含有香芹酚和麝香草酚的抗微生物组合物的制作方法
【专利说明】含有香芹齡和薦香草齡的抗微生物组合物
[0001] 本申请要求2013年5月7日提交的美国专利申请61/820455的优先权，并将其W 整体通过援引加入本文。
【背景技术】
[0002] 本发明一般设及具有抗微生物性质的化合物，并且更具体地设及香芹酪和廳香草 酪的抗微生物性质。
[0003] 抗生素在全世界畜牧业中的使用正在受到前所未有的挑战，许多国家已经禁止 使用某些抗生素（Windisch，W.，K. Schedle, C. Plitzner and A. Kroismayr. 2008. Use of phyto genie products as feed additives for swine and poultry.J. Anim. Sci. 86 (E Suppl) :E140-E148)。虽然许多合成的分子能有效抗食物传播的病原体，但是"天然"分 子例如源自植物和益生菌的那些的应用作为抗生素应用的替代品正在获得关注。香芹 酪和廳香草酪是牛至油的两种成分，其对革兰氏阴性（G-)菌和革兰氏阳性（G+)菌均具 有抗微生物活性，运些化合物的效力在文献中有充分记载化elender，I.，H-L Alakomi, K. Latva-Kala，T. Mattila-Sandholm，I. Pol，E.Smid，L Gorris and A. von Wright. 1998. Characterization of the action of selected essential oil components on gram negative bacteria. J. Agric. Food Chem. 46 :3590-3595 ;Sokovic，M.，P. Marin，D. Brkic and L van Griensven. 2007. Chemical composition and antibacterial activity of essential oils of ten aromatic plants against human pathogenic bacteria. Food : Global Science Books ;Derwich，E.，Z.Benziane，A. Manar，A. Boukir and民.Taouil. 2010. Phytochemical analysis and in vitro antibacterial activity of the essential oil of Origanum vuIgare from Morocco. Am-Euras. J. Sci.民es. 5 (2) :120-129 ;Michiels， J.，J. Missotten，D. Fremaut，S. De Smet and N. Dierick. 2007. In vitro dose-response of carvacrol，thymol，eugenol and trans-cinnamaldehyde and interaction of combinations for the antibicorbial activity against the pig gut flora. Livestock Science 109 :157-160 ;Bajpai，V.，K-H. Baek，and S. Kang. 2011. Control of Salmonella in foods by using essential oils :a review. Food民esearch International.文章在出 版中）。对于精油可接受的作用方式是所述油的疏水性，疏水性能够使所述油穿透革兰氏阴 性细菌的外细胞膜，破坏膜结构^及引起离子渗漏（Wimiisch et al. ,2008 ;Rasooli，I.， 2007. Food preservation-a biopreservative approach. Food. Global Science Books; Guarda，A. J. RubiIar，J. Miltz and M. Galotto. 2011. The antimicrobial activity of microencapsulated thymol and carvacrol. Int. J. Food Microbiol. 146 :144-1580)。据 记载，显示最高程度的微生物抑制的精油含有高含量的酪类化合物，如香芹酪和廳香草酪 (Rasooli，2007)。香芹酪和廳香草酪是径基位于酪环不同位置上的结构异构体。运两种分 子的抗微生物活性是类似的，似乎没有受到径基位置的影响（Rasooli，2007)。
[0004]
