一种结缕草的诱导愈伤组织的方法与流程

本发明涉及组织培养，尤其涉及一种结缕草的诱导愈伤组织的方法。

背景技术：

结缕草属植物是禾本科画眉草亚科多年生草本植物，具备适应性强、植株密度大、覆盖地面能力强、耐旱、耐修剪践踏、再生恢复能力强，常用作于草坪草、生态治理、保持水土、净化水源，是优良的生态环保型草坪草，应用逐渐广泛。目前使用主要存在两类问题：1、生长速度较慢，常规的有性及无性繁殖方法无法满足日益增长的大量需求。2、现有可用品种较单一，优良新品种急待选育，以适应更广泛的区域。

通过组织培养手段可进行人工扩繁增大其繁殖再生系数，此外，体细胞胚(体胚)变异具有特殊的科学价值，获得优新种质的年限短，该技术尤其为获得纯系年限长、有性杂交困难、无性繁殖为主的结缕草属植物种质资源创新提供了新的途径。组织培养植株再生过程中愈伤组织诱导是关键环节，体胚诱变种质创新中单个体细胞的形成也依赖于愈伤组织的形成。

目前，虽然已有相关研究开展了结缕草属植物愈伤组织形成的研究，但已有方法如外植体采集不当(如利用茎基进行诱导，在叶片剥离过程中茎基极易受损)或数量少(如利用匍匐茎进行诱导，匍匐茎生长数量有限且采集困难)愈伤组织诱导基数低。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供提升诱导率的结缕草的诱导愈伤组织的方法。

技术方案：

一种结缕草的诱导愈伤组织的方法，包括：将结缕草的茎尖外植体接种于诱导培养基中进行培养；其中所述的诱导培养基配方为：ms+2,4-d2.0-3.0mg/l+6-ba0.05-0.1mg/l。

优选，所述的诱导培养基配方为：ms+2,4-d2.5-3.0mg/l+6-ba0.05-0.1mg/l。

所述的诱导培养基的ph为5.8～6.0。

所述外植体的获得方法包括：结缕草生长季5-9月，选择长势良好，无病害的结缕草植株，将直立茎顶端2-4cm茎段采下，将所带叶片由上至下剥离。

接种前，将外植体进行消毒处理。

所述消毒处理的方法包括：将外植体先用升汞浸泡30s，再用无菌水消毒3-4次，然后再用酒精浸泡5min，最后再用无菌水冲洗3-4次。消毒后将外植体放在无菌纸上降温，待温度适宜35-40℃之后剪成适当的长度2-3cm开始接种。

所述培养为暗培养。

所述暗培养的条件，温度:白天(25±1)℃，夜晚(18±1)℃；湿度：65％～75％。所述白天的时间为10～12h，所述夜晚的时间为10～12h。

所述结缕草为沟叶结缕草、细叶结缕草、中华结缕草或青岛结缕草。

有益效果：

本发明的外植体选用数量大且易采集的茎尖，通过适宜的生长调节剂及光照条件使愈伤组织诱导率达90％以上，远高于现有技术(愈伤组织诱导率仅为56.8％)

附图说明

图1为实施例3暗培养条件下培养的结果；

图2为实施例3光照条件下培养的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1

结缕草属植物愈伤组织诱导方法如下：

1、适宜种类

结缕草属植物，如沟叶结缕草、细叶结缕草、中华结缕草、青岛结缕草等。

2、外植体采集时间

结缕草生长季5-9月。

3、外植体采集及处理

选择长势良好，无病害的结缕草植株，将直立茎顶端2-4cm茎段采下，将所带叶片由上至下剥离，不能将茎剥断，最后留下的即为所需的材料。

将所剥下的茎放入烧杯中，然后在烧杯中放入适量的洗衣粉。选取一块干净的纱布，用洗衣粉洗干净遮在烧杯上，并使用橡皮筋固定住纱布，放在水龙头下，用流水冲洗15min。待烧杯中没有洗衣粉的泡沫之后，再用流水冲洗15min。

