一种可作为胚胎疫苗的重组新城疫病毒的制作方法

专利名称：：一种可作为胚胎疫苗的重组新城疫病毒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种低水平表达其V蛋白的新城疫病毒(NDV)突变体，一种包含该NDV突变体的疫苗和该NDV突变体用于制备保护禽类抗ND的疫苗的用途。新城疫是家禽的一种毁灭性疾病，给养禽业带来相当大的经济损失。NDV是该病的病原体物质，它属于副粘病毒科。新城疫很复杂，因为该病毒的不同分离物和菌株可能导致疾病严重程度有相当大的差异。通常，鸡越年幼，病症就越急性和严重。感染的发生可以通过吸入或摄入病毒。传染性形式的病毒可从一只禽散布到另一只。为了减少由ND导致的养禽业的经济损失，全世界都常规地给鸡(尤其是为商业消费而养殖的鸡)接种疫苗。普遍使用的活(轻毒型)NDV疫苗株的例子是V4、HitchnerB1、F和LaSota株。但是，这些疫苗株仍会导致轻到中度的接种反应，尤其是在幼禽的初次接种时引起呼吸道内的接种反应。已开发了在对幼禽进行给药时不会引起(呼吸性)接种反应的温和NDV疫苗株美国专利5250298(UniversityofDelaware)公开了一种活的、适应寒冷的HitchnerB1温度敏感性突变株，命名为CaTs。美国专利5149530(DupharInt．Res．B．V．)描述了一个命名为NDW的NDV株，它是衍生自Ulster2C株的一个突变体。美国专利5750111(AkzoNobelN．V．)公开了一个命名为C2株的温和疫苗株，它对一日龄的鸡不会诱发不利反应。目前市售的NDV疫苗只能通过饮水、气雾剂、滴眼剂或非肠道途径给药。这些用药方法有一些不利之处，最重要的是由于用药所需进行的工作造成的高成本。近来，已证明将疫苗，比如火鸡疱疹病毒以及感染性粘液病病毒疫苗作为胚胎疫苗(Sharma和Burmester，禽类疾病26134-149，1982以及Sharma，禽类疾病291155-1169，1985)使用是有效和经济的。另外，还发现胚胎接种较为有利，因为禽类早期即对该具体疾病有抗性，而且利用带有多个注射头的半自动机械可以给每个卵投放统一剂量的疫苗。应当指出的是，许多常规用于给禽类孵化后接种的疫苗不能用于卵内接种。后期胚胎对检验的多数疫苗病毒的感染都是高度易感的，所述疫苗病毒包括那些能安全地用于一日龄孵出小鸡的疫苗病毒。因此，必须将常规疫苗修饰以用于卵内接种。目前，没有合适的商品ND疫苗能用于卵内接种，主要是由于有高胚胎致死率，甚至两株最温和的商品NDV疫苗株NDW和C2也是如此。美国专利5427791(RegentsoftheuniversityofMinnesota)公开了利用化学诱变试剂产生HitchnerB1株的NDV突变体，它对晚期胚胎没有致病性。用甲基磺酸乙酯(EMS)对B1株进行化学处理产生了突变病毒NDV-B1-EMS，其可以安全地投药给胚胎期第18天的卵。但是，这一诱变过程导致以不受控制的、非再现性方式向病毒基因组中导入了随机突变。这些随机突变可能会影响除与卵内安全性相关联的特性之外的病毒特性，比如与免疫原性有关的病毒特性。而且，不利的是，该病毒株的每一卵传代步骤都要在有诱变试剂EMS的情况下进行，因为突变体会回复为对胚胎不安全的亲本B1株。近来，借助于称为“反向遗传学”(综述见Conzelmann，普通病毒学杂志77381-389，1996；Conzelmann，遗传学年度评论32123-162，1998和Palese等，美国科学院学报9311354-11358，1996)的方法的发展，有可能对非分段型负链RNA病毒进行基因修饰。已建立的能可控地对负链RNA病毒进行基因操纵的反向遗传学系统有用于开发新疫苗株的潜力。NDV是副粘病毒科家族的成员，其负链RNA病毒基因组含有6个编码6个主要结构蛋白质(3’NP-P-M-F-HN-L5’)的基因。但是副粘病毒的一个普遍特性是存在由其P基因的其它读码框和RNA编辑(综述见Kolakofsky等，病毒学杂志72891-899，1998)导致的另外的结构或非结构病毒蛋白。