芽孢杆菌种的生物质和代谢物的生产方法及其用于生物害虫防治的组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种增加包括枯草芽抱杆菌度acillusSUbtiliS)和解淀粉芽抱杆菌 度acillusamyloliquefaciens)的芽抱杆菌种的生物质和代谢物的生产的方法。该方法包 括适宜的培养基和特定的环境条件，使得能够生产大量的丰原素、表面活性肤和伊枯草菌 素家族的生物质和代谢物，其表现出对各种植物致病剂的抗真菌及抗细菌活性。
【背景技术】
[0002] 在用于生物防治的微生物中，芽抱杆菌种属的细菌受到广泛关注，因为它们能产 生多种多样的抗生素化合物、保存期限长、培养时生长迅速、W及它们能够在叶面大量繁殖 [1，2, 3, 4]。尤其是，特定种类的芽抱杆菌例如枯草芽抱杆菌、解淀粉芽抱杆菌、蜡样芽胞 杆菌度acilluscereus)、葦状芽胞杆菌度acillusmycoides)、炭痘芽抱杆菌度acillus ant虹acis)及苏云金芽抱杆菌度acillusthurigiensis)显示出抗微生物活性[4]。
[0003] 运些细菌的抗微生物活性源于它们产生表面活性肤、伊枯草菌素和丰原素家族的 脂肤的能力，运些脂肤的氨基酸序列及脂肪酸链的分支不同。表面活性肤表现出高的抗细 菌活性，而伊枯草菌素和丰原素则因其抗真菌活性为人所知[4]。
[0004]现有技术描述了使用枯草芽抱杆菌和解淀粉芽抱杆菌在多种作物中控制各种致 病微生物，上述作物包括水果和蔬菜作物例如黑替、葡萄、覆盆子、草替、西红柿、黄瓜、黑胡 椒、澄、哈密瓜、苹果、桃、番慕枝、香蕉、木瓜、芒果和雜猴桃。
[0005] ￡?2311936公开了一种枯草芽抱杆菌菌株松1化口6 6?-569)作为生物控制剂 在藤木植物中抵抗几种植物病原微生物。W098/21968公开了枯草芽抱杆菌AQ153(ATCC 55614)产生的一种抗生素，其能有效对抗细菌和真菌感染，并且也可W作为用于保护植物 的方法，其包含运些抗生素化合物的应用。
[0006]W09850422和W00029426公开了枯草芽抱杆菌菌株AQ713(NRRLB21661)及其突变 体产生的其它抗生素化合物，其显示出杀虫、抗真菌和抗细菌活性。W09909819公开了枯草 芽抱杆菌菌株AQ713(NRRLNo. 21665)的抗生素，其产生具有杀虫活性的代谢物及一种高分 子量的可溶于水的代谢物，其显示出对抗玉米根虫和其它线虫的杀虫及杀线虫活性。
[0007]US2011/0318386描述了通过使用芽抱杆菌属的生物控制剂诱导针对各种病原体 的系统抗性，特别是分离的摩加夫芽抱杆菌化mojavensiS)203-7和分离的葦状芽胞杆 菌。接着ES2345969描述了一种用于香蕉和大蕉假茎（plantainpseudostems)的植物强 化剂（phytostrengthener)，其包括枯草芽抱杆菌、绿色木霉菌（Trichodermaviride)和 巨大芽抱杆菌解憐变种化megateriumvar地OS地ati州m)。
[0008]US2012/00031999公开了一种针对各种真菌病害，包括香蕉的黑叶斑病的控制策 略，基于应用合成的杀真菌剂和一些生物控制微生物及其代谢物（特别是枯草芽抱杆菌菌 株QST713,对应于商用产品Serena化"的菌株）。
[0009] 现有技术中公开的芽抱杆菌种的微生物的生产过程中，其生产的生物质的量非常 低，因为所获得的细胞密度一般不大于5.O克/升巧，9]。因此，有必要开发新的方法W增 加生物质及其活性代谢物的产量。
