一种昆虫病原线虫的培养工艺的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种昆虫病原线虫的培养工艺，其特征在于：具体步骤包括：(a)制备共生细菌；(b)控制线虫培养参数；(c)接种共生细菌培养4天后，再接种线虫；(d)线虫收获、清洗和储存。本发明固体培养方法通过无菌操作技术，在人工培养基中接种共生细菌和单菌线虫一级种后进行大量培养，能够提高侵染期线虫产量，降低生产成本，并且生产的侵染期线虫具有很好的致病力，对昆虫病原线虫的规模化生产和对地下害虫的生物防治具有非常重要的意义。
【专利说明】
一种昆虫病原线虫的培养工艺
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物繁殖培养的技术领域，特别是昆虫病原线虫的培养工艺的技术领域。
【【背景技术】】
[0002]斯氏线虫科Steinernematidae的斯氏线虫属Steinernema线虫和异小杆线虫科Heterorhabditidae的异小杆线虫属Heterorhabditis线虫是昆虫病原线虫，它们是目前国际上新型的生物杀虫剂。斯氏线虫属和异小杆线虫属线虫分别与肠杆菌科Enterobacteriaceae嗜线虫杆菌属Xenorhabdus和发光杆菌属Photorhabdus的细菌互惠共生，作为昆虫的“蛔虫”与其体内专化性携带的共生细菌一起致死寄主昆虫。与其它生物杀虫剂相比，这类线虫具有广泛的寄主范围；对寄主具主动搜索能力，特别对土栖性及钻蛀性害虫;对人畜、植物及有益生物安全，在欧美的一些国家可以豁免注册使用；易于大量培养；使用方便;在环境中可循环利用;能与多种化学和生物杀虫剂混用;并可用传统药械或灌溉设施来施用等优点。
[0003]近年来，作为新型生物杀虫剂，昆虫病原线虫已广泛应用于农林、牧草和卫生害虫的安全防治，受到国内外学者及商业部门的高度重视，并走向商品化生产。在工业化国家的生物农药市场中，此类线虫的市场销售额排生物杀虫剂第二位。目前全球已有超过60个国家的100多个实验室在研究此类有益生物。在我国，昆虫病原线虫也已经商业化生产，并应用于防治多种农林、草地、花卉以及卫生害虫等，结果令人鼓舞。
[0004]昆虫病原线虫与其共生细菌共同作用杀死寄主昆虫，它们之间存在互惠共生的共生关系，这种共生关系对致死昆虫和产业化培养线虫极为重要。具体体现在:存在于线虫肠道内的共生菌需要线虫的携带进入寄主昆虫体内，并释放到昆虫的血腔中；线虫在寄主间传输共生菌，保护共生菌不受土壤环境的影响，并在抵御寄主防御系统时保护共生菌;共生菌在昆虫血腔内繁殖，产生毒素和抑菌物质，使昆虫患败血症并快速死亡;共生菌能分解营养物质，为线虫发育繁殖提供所需的营养成分，同时共生菌产生抗生素，能抑制其他杂菌的污染，为线虫的生长发育繁殖提供良好的环境条件。共生细菌隶属肠杆菌科Enterobacteriaceae，呈杆状，无芽孢，革兰氏反应阴性，均为兼性厌氧菌，硝酸还原酶阴性，发光杆菌属细菌过氧化氢酶反应阳性，嗜线虫杆菌属细菌则为阴性。最佳生长温度多数为28°C，一些细菌可在37?40°C条件下生长。两属细菌在离体培养时具有型态变异现象，分为初生型与次生型，只有初生型细菌能为线虫提供更好的生长、发育、繁殖条件，被感染期线虫所携带。因此在昆虫病原线虫产业化培育过程，有效控制原生杆菌的型变是能否实现大量人工培养昆虫病原线虫的关键。
[0005]昆虫病原线虫的培养经历了从活体培养到离体培养的过程，离体培养又从无菌培养到单菌培养。目前，线虫的商业化生产主要是通过无菌操作技术于人工培养基中加入单一共生细菌和无菌线虫完成的，即体外单菌培养系统。根据培养基质可分为固体培养和液体发酵培养，两者在技术上不尽相同。【
【发明内容】
】
[0006]本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种昆虫病原线虫的培养工艺，能够提高侵染期线虫产量，降低生产成本，发展前景好。
[0007]为实现上述目的，本发明提出了一种昆虫病原线虫的培养工艺，具体步骤包括:
