一种德国鸢尾幼胚诱导胚性愈伤组织的方法与流程

本发明是关于细胞工程组织培养技术领域，特别涉及一种德国鸢尾幼胚诱导胚性愈伤组织的方法。

背景技术：

德国鸢尾(irisgermanical.)为鸢尾科(iridaceae)鸢尾属(iris.l)多年生草本植物，是世界著名的宿根花卉之一，耐寒性强，叶丛美观，花朵硕大，色彩艳丽，具有较高的观赏价值，世界各地广为栽培，在园林绿化、盆栽以及地被应用中有巨大的发展空间。

目前，国内应用的德国鸢尾品种均引自国外，不但品种数量少、种源有限、且价格昂贵。迫切希望获得更多的、具有优良性状的德国鸢尾种苗，来满足各方面的需求。由于德国鸢尾自然结实率低，难以利用种子繁殖，而引进的母株有限，不能满足市场需求。因此，急需解决德国鸢尾优质种苗的繁殖方法，缓解目前市场对德国鸢尾种苗的需求。常规分株繁殖的方法存在着繁殖系数低，很难在短时间内获得大量优质种苗，无法满足园林绿化工程的需要。而通过组织培养的方式生产种苗，生产速度快、可缩短繁育周期，有效保持种苗的优良性状，因此通过组织培养快速繁殖是目前尽快满足应用需求的有效途径。德国鸢尾组织培养多采用茎尖、根茎及花器官为外植体，均存在污染率高、对母株造成伤害等问题。因此，探索一种操作简便、污染率低、诱导率高、且能使胚性愈伤组织长期保持较高分化再生能力的方法，非常必要。

目前德国鸢尾的育种方式主要为常规杂交育种，育种周期长，杂交后代种苗较少，选育难度较大，而通过幼胚诱导胚性愈伤从而构建再生植株，能在短时间内增殖大量杂交后代，为选育优良品种提供便利。此外，愈伤组织也可用于遗传转化、种质资源保存与快繁生产。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供一种德国鸢尾幼胚诱导胚性愈伤组织的方法。

为实现本发明的目的，本发明采用的技术方案是：

提供一种德国鸢尾幼胚诱导胚性愈伤组织的方法，具体包括下述步骤：

(1)材料准备：

在德国鸢尾自交或杂交后40～50d，取生长良好的蒴果于4℃冰箱中保存备用；

(2)外植体消毒：

将步骤(1)中的蒴果，在体积比为10％的洗洁精溶液中浸泡10～15min，再在流水下冲洗20～30min，然后置于超净工作台上进行消毒处理；将蒴果置于20％的次氯酸钠溶液中浸泡30min后，用无菌水清洗4次，然后置于经高温灭菌的滤纸上备用；

(3)外植体接种：

将步骤(2)处理后的蒴果，用镊子和解剖刀沿果实纵棱切开，取出颗粒饱满的种子置于无菌滤纸上；然后操作人员将种子拿在手上，有萌发孔的一端朝上，用解剖针轻轻挑破萌发孔端的种皮，用手轻轻挤出白色的幼胚，用镊子慢慢将幼胚接种至愈伤组织诱导培养基表面；再将接种的幼胚置于25℃，黑暗条件下培养；

所述愈伤组织诱导培养基为含0～2.0mg/l2，4-d(2，4-dichlorophenoxyaceticacid，2，4-二氯苯氧乙酸)、0～1.0mg/l6-ba(6-benzylaminopurine，6-苄氨基腺嘌呤)、30g/l蔗糖和6g/l琼脂粉的ms培养基，且培养基溶液的ph值为5.8～5.9；

(4)胚性愈伤组织的诱导：

外植体在愈伤组织诱导培养基上培养3～4周后，幼胚膨大并长出黄色致密的愈伤组织团块；用解剖刀将愈伤组织团块切下，转接到最佳愈伤组织诱导培养基上，在25℃，光照周期为12/12h的条件下培养；

(5)胚性愈伤组织的增殖

从步骤(4)中挑选质地紧密、黄色的胚性愈伤组织，接种到继代培养基上；待愈伤组织小块平均直径达到1cm以上后，将其切分成直径小于0.5cm的愈伤组织小块，再接种到新鲜的愈伤组织继代培养基上，在25℃，光照周期为12/12h的条件下培养；