[0010] 类似的，有必要从运些微生物和/或其生物活性代谢物中开发出具有更高效力和 选择性的生物杀伤组合物，用于在各类作物上控制不同的植物致病剂。
【附图说明】
[0011] 图1不出了枯草芽抱杆菌EA-CB0015生产的丰原素C的结构。
[0012] 图2示出了枯草芽抱杆菌EA-CB0015在不同培养基中的细胞密度。
[0013] 图3示出了枯草芽抱杆菌EA-CBOOl5的化合物的HPLC色谱图。
[0014] 图4示出了枯草芽抱杆菌EA-CB0015的P5纯化的脂肤（m/z1429. 9)的MS/MS图 谱。
[0015] 图5示出了枯草芽抱杆菌EA-CB0015的内醋环经碱水解后，P5纯化的脂肤（m/ Z1447. 8)的MS/MS图谱。
[0016] 图6示出了枯草芽抱杆菌EA-CB0015在各种培养基中生产的脂肤的曲线下面积。
[0017] 图7示出了枯草芽抱杆菌EA-CB0015对各种植物病原性微生物产生的抑制百分 比。
[0018] 图8示出了在不同培养基中获得的枯草芽抱杆菌EA-CB0015WS所产生的斐济球 腔菌（Mycosphaerellafijiensis)的生长抑制百分比。
[0019] 图9示出了包含在本发明的各种组合物中的枯草芽抱杆菌EA-CB0015的活力。
[0020] 图10示出了在溫室水平用本发明不同组合物处理的香蕉植株的黑叶斑病的严重 程度。
[0021] 图11示出了用本发明不同组合物处理的香蕉叶的黑叶斑病造成的坏死面积百分 比。
[002引图12示出了各种辅助紫外线扣V)保护剂对枯草芽抱杆菌EA-CB0015的活力的影 响。
[002引 图13示出了各种助剂对基于枯草芽抱杆菌EA-CB0015的组合物（M肥0和P2)的 粘附的影响。
[0024] 图14示出了基于枯草芽抱杆菌EA-CB0015的水基的混合物组分在溫室水平对香 蕉叶的坏死面积百分比的影响。
[00巧]图15示出了感染黑叶斑病的香蕉叶用各种产品处理后的照片。
[0026] 图16示出了基于枯草芽抱杆菌EA-CB0015的水基组合物在实地水平对香蕉黑叶 斑病严重性的影响。
[0027] 图17示出了枯草芽抱杆菌EA-CB0015对灰霉病菌度Ot巧tisCinerea化AHP-009 在绒球菊花中导致的疾病的严重性的影响。
[0028] 图18不出了枯草芽抱杆菌EA-CB0015在树番茄（木本番茄，切地Oman化a betacea)中对炭痘菌的效果。
【发明内容】
[0029] 本发明允许解决运些或其它的缺点，因为其包含增加芽抱杆菌属微生物的生物质 及其生物活性代谢物，例如表面活性肤、伊枯草菌素和丰原素家族的脂肤的生产的方法，芽 抱杆菌属微生物包括枯草芽抱杆菌EA-CBOO15和解淀粉芽抱杆菌EA-CB0959。
[0030] 此外，本发明还包含农用化学品组合物，其包括不同芽抱杆菌种的微生物和/或 其活性代谢物，单独的或是与生物杀伤剂一起，用于控制所述植物致病剂，例如斐济球腔 菌、尖抱镶刀菌（F'usariumoxysporum)、青枯病菌（Ralstoniasolanacearum)、灰霉病菌、 炭痘病菌、念珠菌属（Moniliasp.)、立枯丝核菌巧hizoctoniasolani)和腐皮镶刀菌 (化sariumsolani)。不同枯草芽抱杆菌种的微生物包括枯草芽抱杆菌EA-CB0015和解淀 粉芽抱杆菌EA-CB0959。