[0005] 香芹酪和廳香草酪抑制微生物生长的水平根据攻击的生物体W及测试方法有所 不同（Rasooli，2007)。因此，有效抑制选定的微生物的生长的最小抑制浓度（MIC)是使用 香芹酪和廳香草酪标准品通过微孔板试验测定的。由于需要少量的试验材料，重复孔易于 制备，能够筛选多种处理水平W及能够联合抗微生物剂W观察协同、相加或括抗效应，微孔 板试验是常用的而且方便的（Rasooli，2007)。
[0006] 一些有竞争力的产品目前正在被Ralco,Meriden,DSM，Biomin和Delacon销售。 Kemin的特种作物改良（SCI)计划正在开发含有大于5%香芹酪（W干重计）和大于3.8% 廳香草酪（W干重计）的牛至植物品系。从运些植物中提取的油将被用于开发一种用于动 物饲料的新的抗微生物产品，W及W独有的配方混合，制备独特产品W进入饲料添加剂市 场。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明的主要目的是为了确定富含香芹酪和廳香草酪的油的最有效的混合物，其 可W引起对选择的食品安全病原菌--大肠杆菌巧.coli)和肠炎沙口氏菌（Salmonella 化teritidis)的抑制。还测定了对有益肠道细菌如乳酸菌和CLOSTAT?i^。。<1D巧Direct-FedMicrobial化eminIndustries,DesMoines，Iowa)中的活性微生物枯草芽抱 杆菌度acillussubtilis)PB6的处理效果。
[0009] 从牛至植物中提取的精油中的香芹酪和廳香草酪的最小抑制浓度（MIC)通过微 孔板试验来测定。使用3X3或4X4矩阵来评价香芹酪和廳香草酪单独或组合的抗微生物 效果。香芹酪（98% )和廳香草酪巧9. 5% )在大于125ppm但小于25化pm的水平抑制肠炎 沙口氏菌和大肠杆菌的生长。在所提取的油中为80%或68%的香芹酪分别需要> 175或 > 20化pm的香芹酪W抑制两种生物体。廳香草酪在油中的浓度恒定在70%，需要> 20化pm W抑制同样的两种生物体。本发明证实含有68%或80%香芹酪的油和含有70%廳香草酪 的油W2 : 1或1 : 2的香芹酪：廳香草酪比例的组合在肠炎沙口氏菌和大肠杆菌的生长 抑制方面是有效的。
[0010] 附图简要描述
[0011] 图1A-1C是动力学生长曲线图表，其显示了标准品C(香芹酪）、T(廳香草酪）或 C:T(香芹酪：廳香草酪）对肠炎沙口氏菌（A)、大肠杆菌度）和枯草芽抱芽抱杆菌PB6 (C) 的效果；配方参照表1。
[0012] 图2A和2B是显示终点生长曲线的图表，其显示了标准品C、T或C:T对肠炎沙 口氏菌（A)和PB6度）的效果；配方参照表2。
[0013] 图3A和3B是动力学生长曲线图表，其显示了使用从植物中提取的牛至油的处 理一一HC(高香芹酪）、HT(高廳香草酪）或HC:HT(高香芹酪：高廳香草酪）一一对大肠 杆菌（A)和PB6度）的效果。当使用香芹酪和廳香草酪标准品时，调整所提取的油的处理水 平W匹配前述水平。处理配方参照表3。
[0014] 图4A-4D是动力学生长曲线图表，其显示了处理一一肥油、HT油或肥：HT油一一 的效果。
[001引发明详述
[0016] 牛至植物已经长期被认为是香芹酪和廳香草酪的来源。牛至属成员在由植物产生 的香芹酪和廳香草酪的量上变化很大。我们的研究表明，一些成员主要产生香芹酪，超过廳 香草酪，而其它成员主要产生廳香草酪，超过香芹酪。传统植物育种技术被用来培育具有W 干重计大于20毫克/克、达50毫克/克、高达至少69. 7毫克/克的香芹酪的无性牛至品 系。运些高香芹酪品系通常含有低水平的廳香草酪，香芹酪与廳香草酪的比例在10 : 1、 50 : 1、高达至少713 : 1。此外，传统植物育种技术被用来培育具有W干重计大于7毫克 /克、达30毫克/克、高达至少38. 5毫克/克的廳香草酪的无性牛至品系。运些高廳香草 酪的品系通常含有低水平的香芹酪，廳香草酪与香芹酪的比例在5 : 1、10 : 1、高达至少 49. 7 : 1。
[0017] 首先使用香芹酪和廳香草酪标准品测定抑制水平。随后，将从内部种植的植物提 取的HC:HT油渗混，达到香芹酪和廳香草酪的目标水平。进行进一步的抑制试验来验证 所述油混合物的效果。
[0018] 标准品。廳香草酪和香芹酪购自Sigma-Al化ich化学公司。
[0019] 牛至油。运些试验所用的牛至油从内部种植的植物中提取。已经鉴定出了高香芹 酪含量（肥）的植物品系。具体而言，开发了高香芹酪品种KI-0V1750,其是2013年5月7 日提交的美国专利申请61/855067(W其整体通过援引加入本文）的主题。合并从HC植物 品系中提取的油，得到67. 7%的香芹酪含量（廳香草酪含量0. 93% )。已经鉴定出了高廳 香草酪含量（HT)的植物品系。具体