抗体t2，10ng/ml-100ng/ml；

8）抗体t3，10ng/ml-100ng/ml；

9）白介素-6的拮抗剂托珠单抗，200ng/ml-3200ng/ml；

10）白介素-15，50-400ng/ml。

一种优选的配方是对上述成分进一步优化，各成分的浓度分别优化为：

1）腺苷，1-2mmol/l；

2）氯化钠，8.5-10g/l；

3）白蛋白，30-100g/l；

4）血管紧张素-ii，100-400ng/ml；

5）细胞的条件培养基中分离出的短肽和多肽类化合物，100-400ng/ml；

6）抗体t1，20ng/ml-100ng/ml，；

7）抗体t2，20ng/ml-100ng/ml；

8）抗体t3，20ng/ml-100ng/ml；

9）白介素-6的拮抗剂托珠单抗，400ng/ml-3200ng/ml；

10）白介素-15，100-400ng/ml。

前述的细胞储存液可以进一步优化，各成分的浓度优化为：

1）腺苷，1.5-2mmol/l；

2）氯化钠，9-10g/l；

3）白蛋白，60-100g/l；

4）血管紧张素-ii，200-400ng/ml；

5）细胞的条件培养基中分离出的短肽和多肽类化合物，200-400ng/ml；

6）抗体-t1，40ng/ml-100ng/ml；

7）抗体-t2，40ng/ml-100ng/ml；

8）抗体-t3，40ng/ml-100ng/ml;

9）白介素-6的拮抗剂托珠单抗，800ng/ml-3200ng/ml；

10）白介素-15，200-400ng/ml。

前述的细胞储存液可以进一步优化，各成分的浓度优化为：

1）腺苷，1.5-2mmol/l；

2）氯化钠，9-10g/l；

3）白蛋白，80-100g/l；

4）血管紧张素-ii，300-400ng/ml；

5）细胞的条件培养基中分离出的短肽和多肽类化合物，300-400ng/ml；

6）抗体t1，80ng/ml-100ng/ml；

7）抗体t2，80ng/ml-100ng/ml；

8）抗体t3，80ng/ml-100ng/ml;

9）白介素-6的拮抗剂托珠单抗，1600ng/ml-3200ng/ml；

10）白介素-15，300-400ng/ml。

在上述技术方案中，储存液各组分的作用如下：

添加的腺苷可在保存过程中保持car-t细胞的atp水平的稳定，保证car-t细胞生长必须的能量物质，其在car-t细胞代谢过程中有着重要的细胞营养作用，并可增加car-t细胞活性同时发挥细胞保护作用，通过直接升高细胞内atp水平，能进入细胞内使细胞内外保持细胞的正常形态，防止低糖条件下造成的功能损伤。

在储存液中加入适量的氯化钠，在生理盐水浓度下可有效调节溶液的渗透压，保持液体渗透压相对平衡，从而使细胞不受渗透压影响，使细胞内外保持细胞的正常形态，防止细胞的急速脱水造成的功能损伤。

在储存液中加入适量的白蛋白，主要调节car-t细胞水分动态平衡，维持细胞溶液渗透压作用，也是一种car-t细胞的防冻保护剂，储存液中加入适量的医用白蛋白，保证了car-t细胞临床应用的安全性和可靠性。

在储存液中加入适宜浓度血管紧张素-ii，主要调节car-t细胞的活性状态，可促进car-t细胞的增殖、减少其凋亡，发挥促进car-t细胞存活、增殖和凋亡功能的作用，进而显著促进了car-t细胞临床应用的可靠性。

在储存液中加入适宜浓度的从人脐带间充质干细胞的无血清培养液中收获的短肽和多肽类化合物。可以促进car-t细胞的增殖及迁移，抑制细胞的凋亡信号通路，有重要的临床应用价值。短肽和多肽类化合物来源丰富，易于获取，便于储存，有望成为重要的储存液添加物。