[0008](a)制备共生细菌，准备细菌培养基，准备初生型细菌，根据线虫品系和培养基组分选择最优的菌株；
[0009](b)控制线虫培养参数，要求加入的线虫一级种为仅携带一种合适的共生细菌的单菌状态，经表面消毒怀卵大母虫的卵可有效制备无菌一龄线虫，根据不同线虫的营养需求选择线虫人工培养基，选择适宜的培养容器和培养温度；
[0010](C)接种共生细菌，将培养好的共生菌接入消毒后的海绵培养基中，培养4天后接种线虫；
[0011](d)线虫收获、清洗和储存。
[0012]作为优选，所述(a)步骤中，细菌培养基为:蛋白胨水培养基(I%蛋白胨，0.5 %NaCl)，YS肉汤(I %蛋白胨，0.5%，0.3%牛肉浸膏，pH7.0)，营养肉汤和LB培养基(I %蛋白胨，0.5%恥(:1，0.5%酵母)。
[0013]作为优选，所述(b)步骤中，大量培养的时候需要有大功率无菌水生产设备，并直接连接到水平送风超净工作台，在出水口增加紫外线消毒管，确保水中无杂菌混入，培养容器为高温灭菌消毒的三角瓶和金属盒，防污染还要具有通气的作用，最佳的培养温度依线虫品系不同而不同，范围为19?28°C。
[0014]作为优选，所述(c)步骤中，由于共生细菌的增殖速度较快，初始接菌量对线虫的最后产量没有明显影响，线虫接种量为每培养一亿尾线虫的最佳接种量在20万尾?60万尾，线虫最佳培养周期为24d?28d。
[0015]作为优选，所述(d)步骤中，将培养物浸泡静置分离，线虫沉降到容器底部，让线虫通过筛网，留下海绵等杂质，将筛网连同固体培养物移走，在原液中按10:1加入硅藻土粉，通过压滤机进行固液分离，可快速收获清洁的线虫，线虫的储存采用吸附物质保存法，并将封包好的产品保存于4°C的冷库中。
[0016]本发明的有益效果:本发明采用的昆虫病原线虫固体培养方法解决了活体培养方法无法规模化生产昆虫病原线虫的问题，离体培养技术的发展，是提高线虫产量和规模的基础。固体培养方法通过无菌操作技术，在人工培养基中接种共生细菌和单菌线虫一级种后进行大量培养，能够提高侵染期线虫产量，降低生产成本，并且生产的侵染期线虫具有很好的致病力，对昆虫病原线虫的规模化生产和对地下害虫的生物防治具有非常重要的意义。
[0017]本发明的特征及优点将通过实施例进行详细说明。
【【具体实施方式】】
[0018]本发明一种昆虫病原线虫的培养工艺，具体步骤包括:
[0019]步骤一、制备共生细菌，准备细菌培养基，准备初生型细菌，细菌培养基为:蛋白胨水培养基(1%蛋白胨，0.5%NaCl)，YS肉汤(1%蛋白胨，0.5%，0.3%牛肉浸膏，？!17.0)，营养肉汤和LB培养基(1%蛋白胨，0.5%NaCl，0.5%酵母)。
[0020]共生细菌可以从感染期线虫肠腔中分离得到，也可从被线虫感染的昆虫尸体中分离纯化，所分离的共生细菌能够在常规细菌培养基中生长，为线虫的单菌培养提供了基础，细菌的菌株、菌型以及质量影响着线虫的产量，因此，共生细菌的制备是线虫培养的第一步。
[0021]初生型细菌能支持线虫的最优繁殖，在线虫培养过程中必须控制共生细菌发生型变。斯氏线虫和异小杆线虫与共生细菌具有一定程度的专化性，即线虫一般从自身携带的共生细菌中获得最佳营养，但线虫在不同的菌株中的生长率和产量不同，根据线虫品系和培养基组分选择最优的菌株；
[0022]步骤二、控制线虫培养参数，要求加入的线虫一级种为仅携带一种合适的共生细菌的单菌状态，经表面消毒怀卵大母虫的卵可有效制备无菌一龄线虫，根据不同线虫的营养需求选择线虫人工培养基，选择培养容器为高温灭菌消毒的三角瓶和金属盒，防污染还要具有通气的作用，最佳的培养温度依线虫品系不同而不同，范围为19?28°C;大量培养的时候需要有大功率无菌水生产设备，并直接连接到水平送风超净工作台，在出水口增加紫外线消毒管，确保水中无杂菌混入；
[0023]如果一级种混有其它杂菌，就会造成培养物的严重污染，大幅度降低线虫产量。
[0024]步骤三、接种共生细菌，将培养好的共生菌接入消毒后的海绵培养基中，培养4天后接种线虫；由于共生细菌的增殖速度较快，初始接菌量对线虫的最后产量没有明显影响，