发现NDV与其他副粘病毒一样，也能通过在编辑位点(UUUUUCCC)插入1或两个G残基来编辑P基因。这三种mRNA编码P蛋白(未编辑的)、VORF(有+1移码)和WORF(有+2移码)(Steward等，普通病毒学杂志742539-2547，1993)。由于利用编辑位点下游的不同读码框，P、V和W特异mRNA的翻译导致表达3种有相同氨基末端，但羧基端不同的蛋白质。Peeters等(病毒学杂志735001-5009，1999)和Romer-Oberdorfer等(普通病毒学杂志802987-2995，1999)描述了通过反向遗传学体系完全由克隆的cDNA制备感染性NDV。在Peeters等(1999)文中显示通过修饰F0蛋白的切割位点处的氨基酸序列，可以使NDV疫苗株的毒性急剧增强。该文还提示，消除NDV中V蛋白的表达可能导致其在禽类中表现减毒表型(Peeters等，1999，同前)。本发明的一个主题是鉴定能用于制备使禽类抗ND的疫苗的NDV突变体，所述疫苗不仅可给予孵化后的幼禽，还可安全地卵内给药。本文中鉴定到一个新NDV突变体，它不仅对幼龄已孵化鸡显示出类似于商品化的温和性NDW和C2疫苗株的温和、弱毒性质，而且与NDW和C2疫苗株相反，它能安全地用于胚胎接种。本发明提供了一种V蛋白表达水平降低的NDV突变体(NDVV-)，其特征在于该突变体是V蛋白表型阳性，并且感染细胞中≤6％的来源于P基因的mRNA编码VORF。已发现如上限定的NDV突变体导致的胚胎致死率显著减少，即使是在胚胎期第11天给药也如此。这与该突变体所来源的轻毒型疫苗株亲本截然不同。该疫苗株能将全部胚胎在孵化前杀死。另外，还发现NDVV-突变体不影响卵的孵化率，尤其是商业性的含胚鸡蛋，从胚胎接种的蛋孵化出的鸡能抗强毒型NDV的侵袭。NDVV-突变体的这些出乎意料的组合特性使该突变体尤其适用于制备卵内给药的疫苗。令人惊讶的是，我们已发现通过反向遗传学技术制备的不能表达V蛋白的NDV突变体在由转染上清液传代到含胚鸡蛋后不能存活。将NDV突变体的V蛋白表达彻底消除不会产生感染性的病毒颗粒，因此应当避免。因此，本发明的NDV突变体是表型阳性的，但免疫检测显示在感染细胞中产生的V蛋白的水平与感染了亲本NDV的细胞相比降低了。可以经免疫荧光检测(IFT)或免疫印迹，利用抗V蛋白羧基端的特异V蛋白抗血清确定感染宿主细胞中是否存在V蛋白表达(表型)及其相对水平。本发明的NDVV-突变体明显地显示出缺陷的P基因mRNA编辑。感染了亲本NDV的细胞中来源于P基因的编码VORF(和WORF)的mRNA通常存在频率为大约30％(和2％)，与之相比，本发明的NDVV-突变体编辑其P基因的频率只有≤6％。可以按照实施例1的描述确定来源于P基因的mRNA群的相对出现情况。就这方面来说，用于确定P基因mRNA编辑频率的克隆的数量应至少为100，优选在100到500之间。对于一个V蛋白表型阳性的NDVV-突变体，其VORF编辑大于0％。优选地，V蛋白表型阳性的NDVV-突变体是感染细胞中≤3％，更优选≤1％的来源于P基因的mRNA编码VORF的突变体。或者，可利用其VORF编辑频率来定义本发明的NDVV-本发明的NDVV-突变体显示出的VORF编辑频率(editingfrequency，e．f．)百分比为0＜e．f．≤6，优选为0＜e．f．≤3，更优选为0＜e．f．≤1。可以根据通常用于制备常规活ND疫苗的标准方法，用NDVV-突变体制备用于卵内给药的ND疫苗。简而言之，用NDVV-突变体接种易感材料并进行增殖，直至病毒复制到预期的滴度，之后收集含有NDV的材料。随后，将收集到的材料配制成具有免疫特性的药物制剂。任何能支持ND病毒复制的材料都可用于本发明，包括原代(禽类)细胞培养物，比如鸡胚成纤维细胞(CEE)或鸡肾细胞(CK)，或者哺乳动物细胞系，比如VERO细胞系或者幼仓鼠肾(BHK)细胞系。尤其适合NDVV-突变体在其上增殖的材料是SPF含胚卵。可以用例如0．2ml含有NDV的尿囊液(至少包含102．