[0031] 本发明还设及包括枯草芽抱杆菌EA-CB0015和解淀粉芽抱杆菌EA-CB0959的芽抱 杆菌种的微生物的使用，，和/或其活性代谢物W及含有它们的农用化学品组合物的使用， 用于抑制农作物中植物病原微生物例如斐济球腔菌的生长。
【具体实施方式】
[0032] 为了增加芽抱杆菌种微生物的生物质及其代谢物（脂肤）的生产，该微生物必须 培养于适宜的介质并在增加生物质及其代谢物的生产所必须的环境条件下培养。为此，制 备培养基（W下称为培养基D)，包括选自由固体、半固体或液体基质形式的碳水化合物、 酵母提取物、硫酸锭、蛋白腺、含儀、硫、儘、氯、钟、憐、巧和钢的盐组成的组的一种或多种组 分。
[0033] 实现本发明的方法所必须的环境条件包括溫度、pH、揽拌速度、发酵时间及通气。 本发明的方法可W在实验室W小规模进行，或是在生物反应器中W大规模进行。
[0034] 在一个优选实施方式中，培养基D包括，W质量/体积（w/v)百分比计，3.2%至 3. 4%的葡萄糖、3. 1 %至3. 3%的酵母提取物、2. 5x10 3%至4. 5x10 3%的硫酸儘、2x10 3% 至4x10 3%的氯化巧、0. 08 %至0. 12 %的硫酸锭、0. 35 %至0. 45%的硫酸儀、0. 04 %至 0. 12 %的憐酸二钢W及0. 04%y0. 12 %的憐酸单钢钟。
[0035] 在本发明另一个更优选的实施方式中，培养基D包括，W质量/体积（w/v)百分 比计，3. 34%的葡萄糖、3. 25 %的酵母提取物、4. 2x10 3%的硫酸儘、3. 1x10 3%的氯化巧、 0. 1 %的硫酸锭、0. 4 %的硫酸儀、0. 05 %的憐酸二钢钟、0. 05 %的憐酸单钢钟。
[0036] 在本发明的方法的一个优选实施方式中，微生物的培养周期为24至96小时，伴随 揽拌速度为400至60化pm,通气1至5vvm，溫度在20°C至40°C之间，抑在5. 5至7. 5之间。 强酸例如硫酸和/或强碱例如氨氧化钢可用于控制和/或调节pH。还可添加表面活性剂和 止泡剂W控制泡沫形成。
[0037] 在上述条件下实施的方法，能够增加芽抱杆菌种微生物的生物质和活性代谢物的 生产。通过本发明的方法获得的生物质可使用常规的离屯、或微量过滤方法从培养基中分 离，而活性代谢物可通过溶剂萃取、沉淀、吸附或色谱法获得。
[0038] 在本发明一个优选实施方式中，获得的芽抱杆菌种微生物的生物质的量的范围在 3. 0至20.Og/L之间，优选为7. 0至18.Og/L之间，而代谢物的浓度的范围在200至ISOOmg/ L之间，优选为500至lOOOmg/L之间。
[0039] 在一个优选实施方式中，本发明的方法能够增加枯草芽抱杆菌EA-CB0015和解淀 粉芽抱杆菌EA-CB0959的生物质和活性代谢物的生产。16SrDNA分析鉴定证实枯草芽抱杆 菌EA-CB0015对应于沈QIDNO:1序列，其W登录号KC006063储存在GenBank中。
[0040] 通过本发明的方法获得的枯草芽抱杆菌EA-CBOO15和解淀粉芽抱杆菌EA-CB0959 的代谢物包括表面活性肤、伊枯草菌素和丰原素类型的脂肤。通过质谱法和色谱技术的分 析鉴定出一种由枯草芽抱杆菌EA-CB0015生产的新的丰原素亚型，称为丰原素C，其氨基酸 序列为（Glul-0rn2-Tyr3-THR4-Glu5-Val6-Pro7-Gln8-l'虹9-IlelO)，在位置 9 不同于丰原 素B序列，在位置6和9不同于丰原素A序列。
[0041] 此外，按照本发明的方法用于枯草芽抱杆菌EA-CB0015,该菌株能生产14种不同 的丰原素C同源物，通式