作为进一步的改进，所述步骤(1)中，所取的蒴果为胚乳硬化的蒴果，以利于幼胚的获得。

作为进一步的改进，所述步骤(2)中，所述消毒处理步骤为：将上述蒴果置于20％的次氯酸钠溶液中浸泡30min后，用无菌水清洗4次，然后置于经高温灭菌的滤纸上备用；

作为进一步的改进，所述步骤(5)中胚性愈伤组织，还能用于遗传转化体系中，作为遗传转化体系的受体，在再生培养基上分化生根，炼苗、移栽即可获得德国鸢尾的转基因植株。

所述步骤(3)中的愈伤组织诱导培养基为含0～2.0mg/l2，4-d、0～1.0mg/l6-ba、30g/l蔗糖和6g/l琼脂粉的ms培养基，且培养基溶液的ph值为5.8～5.9。

所述步骤(4)中的最佳胚性愈伤组织诱导培养基是指含1.5mg/l2，4-d、0.2mg/l6-ba、30g/l蔗糖和6g/l琼脂粉的ms培养基，所述最佳愈伤组织诱导培养基的ph值为5.8～5.9。

所述步骤(5)中的愈伤组织继代培养基是指含1.0mg/l2，4-d、0.2mg/l6-ba、30g/l蔗糖和6g/l琼脂粉的ms培养基，所述愈伤组织继代培养基的ph值为5.8～5.9。

相对于现有技术，本申请取得了以下有益效果：

1、本发明以德国鸢尾幼嫩胚为外植体，具有污染率低，仅为5％，显著低于茎尖和根尖的污染率、材料易得的特点，其突出优势在于愈伤组织诱导率高，达到95％、操作简便、获得的愈伤组织结构紧密，颗粒性强。

2、德国鸢尾杂交或自交后40～50d时种子尚未成熟，胚乳未硬化，轻松即可从萌发孔挤出嫩胚，操作简便，同时减少对植株本身的破坏。

3、本发明根据愈伤组织形态即可直观判断其胚性状态，简便快捷，使用筛选得到的胚性良好的愈伤组织有利于继代或用于遗传转化体系。

4.本发明在步骤(3)、(4)、(5)中分别采用愈伤组织诱导培养基、最佳胚性愈伤组织诱导培养基和胚性愈伤组织继代培养基，是由于不同的培养阶段采用含有不同浓度激素的培养基，可以使外植体的诱导出不同状态的愈伤组织，其中，2，4-d含量的调整可以提高胚性愈伤组织的诱导率，并保持愈伤组织胚性的效果。

5.步骤(4)中采用光照周期为12/12h的培养条件培养愈伤组织，具有提高愈伤组织诱导率及增加愈伤组织胚性的有益效果；

附图说明

图1：德国鸢尾种子；

图2：德国鸢尾幼胚；

图3：幼胚诱导出的愈伤组织团块；

图4：胚性愈伤组织。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细描述：

下面的实施例可以使本专业的专业技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

本发明中，ms培养基购自南京藤春生物有限公司，规格为50l；琼脂粉购自南京擎科生物有限公司，规格为500g；2，4-d(2，4-dichlorophenoxyaceticacid，2，4-二氯苯氧乙酸)购自南京藤春生物有限公司，规格为10g，由sigma公司产品分装；6-ba(6-benzylaminopurine，6-苄氨基腺嘌呤)购自南京藤春生物有限公司，规格为5g，由sigma公司产品分装。

其步骤如下：

(1)材料准备：

在德国鸢尾‘00258’自交后45d，取生长良好的蒴果于4℃冰箱中备用；

(2)外植体消毒：

将步骤(1)中的蒴果，在体积比为10％的洗洁精溶液中浸泡10min，再在流水下冲洗30min，然后置于超净工作台上进行消毒；

消毒方法为：将上述蒴果置于20％的次氯酸钠溶液中浸泡30min后，用无菌水清洗4次，然后置于经高温灭菌的滤纸上备用；

(3)外植体接种：

将经消毒处理后的蒴果，用镊子和解剖刀沿果实纵棱切开，取出颗粒饱满的种子(图1)于无菌滤纸上；然后操作人员将种子拿在手上，有萌发孔的一端朝上，用解剖针轻轻挑破萌发孔端周围的种皮后，轻轻挤出白色的幼胚(图2)，随后用镊子慢慢将幼胚接种至愈伤诱导培养基表面，愈伤组织诱导培养基含1.5mg/l2，4-d、0.1mg/l6-ba、30g/l蔗糖和6g/l琼脂粉的ms培养基，ph值为5.8；再将接种的嫩胚置于25℃，黑暗条件下培养；