0EID50)接种每个含胚卵。优选地，用大约105．0EID50接种9-12天龄的含胚卵，然后于37℃保温2-4天。2-4天后可以收获ND病毒产物，优选通过收集尿囊液进行。于2500g将液体离心10分钟，然后经滤膜(100μm)过滤上清液。要用于卵内给药的疫苗包含活ND病毒突变体和药学可接受的载体或惯用于这类组合物的稀释液。疫苗可以以悬液或冻干形式制备和销售。载体包括稳定剂、防腐剂和缓冲液。合适的稳定剂是，例如SPGA、糖类(比如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、右旋糖、谷氨酸或葡萄糖)、蛋白质(比如干乳清、清蛋白或酪蛋白)或者其降解产物。合适的缓冲液是例如碱性金属磷酸盐。合适的防腐剂是硫柳汞、乙汞硫代水杨酸钠和庆大霉素。稀释液包括水、含水缓冲液(比如缓冲盐水)和多羟基化合物(比如甘油)。可以依照常规的卵内接种方法将包含NDVV-突变体的疫苗注入含胚卵中。通常在胚胎期的后期，一般在孵化期的后四分之一(第15-21天)，优选在孵化期的第18天将疫苗注入含胚卵。孵化卵的注射方式不是特别关键，只要不会过度损伤胚胎的组织和器官即可。例如，用接在注射器上的针(1-1．5寸，大约22号)在蛋壳的大头刺一个小孔，并将疫苗注入内壳膜和尿囊绒膜以下。随后，将接种的含胚卵转移到孵化器中孵化(美国专利4458630、5427791、WO9856413和WO9535121)。优选地，整个胚胎接种过程用自动接种系统进行，比如市售的Inovoject_。可以依照成熟的反向遗传学方法来制备用于制备卵内给药的ND疫苗的NDVV-突变体，所述方法已用于对许多非分段型负链RNA病毒(综述见上)进行基因修饰。另外，Peeters等(1999，同前)和Romer-Oberdorfer等(1999，同前)已公开了用于NDV的这种方法。通常，首先，(由重叠的cDNA片段)组装出NDV基因组的全长cDNA克隆并克隆到转录质粒中(T7)RNA聚合酶启动子和自催化的δ肝炎病毒核酶之间。将该质粒转染到表达(T7)RNA聚合酶的细胞中，导致合成反基因组NDVRNA。由共转染的质粒同时表达出为病毒复制和转录所需的病毒蛋白质(NP、P和L蛋白)使得可从克隆的cDNA产生感染性病毒。所有NDV基因的核苷酸序列都是已知的。Ishida等(NAR146551-6564，1986)、McGinnes等(病毒学164256-264，1988)、Daskalakis等(NAR20616，1992)和Steward等(普通病毒学杂志742539-2547，1993)已描述了P基因的核苷酸序列。完整NDV基因组的核苷酸序列也有几个研究小组(deLeeuw等，普通病毒学杂志80131-136，1999，GenBank编号AF077761；Krishnamurthy等，普通病毒学杂志792419-2424，1998；Phillips等，病毒学文集1431993-2002，1998，EMBL编号AJ225127、AJ225128和AJ225129；以及Romer-Oberdorfer等，普通病毒学杂志802987-2995，1999，EMBL编号Y18898)报道过。完整NDV基因组的长度，包括3’-和5’-末端是15186个核苷酸。P基因位于NDV基因组中1804-3254位核苷酸处(NDV株Clone30_编号方式按照Romer-Oberdorfer等使用的，EMBL编号Y18898；文中使用该编号方式以便说明NDV基因组上的位点)。编码P蛋白的开放读码框位于1887-3074位核苷酸。要被突变从而产生NDVV-突变体的P基因mRNA编辑位点UUUUUCCC(基因组RNA-有义链)位于2280-2287位核苷酸。编码P、V和W蛋白的ORF端点分别在3074(TAA)、2605(TAA)和2424(TGA)位。P蛋白长395个氨基酸，并且P蛋白的氨基端部分(与V蛋白和W蛋白的氨基端相同)从1位延伸到135位氨基酸。