一种捕食线虫性真菌冻干制剂及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种冻干制剂及其制备方法与应用，具体涉及一种捕食线虫性真菌冻 干制剂及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 胃肠道线虫病是家畜最常见的寄生蠕虫病，呈全世界性分布，给畜牧产业造成严 重的经济损失。长期以来主要依赖化学驱虫药来控制家畜胃肠道线虫，随着驱虫药的不 断使用，线虫对驱虫药的抗药性不断地增强，以及造成环境污染、畜产品中化药的残留等问 题。
[0003] 捕食线虫性真菌是一类由营养菌丝特化形成捕食器捕捉线虫的真菌，它们是线 虫的自然天敌，对线虫具有独特的捕获和致死能力，因此，利用食线虫真菌对家畜寄生 线虫自由生活阶段的幼虫进行生物防治来替代化学驱虫剂是非常有潜力的防治手段。 Arthrobotrys(Duddingtonia)flagrans是典型的能够产生三维粘性网的菌之一，该菌由 于在培养的中后期能够产生大量的厚垣孢子，其双层壁的厚垣孢子对酸碱和消化酶有耐受 性，可在通过动物的胃肠道时存活下来。正是由于这个特性，厚垣孢子可通过口服给家畜， 然后与产生的虫卵随粪便一起排出体外，温度适宜时虫卵发育孵化出幼虫，厚垣孢子也随 之萌发成菌丝，进而由线虫的刺激产生三维粘性网杀死线虫。
[0004] 目前，Arthrobotrys(Duddingtonia)flagrans在动物线虫寄生的生物防治上进 行了大量的研究，国内外已对捕食线虫性真菌Arthrobotrys(Duddingtonia)flagrans的 菌丝团块或菌厚垣孢子制备成冻干制剂，例如现有技术CN201410227501.3中公开了一 种捕食线虫性真菌生物冻干制剂的制备方法，将捕食线虫性真菌(ΠΜ菌株在大麦粒培养 基上进行厚壁孢子的批量培养，然后用0.2%吐温洗脱并保护厚壁孢子，再分装灭菌、预 冻、真空冷冻干燥后获得。该发明中吐温既可作分散剂也可充当保护剂，但吐温浓度太 低对厚垣孢子的保护作用不明显，若浓度在5%以上虽能起到保护作用，但因粘度高无 法冻干。至今研究尚未解决生防制剂的批量化生产、规格化和有效含量的标准化问题。 因此，在动物寄生虫病防治中所面临的重要问题是，如何制备一种既能让家畜随草料口 月艮，不被消化酶破坏；更能够在保存、运输等环节保持良好活性，减少对捕食线虫性真菌 Arthrobotrys(Duddingtonia)flagrans厚垣孢子损伤的可规模生产的食线虫性真菌冻干 制型。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，一种捕食线虫性真菌冻干制剂及其制备方法与应 用。
[0006] 本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种捕食线虫性真菌冻干制剂，是将 捕食线虫性真菌Arthrobotrys(Duddingtonia)flagrans分离株进行厚垣孢子批量培养， 然后0. 04%~0. 06%的灭菌吐温-80洗脱、过滤制成0. 3~0. 6X106个/ml的孢子液，接 着用10%~20%的β-环状糊精洗脱保护，最后经预冻、真空冷冻干燥后制成。
[0007] 进一步，所述捕食线虫性真菌分离株SDH035,属于鞭式节丛孢（Arthrobotrys f·lagrans)，其保藏编号为CGMCCN0.11210，保藏日期为2015年8月31日，保藏单位：中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC;保藏地址：北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，邮编100101。
[0008] 本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种捕食线虫性真菌冻干制剂 的制备方法，包括以下步骤：