在储存液中加入适宜浓度的抗体t1,t2,t3，抗体封闭均能显著增强car-t细胞对胞肿瘤细胞系的杀伤活性，在治疗中上有重要的临床应用价值。

在储存液中加入适宜浓度的il-6的拮抗剂托珠单抗，临床上主要用于抗炎症的作用，可预防静脉注射后的炎性因子的爆发。抑制细胞因子释放综合症的发生，改善与car-t细胞诱导的临床反应，降低输注细胞后血清中炎性细胞因子ifn、tnf和il-6等水平。

在储存液中加入适宜浓度il-15细胞因子，主要调节car-t细胞的活性状态，可促进car-t细胞的存活、减少其凋亡，发挥促进car-t细胞的治疗作用，进而显著促进了car-t细胞临床应用的可靠性。

上述各成分均是生物医药领域常用的化学试剂或生物制品、原料药，在用于注射人体时，优选使用国家食品药品监督管理局批准的药用级产品，白蛋白优选使用人血白蛋白，人脐带间充质干细胞的无血清培养基中分离出外泌体和短肽和多肽类化合物为人脐带间充质干细胞培养的产物，通过无菌检测。

实验表明，本发明提供的car-t细胞储存液能够实现car-t细胞在4-8℃储存1-2天而活率保持90%以上，便于细胞的运输和暂时储存，并且该储存液成分均来自对人体安全的医药用，作为注射试剂可直接注射，从而极大方便了car-t细胞制剂的临床应用。

附图说明

图1：实施例中的car-t细胞构建慢病毒的质粒图谱，酶切位点为bamhi和sali。

图2：实施例中的car-t细胞转染率，细胞生长良好，转染率为65.15%。

图3：实施例中的car-t细胞在用本发明的储存液保存0小时、12小时、24小时、48小时进行杀伤试验的结果，其中0小时、12小时、24小时和48小时的效靶比为10:1时，杀伤效率维持在50%以上。

图3-1：实施例中的car-t细胞在用本发明的储存液保存0小时进行杀伤试验的结果。

图3-2：实施例中的car-t细胞在用本发明的储存液保存12小时进行杀伤试验的结果。

图3-3：实施例中的car-t细胞在用本发明的储存液保存24小时进行杀伤试验的结果。

图3-4：实施例中的car-t细胞在用本发明的储存液保存48小时进行杀伤试验的结果。

图4：实施例中的car-t细胞在用本发明的储存液保存0小时、12小时、24小时、48小时的活率结果，其中0小时、12小时、24小时和48小时的活率维持在90%以上。

具体实施方式

病毒质粒的构建：用pcr方法把特异识别cd19抗原的单链抗体序列、和胞内传导信号分子cd3ζ和4-1bb串联在一起，得到cd19-car片段。选用的感染方法是慢病毒转导，最终将cd19-car片段克隆到慢病毒载体上，选用的插入酶切位点是bamhi和sali，主质粒为基础构建了car19，并经测序结果鉴定。

细胞培养按照常规细胞培养方法，在37℃、5%co2的环境培养细胞，外周血中提取的t淋巴细胞用5%灭活ab型人血浆xvivo15培养基培养；慢病毒包装细胞系293t用含10%fbsdmem培养基培养。

慢病毒包装质粒及目的质粒的提取质粒转化：

1)取1支100ul感受态细胞置于冰浴中；

2)向感受态细胞悬液中分别加入1ng目的质粒（car-006），用枪混匀，在冰浴中静置30min；

3)将离心管置于42℃水浴中放置60s，然后快速将管转移到冰浴中，放置冰上3min；

4)向离心管中加入900ul无菌培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床振荡培养45min（150rpm/min）；