P和V蛋白的羧基端部分，即P和V蛋白没有序列同源性的片段，分别为136位到395位氨基酸，和136-239位氨基酸。由于转录期间编辑位点末端有(+1)移框，故P和V蛋白羧基端部分没有显示出任何相似性。优选地，本发明提供了一种NDVV-突变体，其中由于编辑位点UUUUUCCC中的一个突变使其V蛋白表达水平降低。对该高度特异序列的破坏导致转录过程中在编辑位点处非模板性G残基插入频率下降，从而使V(和W)蛋白表达降低。突变应理解为能表达V蛋白的亲本NDV株P基因编辑位点处遗传信息的变化。所述突变，具体来说，是一个核酸取代。具体来说，在编辑位点的密码子之一中导入一个产生沉默突变的核酸取代，即密码子改变而由密码子编码的氨基酸不变的突变。这样的突变保证P基因的ORF仍表达功能性P蛋白。在保守编辑位点的沉默突变的实例包括在第3位(UUCUUCCC)或第6位(UUUUUUCC)有突变，或结合有这两种突变，它们均在本发明的范围内。如实施例1所示，3个或更多个核苷酸的取代和核苷酸的缺失会形成不能表达V蛋白的NDV突变体，并且不能从转染上清液中回收。因此，本发明的NDV突变体中编辑位点处的取代包含1或2个核苷酸。另外，实施例1中证实，在编辑位点中1-5位处导入的涉及1或2个核苷酸的突变形成能从转染上清液中回收的突变体，该突变体表达V蛋白水平比亲本病毒低大约20倍。并且，所有突变体对鸡胚的致病性显著减弱。鉴于这些发现，以上描述的在编辑位点1-5位，优选3或4位有1或2个突变的NDV突变体是尤其受到考虑的。本发明的NDVV-突变体的一个非常有利的例子在编辑位点第3位具有一个突变，其在编辑位点处包含核苷酸序列UUCUUCCC。尽管该突变体编辑位点的第一个密码子被改变，但由该密码子编码的氨基酸维持原样(赖氨酸残基)。其中VORFmRNA的降低(至≤6％)以及WORFmRNA的降低(至不可测水平)表明这个NDVV-突变体中P基因mRNA编辑剧减。也可以通过编辑位点中其他单核苷酸取代来获得显示类似的VORF编辑降低的NDVV-突变体。在这种NDVV-突变体中，编辑位点的U残基被C、G或A残基取代，优选被C残基取代，或者编辑位点的C被U、G或A残基取代，优选被U残基取代。这类NDVV-突变体的有利实例是编辑位点包含核苷酸序列UCUUUCCC、UUUGUCCC和UUUUCCCC的NDV突变体。本发明的在编辑位点有2个突变的NDV突变体的典型例子包含核苷酸序列GCUUUCCC。可以利用本领域公知的用于该目的的方法将所需突变导入NDV基因组。具体来说，可通过定点诱变导入突变。文中描述了一个这样的方法，但该方法也是本领域中普遍使用的(Peeters等，1999，同前；现代分子生物学指南，编者F．M．Ausubel等，WileyN．Y．，1995版，8．5．1-8．5．9以及Kunkel等，酶学方法154376-382，1987)。本发明中一个特别优选使用的NDVV-突变体是一个如前所述包含另外的减毒突变的NDV突变体。这类NDV突变体可以衍生自任何ND疫苗株。市售的ND疫苗中合适的这种NDV疫苗株有Clone-30_、LaSota、HitchnerB1、NDW、C2和AV4，Clone-30_是优选的疫苗株。另一方面，本发明提供了一种抗禽类ND、适合卵内给药的活疫苗，其特征在于该疫苗包含一个如上所述的NDVV-突变体，以及一种药学可接受的载体。通常，这样的疫苗包含每个卵100μl或更低的剂量，优选50μl的剂量。以这样小的剂量体积将疫苗卵内给药能提高接种胚胎的孵化率。在本发明的另一个实施方案中，提供了一种活性组合疫苗，该疫苗中除了有上述NDVV-突变体之外，还包含另一种禽类病原体的对胚胎安全的疫苗株。将多个疫苗株联合给药从经济因素上是有利的，因为卵中需要的疫苗接种量更少。另外，插入卵中的针越少，卵被污染的危险性越小。对胚胎安全的疫苗株意指这样一个活疫苗株，当接种到胚胎期第18天的SPF卵中时，其导致卵的孵化率至少为70％，优选至少90％。