成熟脂肪组织β-catenin敲除的小鼠模型的构建方法
【技术领域】
[0001] 本申请设及动物模型的建立方法，具体而言，设及成熟脂肪组织P-catenin敲除 的小鼠模型的构建方法。
【背景技术】
[0002] 肥胖症是一种由某些特定的生理遗传因素参与的能量代谢平衡发生素乱的疾病 状态。随着全球工业化、都市化进展W及社会经济的迅猛发展和生活方式的剧烈改变，近 二=十年肥胖症的发病率急剧增长，已成为"全球蔓延的慢性非传染性疾病"，严重威胁 人类的健康。研究表明，美国成年男性肥胖患者在年龄大于20岁人群中所占的比例高达 35. 5%，成年女性高达35. 8%。本中屯、全国10万人大型流行病学调查资料显示，年龄大于 18岁的自然人群经抽样调查，超重人群比例达到30 %，而肥胖人群比例则达到了 5. 72 %， 由此可见国内肥胖症的发病形势也日益严峻。事实上，国内儿童、青少年肥胖已初见端倪。 由于肥胖症是2型糖尿病、屯、血管疾病W及某些肿瘤如大肠癌，乳腺癌等疾病的重要危险 因素，肥胖相关疾病患者的死亡率明显增加，该疾病已成为严重影响全球公共卫生的社会 经济问题。为此世界卫生组织（WHO)认为肥胖是21世纪最严重的公共健康问题，2013年美 国医学会已经正式将肥胖定义为一种疾病。因此开展肥胖症发病机制相关研究对于筛查肥 胖易感人群、治疗肥胖症、预防肥胖症在儿童和青少年群体的大规模爆发极为重要。
[0003] 脂肪组织来源于中胚层的间充质干细胞（MSC)。间充质干细胞可W分化为骨骼，肌 肉，脂肪和软骨。在调节间充质干细胞向脂肪分化发育的信号通路和因子中，Wnt信号通路 发挥重要作用。经典Wnt信号通路通过调节P-catenin核转位传递信号，参与细胞命运决 定、增殖、分化W及肿瘤生成等多个生理病理过程。在缺乏Wnt配体刺激时，P-catenin在 胞浆内与Axin、APC和GSK3等组成的降解复合体结合并被憐酸化，经蛋白酶体而进入泛素 化蛋白降解途经；而当Wnt配体（如WntUWntl化或Wnt3a等）刺激存在时，其与细胞表面 辅助受体包括Fzd(化izzled)-LRP5或Fzd-LRP6结合，促发P-catenin降解复合体解离， 于是胞浆P-catenin量增加，进而转位至细胞核，作为TCF/LEF共激活因子促进下游基因 转录。多项研究均已表明Wnt/P-catenin信号通路是白色脂肪分化发育的负性调控因素。 目前已发现Wnt/P-catenin/TCF/LEF下游祀基因切clinD1、WISP2、C0UP-TFIIW及Id2 等均可通过抑制脂肪分化转录因子PPAR丫和C/EBPa的表达，发挥抑制白色脂肪分化的作 用。
[0004] 临床病例研究W及转基因动物模型研究的结果表明，Wnt信号通路上的分子异常 能够导致肥胖及代谢综合征的发生。比如，在肥胖家系可检测出Wntl化基因突变，LRP6 基因突变可导致高血脂、高血压W及糖尿病的发生，LRP5基因突变可W引起人体脂肪的分 布改变，TCF7L2的多个基因多态性位点在多个人群被证实与糖尿病发生存在显著关联， Ap2-Wntl化转基因小鼠抵抗高脂饮食诱导或遗传异常导致的肥胖。运些证据均表明，经典 Wnt/P-catenin信号通路可抑制白色脂肪的分化，参与体重调节或影响能量代谢。在对栋 色脂肪发育调节方面，仅有零星研究提示，早期激活该通路可抑制栋色脂肪分化，而后期激 活则可促进栋色脂肪向白色脂肪转化，但具体证据仍十分有限。随着白、栋色脂肪成为肥胖 抵抗的干预祀点，阐明经典Wnt信号通路在脂肪发育及能量代谢方面的参与作用具有非常 重要的科学意义和临床意义。
[0005] 遗憾的是，在脂肪组织特异性敲除P-catenin的工作至今未见报道；而运对于认 识经典的Wnt通路在肥胖发生与体重调节中的作用至关重要。
【发明内容】
[0006] 发明人利用P-catenin"°x/"°x和曰diponectin-cre小鼠进行交配，首次建立脂肪 组织特异性P-catenin敲除小鼠（P-catenin"°x/"°x;Adip〇Q-cre)，从而从体内水平探究 0 -catenin在脂肪发育过程中的作用。运对于从机体整体水平认识WNT通路，尤其是经典 WNT通路在脂肪发育与体重调节中的作用至关重要。