[0025]线虫种群密度与培养基营养状态是影响感染期线虫发育的主要因素，可能包括激素的参与。随着线虫密度的增加其增殖速率减慢。对某一培养基、一定时间内，同一产量范围增殖倍数最大的接虫量将是经济有效的接虫量，应利用最小的接虫量发挥线虫最大的繁殖潜力，即确定线虫最大产量时线虫密度与营养浓度的平衡点。
[0026]线虫接种量为每培养一亿尾线虫的最佳接种量在20万尾?60万尾，线虫体外培养时间与线虫种类、培养基组分、接线虫量及培养温度有关。最佳的培养时间为培养基营养消耗殆尽时感染期线虫产量最大，线虫最佳培养周期为24d?28d。
[0027]步骤四、线虫收获、清洗和储存。
[0028]将培养物浸泡静置分离，线虫沉降到容器底部，让线虫通过筛网，留下海绵等杂质，将筛网连同固体培养物移走，在原液中按10:1加入硅藻土粉，通过压滤机进行固液分离，可快速收获清洁的线虫，线虫的储存采用吸附物质保存法，并将封包好的产品保存于4°C的冷库中。
[0029]当线虫培养到最佳时间后，感染期线虫的产量最高，其他虫态的线虫比例最小。这时应立即收获，否则感染期线虫死亡将导致产量下降。保存的线虫必须尽量去掉培养物中的杂质和其他虫态，否则会影响线虫的保存时间和质量。
[0030]昆虫病原线虫的储存方法很多，不同方法适应于不同的储存环境参数。商业大量储存方法目前我们主要使用吸附物质保存法。
[0031 ]通过冷藏保存，保质期可达6个月。
[0032]本发明离体培养技术的发展，是提高线虫产量和规模的基础。固体培养方法通过无菌操作技术，在人工培养基中接种共生细菌和单菌线虫一级种后进行大量培养，能够提高侵染期线虫产量，降低生产成本，并且生产的侵染期线虫具有很好的致病力，对昆虫病原线虫的规模化生产和对地下害虫的生物防治具有非常重要的意义。
[0033]上述实施例是对本发明的说明，不是对本发明的限定，任何对本发明简单变换后的方案均属于本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种昆虫病原线虫的培养工艺，其特征在于:具体步骤包括: (a)制备共生细菌，准备细菌培养基，准备初生型细菌，根据线虫品系和培养基组分选择最优的菌株； (b)控制线虫培养参数，要求加入的线虫一级种为仅携带一种合适的共生细菌的单菌状态，经表面消毒怀卵大母虫的卵可有效制备无菌一龄线虫，根据不同线虫的营养需求选择线虫人工培养基，选择适宜的培养容器和培养温度； (C)接种共生细菌，将培养好的共生菌接入消毒后的海绵培养基中，培养4天后接种线虫； (d)线虫收获、清洗和储存。2.如权利要求1所述一种昆虫病原线虫的培养工艺，其特征在于:所述(a)步骤中，细菌培养基为:蛋白胨水培养基(1%蛋白胨，0.5%NaCl)，YS肉汤(1%蛋白胨，0.5%，0.3%牛肉浸膏，PH7.0)，营养肉汤和LB培养基(1%蛋白胨，0.5%NaCl，0.5%酵母)。3.如权利要求1所述一种昆虫病原线虫的培养工艺，其特征在于:所述(b)步骤中，大量培养的时候需要有大功率无菌水生产设备，并直接连接到水平送风超净工作台，在出水口增加紫外线消毒管，确保水中无杂菌混入，培养容器为高温灭菌消毒的三角瓶和金属盒，防污染还要具有通气的作用，最佳的培养温度依线虫品系不同而不同，范围为19?28°C。4.如权利要求1所述一种昆虫病原线虫的培养工艺，其特征在于:所述(c)步骤中，由于共生细菌的增殖速度较快，初始接菌量对线虫的最后产量没有明显影响，线虫接种量为每培养一亿尾线虫的最佳接种量在20万尾?60万尾，线虫最佳培养周期为24d?28d。5.如权利要求1所述一种昆虫病原线虫的培养工艺，其特征在于:所述(d)步骤中，将培养物浸泡静置分离，线虫沉降到容器底部，让线虫通过筛网，留下海绵等杂质，将筛网连同固体培养物移走，在原液中按10:1加入硅藻土粉，通过压滤机进行固液分离，可快速收获清洁的线虫，线虫的储存采用吸附物质保存法，并将封包好的产品保存于4°C的冷库中。
【文档编号】C12R1/01GK106035250SQ201610692071
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月18日
【发明人】盛锡良, 张斌, 夏博, 李飞
【申请人】浙江绿神天敌生物技术有限公司