具体来说，组合疫苗另外包含1或多个针对下述病毒的对胚胎安全的疫苗株马立克氏病病毒(MDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(infectiousbursaldiseasevirus，IBDV)、禽腺病毒(FAV)、火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)或呼肠病毒。这类对胚胎安全的疫苗株的例子是MDV疫苗Ovovac_-HVT和Ovovac_-SB1，IBDV疫苗Bursamune_和Bursaplex_。很显然，由于文中显示的NDVV-突变体有利的减毒特性，本发明的活疫苗也可以以类似于常规用于防止商业禽群中ND的活ND疫苗的方式在禽类孵化后给药。本发明再一个实施方案中提供了一种载体疫苗，其可用于制备不仅可抗特定NDV感染，还可以抗其他禽类传染性疾病的疫苗。例如，基于以上描述的NDVV-突变体的载体疫苗使得可能通过在被免疫宿主的感染细胞中表达其它禽类病原体的抗原来激发对这些禽类病原体的免疫力。可以通过将一个编码异源多肽的异源核苷酸序列插入所述NDVV-突变体的非翻译区来获得这种NDV载体。适用于该目的的非翻译区位于基因组启动子和NP基因起始处之间，以及NP／P、P／M、M／F、F／HN和HN／L基因连接处。异源核酸序列可以编码禽类病原体，比如传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、马立克氏病病毒、禽脑脊髓炎病毒、禽呼肠病毒、禽流感病毒、鸡贫血病毒、沙门氏菌、大肠杆菌和艾米虫的抗原。以上描述的NDVV-突变体还使得可能制备一种具有有利特性、可用于孵化后给药的灭活疫苗。这种灭活疫苗的一个重要优点是NDVV-突变体在含胚卵或细胞培养物中增殖时可产生高的抗原性生物质，从而可获得高水平、持续时间长的保护性抗体。将增殖步骤之后收获的ND病毒灭活的目的在于消除病毒的复制。通常，这可以通过化学或物理手段实现。实施化学灭活可以通过用例如，酶、甲醛、β-丙醇酸内酯、吖丙啶或其衍生物处理病毒完成。如果有必要，可以在此后将灭活化合物中和。用甲醛灭活的材料可以，例如，用硫代硫酸盐或偏亚硫酸氢钠中和。物理灭活优选通过用高能辐射，比如UV光、X-射线或γ射线处理病毒来进行。如果需要，可以在处理后将pH调回至大约7。含有灭活ND病毒的疫苗可以例如包含1或多种以上提到的用于这类目的的药学可接受载体或稀释液。优选地，本发明的灭活疫苗包含1或多种有佐剂活性的化合物。适用于该目的的化合物或组合物包括氢氧化铝、磷酸铝或氧化铝、基于矿物油(比如BayolF_或Marcol_52)或植物油(比如维生素E醋酸盐)的水包油或油包水乳剂，以及皂苷。本发明的疫苗包含有效量的作为活性成分的NDVV-突变体，即能在接种禽类中诱发对毒性ND病毒侵染的免疫力的免疫性NDV材料的量。文中将免疫力定义为与未接种组相比，接种后在禽类群体中诱导显著高水平的预防作用。通常，本发明的活疫苗可以每卵或每只禽103．0-108．0胚胎感染量50(EID50)的剂量给药，优选剂量范围为104．0-107．0EID50，尤其是105．0-107．0EID50。灭活疫苗可以每只动物含有104．0-109．0EID50抗原等价物，优选每只动物为106．0-108．0EID50。灭活疫苗可经非肠道给药，例如肌内或皮下给药。本发明的疫苗能有效地用于鸡，但也能用该疫苗成功地接种其他禽类，比如火鸡、珍珠鸡和鹌鹑。已有描述将NDV作为人的治疗剂，尤其是用于治疗人类癌症(Lorence等，国立癌症研究院杂志801305-1312，1988；Murray等，癌症52856-862，1983；Reichard等，外科研究杂志52448-453，1992)。由于NDV在人体中能导致结膜炎，治疗上需要一种高度减毒的NDV株。因此，鉴于以上描述的NDVV-突变体的有利特性，NDV突变体(如果需要的话，还可以包含编码治疗性或预防性蛋白质的外源基因)可能用作人的治疗剂，例如用于控制人或动物的癌症和AIDS。实施例1制备NDVV-突变体材料与方法全长克隆的cDNA合成和装配。