[0009] (1)孢子液的制备：将捕食线虫性真菌分离株在培养基（优选玉米和小麦联合谷 粒培养基）上进行厚垣孢子批量培养15~45天，然后用0. 04%~0. 06%的灭菌吐温-80 洗脱厚垣孢子，过滤（优选两层灭菌纱布过滤），制成含厚垣孢子浓度为〇. 3~0. 6X106个 /ml的孢子液；
[0010] (2)冻干保护剂的洗脱保护：将孢子液与等量10%~20%的β-环状糊精混合均 匀；
[0011] (3)预冻、真空冷冻干燥：置于-20°C预冻过夜后，在冷阱温度-45~-50°C、真空 度8~10Pa的条件下进行真空冷冻干燥14~18小时，即得捕食线虫性真菌口服生物制剂。
[0012] 本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种捕食线虫性真菌冻干制剂在动物 寄生线虫生物防治中的应用。
[0013] 本发明之捕食线虫性真菌冻干制剂不仅可口服，节约成本，方便实施，而且更能够 在保存、运输等环节保持良好活性，对厚垣孢子起到很好的保护作用。本发明制备方法不仅 适合于保存菌种，更适合于规模化生产冻干制剂。
[0014] 实验证明，本发明之捕食线虫性真菌冻干制剂在体外对三期幼虫的杀虫率可达 97%以上。
【附图说明】
[0015] 图1为冻干后的样品。1、不加保护剂的对照组；2.、加入5%β-环状糊精保护剂； 3、加入10%β-环状糊精保护剂；4、加入15%β-环状糊精保护剂；5、加入20%β-环状 糊精保护剂。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合实施例对本发明进一步加以说明。
[0017] 实施例1:捕食线虫性真菌冻干制剂的制备
[0018] (1)捕食线虫性真菌Arthrobotrys(Duddingtonia)flagrans分离株SDH035 的分 离、纯化、分离鉴定
[0019]SDH035于2014年8月，从来源于宁夏吴忠地区羊粪堆所采的5份样品中采用改 良的平板撒布法分离，分离时在平皿中加入绵羊线虫第三期幼虫作诱饵25°C孵化，每天 或隔天在倒置显微镜下检查一次，持续3周，挑出单个的捕食结构或被捕食的线虫，转接 入0. 2 %麸皮琼脂25°C培养3-14天，待有分生孢子长出后，挑取单个的分生孢子于另一个 〇. 2%麸皮琼脂平皿中直至获得纯培养物。通过玻片插入法获得该菌株分生孢子的形态和 数据测量，并提取该菌种的DNA，用引物ITS1和ITS4 (white等1990和campos等2010)进 行扩增rDNA中5. 8S、ITS-1和ITS-2序列。其结果从5份样品15份平皿中分离纯化获得 SDH035菌种一株，形态学和分子学鉴定该菌与A.flagrans相一致。SDH035的形态特征为： 在2%玉米粉琼脂中菌落为白色，菌丝较为稀疏，菌丝透明、分隔、分枝，当培养至7天时就 可产生大量的厚垣孢子，而分生孢子相对很少；分生孢子梗透明、直立、分隔，长117. 5~ 387. 5(平均为241. 59)μπι，基部宽5~7· 5μπι，端部宽2. 5~5μπι;分生孢子呈卵圆形、 长卵圆形和椭圆形，以1个分隔为主，偶有2个分隔或3-4个分隔，0个分隔的也时常可见； 分生孢子长20~57. 5 (平均为38. 89)μm、宽10~17 (平均为12. 87)μm。此外，当28°C 培养在玉米与小麦粒联合培养基，3天即可产生大量的圆形性、椭圆形的厚垣孢子（可达到 6X104个/克），直径15~30 (平均25. 8)μm。
[0020] SDH035的主要生理、生物学特征为：该菌在12°C-35°C范围内能生长，最佳生长温 度为28°C;在pH为2~13范围内能够生长，最佳生长pH值为9~10 ;生长的相对湿度在 90%~100%为最佳；该菌在水琼脂上产生厚垣孢子而不产生分生孢子；厚垣孢子能够耐 受紫外线照射12小时；干燥能引起厚垣孢子的萌发率快速下降；厚垣孢子能够耐受40~ 50°C水浴处理1小时，但60°C水浴作用30分钟后仅个别萌发，60°C以上作用30分钟后不能 萌发。该菌与绵羊三期幼虫和秀丽新杆线虫互作后，产生三维粘性网并捕捉线虫。
[0021] (2)将捕食线虫性真菌分离株SDH035在玉米和小麦联合谷粒培养基上进行批量 培养15~45d，然后用0