[0007] 具体而言，本发明一方面提供了一种成熟脂肪组织P-catenin敲除的小鼠模型 的构建方法，其特征在于，包括W下步骤：
[000引 分别选用0-catenin"M/"M小鼠与Adiponectin-Cre小鼠繁殖，得到F1代： P-cateninflox/+ ;AdipoQ-Cre;
[0009] 将FI代进行繁殖，得到F2代P-catenin"心"。X和p-catenin"°x/"°x;Adip〇Q_化e 的敲除小鼠。
[0010] 在某些【具体实施方式】中，所述P-catenin"°x/"M小鼠为SPF级；
[0011] 在某些【具体实施方式】中，所述P-catenin"M/f心小鼠具有巧7BL/6J背景。
[0012] 在本发明的另一方面，提供了一种通过权利要求1所述方法构建的成熟脂肪组织 P-catenin敲除的小鼠模型在研究P-catenin在脂肪发育过程中的作用的应用。
[001引通过上述技术方案，本发明提供了一种构建的小鼠模型的方法，其在探讨经典wnt信号通路核屯、分子P-catenin在体重调节和肥胖发生中的作用具有较为重要的意义。
【附图说明】
[0014] 图1为成熟脂肪组织P-catenin敲除的小鼠模型（ABK0小鼠）的繁殖模式图。
[0015] 图2为正常小鼠和ABK0小鼠高脂饮食体重变化曲线对照图。
[0016] 图3为正常小鼠和ABK0小鼠葡萄糖耐量对照图。
[0017] 图4为正常小鼠和ABK0小鼠血清膜岛素水平对照图。
【具体实施方式】[001引小鼠繁裙
[001 引 采用SPF级P-catenin"°x/"°x小鼠（C57I3L/6J背景）与Adiponectin-Cre小鼠繁 殖，获得F1 代（0-cateninflox/+ ;Ap2-Cre或者P-cateninflox/+ ;AdipoQ-Cre)之后，再 用双杂合的F1进行繁殖，即可获得F2代对照小鼠P-catenin"M/"M;Adip0Q-Cre的敲除小 鼠。
[0020] 小鼠在W下条件分笼喂养：标准商业小鼠饲料（4. 5%脂肪，4%纤维素，21%蛋 白质、1. 404kcal/g)、高脂饲料购自ResearchDiet(60%脂肪，20%碳水化合物，20%蛋白 质），室溫20-22°C，自由摄食和饮水，稳定的人工光照周期化:00到18:00光照，18:00到 6:00黑暗）。8周龄雄鼠和雌鼠按1 :2比例合笼交配。
[0021] 一周幼鼠基因型鉴定，=周幼鼠离乳、标记、分笼。没有特殊说明的，所有试验均采 用雄性小鼠。实验所用动物均由上海交通大学医学院动物中屯、伦理委员会提供监管。
[0022] 如图1所示，发明人建立了Adiponectin启动子驱动的ere重组酶介导的成熟脂 肪细胞P-catenin敲除的小鼠模型。在获得的F2子代小鼠中，通过基因组DNAPCR的方 法初步筛出敲除小鼠。
[0023] 基闲巧鉴定
[0024] 引物序列来自化ckscmL油网站
[00巧]beta-cateninfhx/fhx小鼠PCR引物序列：
[0026] 1512：AAGGTAGAGTGAAAGTTGTT
[0027] 1513：CACCATGTCCTCTGTCTATTC
[0028]Beta-cateninPCR反应体系见下：
[0029]
[0030] 96孔PCR反应板中加入上述混合液后离屯、数秒，每孔加石蜡油一滴。PCR反应在 Eppendo;rfMastercycleGradientPCR热循环仪上进行。
[0031] PCR扩增条件为：
[0032] 94°C3min;94°C30s，60°C30s，72°C30s，35(：ycles72°C2min，Holdl4°C
[0033] AP2-CreW及AdipoQ-Cre小鼠引物序列
[0034]OIMR1084-GCGGTCTGGCAGTAAAAACTATC
[0035]OIMR1085-GTGAAACAGCATTGCTGTCACTT
[0036]OIMR7338-CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT
[0037]OIMR7339-GTAGGTGGAAATTCTAGCATCATCC
[0038] PCR反应体系见下：
[0039]
[0040]
[00川 96孔PCR反应板中加入上述混合液后离屯、数秒，每孔加石