5)将离心管内容物混匀，吸取100ul已转化的感受态细胞涂布于含有氨苄抗生素（ampicillin，amp）的lb固体培养基上，倒置平板，37℃培养16h。

质粒提取：

1)挑选上述lb平板上的单克隆置于4mllb培养基（amp）中，37℃摇床振荡培养8h（200rpm/min）；

2)吸取1ml菌液至1000mllb培养基（amp）中，37℃摇床振荡培养16h（200rpm/min）；

3)按照qiagen质粒大量提取试剂盒说明书提取质粒，用紫外分光光度计检测质粒浓度和纯度，置于-20℃保存，用于后续的慢病毒包装。

慢病毒包装实验过程：

细胞培养：取3×10⁷个293t细胞接种于t225细胞培养皿中，共铺12个t225，24h后，待细胞密度达到80%时，进行转染；

1）向ep管中加入40.5mloptimem，加入包装质粒，混匀；

2）逐滴加入2430ulfugenehd，混匀，静置15min；

3）将上述混合液平均加入293t细胞中，混匀，培养箱培养16h；

4）16h后更换30ml新鲜培养基，继续培养；

5）48h后收集第一批病毒，并加入12ml新鲜培养基；

6）72h后收集第二批病毒；

7）收集的病毒离心取上清，用0.45um的滤膜过滤，然后进行浓缩。

慢病毒浓缩：

1)将收集到的病毒上清转移到超速离心管中，超速离心机离心60000g，3h；

2)弃上清，向离心管底部加入pbs，置于4℃过夜；

3)收集管底的病毒重悬液，分装到冻存管中，-80℃储存。

慢病毒滴度测定：

将293t细胞种在24孔平板中，每孔密度为1.5×10⁵个细胞，浓缩过的病毒液以0.1ul、0.25ul、0.5ul、1ul的梯度加入到24孔板中，加入8ug/mlpolybrene，48h后运用流式细胞术检测293t细胞的car阳性表达率，根据car阳性率等于病毒的感染效率，从而得出每微升病毒液中含有的病毒颗粒数。

分离并制备淋巴细胞单细胞悬液：

1)将稀释后的血液用移液管沿管壁缓慢叠加于ficoll上；

2)离心，810g，20min；

3)收集上层血浆层和ficoll交界面的白膜层细胞，移入一新的离心管中；

4)生理盐水洗涤细胞两次(350g,8min)；

5）按量加入cd3cd28磁珠，摇床3rpm孵育30min，经磁力架去除未结合细胞；

5)用car-t细胞培养基重悬细胞，计数，置于培养瓶中培养。

t细胞体外激活使用取与磁珠共培养24-48h后的细胞做慢病毒转染。

慢病毒转染t细胞收集活化后的t细胞，离心(350g,8min)，加入浓缩过的tj-car-cd19病毒液，混匀，moi=20。3天后对转染的t细胞进行相关目的蛋白检测，7天后进行细胞毒性试验。

细胞杀伤活性检测：

1）靶细胞收集：选择处于对数生长期的靶细胞（cd19⁺k562和cd19^-k562），收集于15ml离心管内，以1500rpm离心3min；

2）按promegag1780细胞毒性试剂盒进行细胞杀伤活性检测。

转染后的car-t细胞可以靶向性识别cd19阳性的靶细胞并引起il-2、tnf细胞因子大量释放。

发现未被car基因修饰的t细胞对cd19阳性的k562细胞的杀伤效率可为5-10%左右，而cd19-car-t细胞对上述细胞的杀伤效率最高可达60%以上，经cd19嵌合抗原体受体修饰的t细胞可特异性识别cd19分子，对cd19阳性的肿瘤细胞的杀伤效率显著高于未被基因修饰的t细胞，显示出car-t在免疫治疗中具有巨大潜力。

car-t细胞最关键的指标之一就是其对特异性靶细胞的杀伤效率，在较低的效靶比下取得较高的杀伤效率是car-t研发的追求目标之一。较高的杀伤率不仅能够降低慢病毒等高成本的耗用，还可以降低癌症患者回输所需的嵌合抗原受体修饰的t细胞个数，解决因化疗/放疗等因素造成的t淋巴细胞偏低而体外培养扩增较慢的问题。使用新的储存液储存0小时、12小时、24小时和48小时的效靶比为10:1时，杀伤效率维持在50%以上。