4、培养基的配置

ms+2,4-d2.0-3.0mg/l+6-ba0.05-0.1mg/l。

5、接种前的准备工作

1)提前20min打开超净工作台上的紫外灯来进行灭菌，工作服，戴口罩。进入无菌操作室前，用肥皂水清洗双手，操作时再用70％的酒精擦洗双手和清理台面。

2)用70％酒精擦拭装有培养基的瓶子，放入工作台。

3)将灭菌过的无菌纸放在工作台上。

4)带上干净的手套进行操作。

6、接种的过程

将预处理过的材料先用0.1％升汞浸泡30s，再用无菌水消毒3-4次，然后再用70％酒精浸泡5min，最后再用无菌水冲洗3-4次。将镊子与剪刀从消毒器中取出放在无菌纸上降温，待温度适宜35-40℃之后开始接种。首先，将我们消过毒的材料用剪刀剪成适当的长度2-3cm，放在无菌纸上备用。然后将装有培养基的培养器皿瓶口向内放置，打开盖子，用镊子夹取一小段材料横放在培养基上，每瓶培养器皿中放3-5根，然后盖紧盖子。每次做好一瓶都需要换取新的无菌纸，镊子和剪刀。

7、接种后的处理

将已经接种过的培养器皿放入适合它生长的培养室中。培养条件为暗培(黑暗，已有做法均是在光照培养下，出愈率较低)15-20天后，黄白色、松脆质地较好的愈伤组织，出愈率达90％以上。

实施例2不同培养基对结缕草愈伤组织诱导的影响

本实验结缕草材料取自江苏农林职业技术学院草坪：沟叶结缕草、中华结缕草、兰引3号结缕草、细叶结缕草三种结缕草

按上述实施例1方法先对沟叶结缕草进行茎尖组织培养。

培养基配方如表1：

表1

培养条件分两种：

光照条件下：培养基ph:5.8～6.0；温度：白天(25±1)℃，夜晚(18±1)℃；湿度：65％～75％；光强：2800lx；白天和夜晚分别为12h；

结果计算：

出愈率％＝愈伤组织发生数/接种植株数×100％

结果分析：

本试验采取了3种6ba和2，4-d不同浓度的组合进行研究，结果如下表2。

表2不同种类和浓度的激素对愈伤组织诱导的影响

接种于不同种类的培养中的结缕草，经过无菌培养，接种10-13d后，结缕草外植体两端末梢出现透明小点，产生少量愈伤组织。接种16-19d后，外植体切口处变膨大，出现愈伤组织。不同的配方对愈伤组织的诱导效果不同。其中2,4-d(3.0mg/l)+6-ba(0.1mg/l)组合的对结缕草幼嫩茎尖愈伤组织诱导率较高，愈伤组织生长较快，且愈伤组织生长较好。

实施例3不同光照条件对结缕草愈伤组织诱导的影响

以ms+2,4-d(3.0mg/l)+6-ba(0.1mg/l)为培养基，本试验探讨了结缕草在光培养和暗培养两种不同条件下愈伤组织诱导的情况，其他按上述实施例1方法先对沟叶结缕草进行茎尖组织培养。

光照条件下：培养基ph:5.8～6.0；温度：白天(25±1)℃，夜晚(18±1)℃；湿度：65％～75％；光强：2800lx

暗培养条件下：培养基ph:5.8～6.0；温度：白天(25±1)℃，夜晚(18±1)℃；湿度：65％～75％；暗培养

结果如表3、图1～2所示。

表3不同培养条件对结缕草愈伤组织诱导的影响

结果表明：不同培养条件下，暗培养的出愈时间比光培养早，出愈率也是暗培养高于光培养。光培养愈伤组织呈现不同程度的红褐色，且质地较硬，暗培养愈伤组织多呈现黄白色、松脆，暗培养较光培养效果好。

实施例4结缕草品种对愈伤组织诱导的影响

以ms+2,4-d(3.0mg/l)+6-ba(0.1mg/l)为培养基，暗培养条件下愈伤组织诱导的情况，其他按上述实施例1方法先对不同结缕草进行茎尖组织培养。

暗培养条件下：培养基ph:5.8～6.0；温度：白天(25±1)℃，夜晚(18±1)℃；湿度：65％～75％；暗培养。

结果如表4所示。

表4不同结缕草间愈伤组织诱导的差异

由上表可看出，以ms+2,4-d(3.0mg/l)+6-ba(0.1mg/l)为培养基在暗培条件下，不同结缕草属品种，按照本实验方法均可获得理想的出愈状况。