专利名称：羊“试管内”杂交育种技术的制作方法
技术领域：
本发明属生物工程技术，特别涉及动物的繁殖方法。
“试管家畜”技术，也叫家畜体外受精技术(In Vitro Fertilization,IVF)，是指通过人工操作使家畜的卵子和精子在体外条件下成熟和受精，并能够发育为早期胚胎的技术。这项技术在家畜最早取得成功的是在1982年，美国的Brackett等(Bio.Reprod.,27:147-158)用高渗溶液处理牛精子，得到了世界首例体外受精的小牛。但他们所采用的精子获能方法重复性很差，包括他们自己也未能得到重复的结果。1984年本专利申请者(旭日干)和日本学者花田章，首次利用钙离子载体Ionophore A23187和咖啡因等化学药物诱导山羊、绵羊及牛精子获能均获得成功，并利用此方法培育出世界首胎体外受精山羊(Bull Nippon Vet.and Zootech.Coll.,33:219-221)。后来这一方法在日本、英国、美国、中国和俄罗斯等多国的实验室，在绵羊、牛和猪等多种家畜的实验中取得成功，并在此基础上逐步发展成为比较成熟的，可开发利用的生物高技术。
申请者自1987年起主持国家“863”高技术计划项目“牛体外受精技术的研究与开发”，经过“七五”基础研究、“八五”应用研究和“九五”中试开发研究取得了重大进展。于1989年培育出了国内首胎、首批“试管绵羊”(1989，内蒙古大学学报，20:564-569)和“试管牛”(1990，中国科学通报，21:1666-1667)。同时创造性地提出了利用屠宰家畜卵巢卵母细胞工厂化生产“试管胚胎”的技术路线，提出了牛体外受精技术产业化工艺流程，提出了利用羔羊卵子进行“试管内杂交育种”的新概念，新技术。
本发明的目的是利用″试管内杂交育种″的新概念、新技术，在绵、山羊可以在生殖细胞水平上进行品种间杂交，从而快速、低成本培育出高产、优质新品种，并且培育新品种的周期比起常规育种要缩短1/2以上。
本发明的内容目前在家畜育种中大多仍采用传统的育种技术。这种技术最大的缺点就是育种周期长，往往需要十几年、甚至几十年的时间。我们利用幼龄母畜可以获得很好的超数排卵效果的特点，将体外受精技术应用于羊的育种，缩短育种周期，这种研究方法目前在世界上尚无报道。
(1)对2-3月龄母羔羊利用FSH-LH进行超数排卵处理，用手术方法从卵巢表面回收卵母细胞。羔羊超排处理后，每只羔羊可以获得50枚以上的卵子，充分发挥了母羊的繁殖潜力，而且对该母羊成年后的繁殖能力没有任何损伤。
(2)将回收的卵母细胞在体外成熟培养液中培养成熟后，用其他品种的种公羊精子进行体外受精。
(3)将体外受精卵在体外发育培养系统内培养至2-细胞-囊胚期胚胎，移入受体母羊输卵管或子宫内。
(4)受体羊妊娠、产羔后获得杂交F1代羔羊。
(5)F1代母羔羊2-3月龄后再次利用超数排卵的方法获得卵母细胞，用于与其父本相同品系的公羊精子进行体外受精。
(6)经体外受精后又可获得体外受精胚胎。
(7)将体外受精胚胎移入受体羊子宫内，经妊娠后获得F2代羔羊。
(8)F2代母羔羊2-3月龄后，经超数排卵处理回收卵母细胞，再次进行体外受精。
(9)体外受精后得到的胚胎又可用于胚胎移植。
(10)经胚胎移植后可以获得F3代羔羊。F3代羔羊通过横交的方法固定其遗传性状，达到遗传育种的目的。
本发明的优点和积极效果1．采用“试管内”杂交育种工艺对羊进行育种可以极大地缩短育种周期。目前在羊的常规育种方法中，子代母羊通常2岁后才可以用于育种，因此育种周期十分长，培育出一个品种往往需要十几年，甚至几十年的时间。采用本工艺，子代母羊2-3个月即可用于育种，这样就极大地缩短了育种过程中的世代间隔。在羔羊卵巢卵母细胞体外受精技术中，对羔羊进行超数排卵处理后，可以回收到50枚以上的卵母细胞，这一数量远高于成年母羊10枚左右卵母细胞的超排效果，而且对羔羊成年后的生育能力无任何损伤。这一结果不但提前了母羊的繁殖时间，而且极大地提高了母羊的繁殖潜能，使卵巢卵母细胞得到了充分的利用，为育种过程提供了更为充分的遗传资源。卵巢卵母细胞经体外培养成熟、体外受精处理后，50％以上的卵子可以发育为可供胚胎移植的2-4细胞期胚胎，其中25％的胚胎经移植后可妊娠产羔，这些研究结果为这一技术的应用提供了技术上的保证。