Romer-Oberdorfer等描述了这些实验的细节(1999，同前)。从50ml尿囊液中纯化NDV株Clone-30_(IntervetInternationalB．V．，TheNetherlands)，滴度为每ml1010胚胎感染剂量(EID50)。通过异硫氰酸胍提取和随后经CsCl梯度离心来分离病毒RNA。利用SuperScriptTMIIRnaseHReverseTranscriptase(Gibco)制备基因组RNA的cDNA。使用ExpandHighFidelity(HF)PCR系统(BoehringerMannheim，Germany)对1μl第一链cDNA作PCR。按照Mundt和Mueller(病毒学209209-219，1995)的描述确定基因组RNA的末端序列。然后推断出PCR的特异寡核苷酸以便扩增前导序列和尾部。这些片段的PCR产物含有通过5个核苷酸(76、79、15039、15041和15042位核苷酸)的突变而人工制造的MluI位点(第76位核苷酸在NP非编码区，第15039位核苷酸在L非编码区)。为了构建完整的NDV反基因组表达质粒，将以上PCR片段经多个步骤克隆到质粒X8dT(Schnell等，EMBO杂志134195-4203，1994)中T7RNA聚合酶启动子和自身催化性δ肝炎病毒核酶序列之间的SmaI位点。所得全长克隆命名为pflNDV。构建表达质粒。为了构建NP、P和L表达质粒，将NP(122到1791位核苷酸)、P(1887到3254位核苷酸)和L(8381到15051位核苷酸)的开放读码框克隆至pCite2a(Novagen)中。为此，制备在NcoI或AflIII接头中携有各自翻译起始密码子的HF-PCR片段。将这些片段以正确开放读码框转入pCite2a载体中(Romer-Oberdorfer等，1999，同前)。向全长NDVcDNA中导入突变。为了向新城疫病毒(NDV)基因组中导入减毒突变，将表达轻毒型Clone-30NDV疫苗株之全长反基因组RNA的质粒pflNDV作为基础。由于NDV是通过插入非模板的G残基来编辑其P基因mRNA的，故我们通过导入1、2、3或6个核苷酸取代或缺失，或者6或12个核苷酸(图1所示)来修饰编辑位点(UUUUUCCC)。用表1列出的各个引物以pflNDV为模板进行PCR。然后用AatII／ApaI消化PCR产物，并克隆到pflNDV的相同位点。为了选择性地阻断V蛋白独特的羧基端部分的表达，在不影响P读码框的情况下向反式V读码框中导入一个终止密码子。作PCR，用ApaI和RsrII消化产物并连接到pflNDV中的相同位点。将各克隆中新导入的区域测序以便排除PCR引入的错误。所得在编辑位点带有核苷酸取代或缺失，或者在VORF中插入了终止密码子的全长克隆的命名见图1。表1用于向全长cDNA克隆pflNDV中导入突变的引物。粗体显示核苷酸变化。核苷酸序列和核苷酸位点与Romer-Oberdorfer等(普通病毒学802987-2995，1999；EMBL编号Y18898)的一致。制备重组病毒。使大约1．5×106个能稳定表达T7噬菌体RNA聚合酶的BSRT7／5细胞(Buchholz等，病毒学杂志73251-259，1999)过夜生长至90％铺满。用含有5μgpCite-NP、2．5μgpCite-P、2．5μgpCite-L和10μg全长克隆之一的质粒混合物，利用哺乳动物转染试剂盒(CaPO4transfectionprotocol，Stratagene)来转染细胞。转染后3到5天，收获上清液并注射到9-11天的胚胎期鸡卵的尿囊腔中(每卵200μl)。培养3到4天后，通过血细胞凝集(HA)实验来确定尿囊液中是否存在病毒。在含胚卵中传代2-6次制备病毒原液。RT-PCR。感染36小时后用Rneasy试剂盒(Qiagen)从被感染的BSRT7／5细胞中制备总RNA。用1μg总RNA以NDVP基因特异性寡核苷酸P#13(5’-CCACCCAGGCCACAGACGAAG-3’，2676-2196位核苷酸)为引物，在禽类成髓细胞血症病毒逆转录酶作用下进行反转录。