(4)胚性愈伤组织的诱导：

外植体在愈伤组织诱导培养基上培养3～4周后，幼胚膨大并长出黄色致密的愈伤组织团块(图3)；用解剖刀将愈伤组织团块切下，转接到最佳愈伤组织诱导培养基上，在25℃，光照周期为12/12h的条件下培养；所述最佳胚性愈伤组织诱导培养基是指含1.5mg/l2，4-d、0.2mg/l6-ba、30g/l蔗糖和6g/l琼脂粉的ms培养基，所述最佳胚性愈伤组织诱导培养基的ph值为5.8～5.9。

(5)胚性愈伤组织的增殖：

从步骤4中挑选质地紧密、黄色的胚性愈伤组织(图4)，接种到继代培养基上，待胚性愈伤组织小块平均直径达到1cm以上后，将其切分成直径小于5mm的愈伤组织小块，再接种到新鲜的愈伤组织继代培养基上，在25℃，光照周期为12/12h的条件下培养。所述愈伤组织继代培养基是指含1.0mg/l2，4-d、0.2mg/l6-ba、30g/l蔗糖和6g/l琼脂粉的ms培养基，所述胚性愈伤组织继代培养基的ph值为5.8～5.9。

依据上述步骤得到的愈伤组织材料易得，污染率较低，仅为5％，且愈伤组织诱导率高，达到95％、操作简便、获得的愈伤组织结构紧密，颗粒性强。

实施例2

分别取生长良好的茎尖、幼嫩子房、蒴果幼胚、幼嫩花苞、根尖作为外植体，其余处理步骤与实施例1中相同，分别于30d时统计外植体的污染率、愈伤诱导率、愈伤的状态及颜色并记录诱导出愈伤组织的时间，结果如表1所示。

表1不同外植体对德国鸢尾愈伤组织诱导的影响

对上述数据进行分析可知，本发明以德国鸢尾幼胚为外植体，具有污染率低、诱导出愈伤组织的时间短及材料易得的特点，其突出优势在于愈伤组织诱导率高达95％、操作简便、获得的愈伤胚性好。

实施例3

采用实施例1中的处理方法，其区别在于步骤(3)中幼胚的培养条件，分别于接种后30d统计胚性愈伤诱导率、愈伤组织直径及获得愈伤颜色，结果如表2所示。

表2不同温度和光周期对愈伤组织诱导率的影响

对上述数据进行分析可知，本发明采用25℃，黑暗条件作为幼胚的培养条件，可以使愈伤组织诱导率最高，高达93％。

实施例4

采用实施例1中的处理方法，其区别在于步骤(4)中愈伤组织的培养条件，分别于接种后30d统计胚性愈伤诱导率、愈伤组织直径、获得愈伤胚性状态及颜色，结果如表3所示。

表3不同温度和光周期对胚性愈伤组织诱导率的影响

对上述数据进行分析可知，本发明采用25℃，光照周期为12/12h作为愈伤组织的培养条件，可以使胚性愈伤组织诱导率高达95％，且愈伤组织结构致密，颗粒型好。

实施例5

采用实施例1中的处理方法，其区别在于步骤(4)中培养基中植物激素的不同含量，分别于接种后30d统计愈伤组织诱导率、愈伤组织直径、获得的愈伤组织胚性状态及颜色，结果如表4所示。

表4不同激素对德国鸢尾愈伤组织诱导的影响

对上述数据进行分析可知，本发明步骤(4)采用2，4-d含量为1.5mg/l、6-ba含量为0.2mg/l，可以使愈伤组织诱导率达到最高，高达95％、获得的愈伤组织紧密，颗粒性强，胚性好。

实施例6

采用实施例1中的处理方法，其区别在于步骤(5)中培养基中植物激素的不同含量，分别于接种后30d统计愈伤组织直径、愈伤组织胚性状态及颜色，结果如表5所示。

表5不同激素对德国鸢尾愈伤组织增殖的影响

对上述数据进行分析可知，本发明步骤(5)采用2，4-d含量为1.0mg/l、6-ba含量为0.2mg/l，可以使愈伤组织增殖速度最快，获得的愈伤组织紧密，颗粒性强，胚性好。