2．采用“式管内”杂交育种工艺对羊进行育种可以降低育种成本。采用本工艺后显著缩短了羊的世代间隔，使用于育种羊的饲养管理时间大大缩短，从而明显地降低了育种过程的饲养管理费用。同时由于本工艺在缩短育种时间的同时又可显著增加子代羔羊的数量，可以为育种过程提供更为充足的遗传资源，从而避免了育种过程中子代羔羊数量不足的情况，否则还需投入大量的人力、物力和财力进行人工繁育，既增加了育种成本，又进一步延长了育种时间。
综上所述，采用“试管内”杂交育种工艺这一新的技术方法对羊进行育种是一种省时、省力、效果好的有效途径。
附图
为本发明的工艺流程图。
实施例本实施例在内蒙古自治区伊克昭盟恩格贝种羊场进行，对内蒙古绒山羊进行杂交育种。选择羊绒质量好，但产绒量较低的阿尔巴斯绒山羊作为母本；选择羊绒质量一般，但产绒量较高的盖县绒山羊为父本。育种目的是培育出产绒量高、羊绒品质好的新绒山羊品种。
对成年阿尔巴斯母羊用FSH+LH进行超数排卵处理，发情后用盖县公羊精液进行人工授精。人工授精后70小时左右采用手术方法从母羊输卵管内回收2~8细胞期胚胎，然后将这些胚胎移入同步发情的受体母羊输卵管内。受体母羊经妊娠后即可产下数量较多的F1代羔羊。
对2-3月龄的F1代母羔羊利用FSH+LH的方法进行超数排卵，在LH注射后15-24小时采用手术方法回收卵母细胞。采卵液为PBS+BSA+10iu/ml肝素，用注射器从卵巢表面发育卵泡中吸取卵母细胞。将回收到的带有完整卵丘细胞的卵母细胞培养于39℃,5％CO2的培养箱中，成熟培养液为TCM199+HCG+FCS+E2，成熟培养时间为20小时。将采自盖县公羊的新鲜精液用BO+2mM咖啡因的培养液离心洗涤两次，然后用0.5μM Ionophore A23187处理1分钟，加入含有卵母细胞的授精小滴中进行体外受精处理。授精处理后6-8小时将卵子移入发育培养系统中继续培养，发育培养液为M199+FCS+丙酮酸钠。将体外发育至2-8细胞期的胚胎移入受体羊输卵管内，受体母羊的经妊娠后产下F2代羔羊。
将2-3月龄的F2代母羔羊按上述方法再次进行体外受精处理，获得体外受精胚胎后移入受体母羊输卵管内，经妊娠后产下F3代羔羊。
F3代羔羊发育至成年期后(2岁)，即可进行横交以固定其遗传特性，达到育种的初步目的。
权利要求
1.羊试管内杂交育种技术，其特征是采取下列步骤；(1)对2-3月龄母羔羊利用FSH-LH进行超数排卵处理，用手术方法从卵巢表面回收卵母细胞，羔羊超排处理后，每只羔羊可以获得50枚以上的卵子；(2)将回收的卵母细胞在体外成熟培养液中培养成熟后，用其他品种的种公羊精子进行体外受精；(3)将体外受精卵在体外发育培养性系统内培养至2-细胞-囊胚期胚胎，移入受体羊输卵管或子宫内；(4)受体羊妊娠、产羔后获得杂交F1代羔羊；(5)F1代母羔羊2-3月龄后再次利用超数排卵的方法获得卵母细胞，用于与其父本相同品系的公羊精子进行体外受精；(6)经体外受精后又可获得体外受精胚胎；(7)将体外受精胚胎移入受体羊子宫内，经妊娠后获得F2代羔羊；(8)F2代母羔羊2-3月龄后经超数排卵处理回收卵母细胞，再次进行体外受精；(9)体外受精后得到的胚胎又可用于胚胎移植；(10)经胚胎移殖后可以获得F3代羔羊；F3代羔羊通过横交的方法固定其遗传性状，达到遗传育种目的。
2.如权利要求1所述的羊试管内杂交育种技术，其特征是步骤1中利用FSH-LH进行超数排卵，在LH注射后15-24小时采用手术方法回收卵母细胞，采卵液为PBS+BSA+10IU/ml肝素。
3.如权利要求1所述的羊试管内杂交育种技术，其特征是步骤2中将回收的卵母细胞培养于39℃、5％CO2的培养液中，成熟培养液为TCM199+HCG+FCS+E2，成熟培养时间为20小时，种公羊精子用BO+2mM咖啡因的培养液离心洗涤两次，然后用0.5μMIOnophoreA23187处理1分钟，加入含有卵母细胞的受精小滴中进行体外受精。
全文摘要
本发明属生物工程技术,本发明利用幼龄母畜超数排卵处理,用手术方法从卵巢表面回收卵母细胞在体外成熟培养液中培养然后,用其他品种的种公羊精子进行体外受精,受精卵体外培养后移入受体羊子宫内,求得F1代杂交羔羊,同样方法求得F2代羔羊F3代羔羊,通过横交方法固定遗传性状,这种育种方法可缩短育种周期,降低育种成本。
文档编号A01K67/027GK1226378SQ9910329
公开日1999年8月25日 申请日期1999年4月1日 优先权日1999年4月1日
发明者旭日干 申请人:旭日干