用引物P#13和P#17(5’-ATGAATTCAGCTGTTGGA-3’，2680-2696位核苷酸)做DNA扩增。在1％琼脂糖凝胶上分析PCR产物，直接用于测序。病毒在含胚SPF卵中的系列传代。将重组NDVV-病毒在9-11天的胚胎期SPF卵中连续传代2到9次。接种的卵于37℃保温2-5天。对来自各被感染卵的尿囊液首先做标准HA检测，只收集HA阳性的尿囊液并用于随后的传代。在9-11天的胚胎期SPF卵中测定每次传代的病毒原液的滴度。生产抗V肽的抗体。为了在被感染细胞中检测V蛋白的表达，需要有特异识别V蛋白羧基端的血清，这是因为P、V和W蛋白氨基端相同。为此，我们在V蛋白的独特羧基端中选择了一个可能的抗原序列并合成了包含V蛋白16个羧基端氨基酸(224-239位氨基酸)的肽。将5mg该肽与载体蛋白质-匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联。用偶联KLH的肽免疫两只兔，2和4周后强化两次。在第一次注射前(免疫前)以及2和3个月后收集血样。免疫印迹。为了纯化病毒，将9-11天的胚胎期SPF鸡蛋感染，感染后3-4天收集尿囊液。然后通过在BeckmanSW28转头中，20％蔗糖梯度中于21000rpm离心90分钟来纯化和浓缩尿囊液中的病毒。将沉淀重悬，并与蛋白质样品缓冲液混合以便使毒粒破裂。然后经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化过的毒粒中的病毒蛋白，将其转移至PVDF膜(Millipore)，并与特异于NDVClone-30株的V蛋白之羧基端16个氨基酸的抗V肽血清，或者NDVNP蛋白的特异性单克隆抗体(MAb)一起保温。然后将膜与偶联过氧化物酶的山羊抗兔或抗小鼠免疫球蛋白G一起保温。与过氧化物酶底物(Vector)保温后使蛋白质显色。V蛋白表达的免疫荧光分析。为了分析病毒蛋白表达，用不同传代水平的NDVV-或亲本病毒以大约为10的感染复数(moi)感染BSR-T7细胞，并保温1-2天。将被感染细胞用冷乙醇(96％)于室温固定1小时。细胞用PBS洗3次后，与抗V肽兔血清(第一次免疫3个月后收集的血清)于37℃保温1小时。平行地将被感染细胞和与NDVF或NP蛋白有反应的Mab或者识别各种NDV蛋白质的多克隆鸡血清一起保温。洗涤细胞，用偶联FITC的抗兔、抗鸡或抗鼠抗体染色并用荧光显微镜检查。确定P基因mRNA编辑频率。分离自感染了F1NDV和各代NDVV-突变体P1的细胞的总RNA以oligo(dT)为引物仅使mRNA反转录扩增。然后用引物P#17(NDVV-EcoRI26805’-ATGAATTCAGCTGTTGGA-3’)和P#13(NDVP+21765’-CCACCCAGGCCACAGACGAAG-3’)做PCR。用EcoRV和SalI消化PCR片段，并连接到pSKT7T载体中的相同位点。对来自独立菌落的克隆质粒测序，并检查编辑位点处是否存在非模板性G残基插入(表2)。结果从cDNA克隆中回收P基因mRNA编辑缺陷型NDV为了破坏保守性P基因mRNA编辑或者选择性地阻断V蛋白独特羧基端部分的表达，在NDVClone-30株的全长cDNA克隆(pflNDV)上进行修饰，见图1。每个修饰过的全长cDNA克隆与表达NDVNP、P和L蛋白的三种支持质粒一起转染到BSR-T7／5细胞中。对未修饰的全长cDNA、pflNDV也进行转染实验以便比较治愈效果。保温3-5天后，收获上清液并用抗FMab对已转染细胞做免疫荧光(IF)染色。在包括pflNDV或修饰过的全长克隆的所有转染实验中检测到至少20-50个IF阳性细胞，这表明在细胞培养物中有基因组复制和病毒蛋白的表达。然后用转染上清液接种胚胎期的SPF鸡卵，后者是久已为人所知的增殖轻毒型NDV的最好底物(Nagai等，病毒学72494-508，1976)。保温3-4天后，收获尿囊液样品，进行HA检测。在某些用来自转染了pflNDV的细胞的上清液接种的卵中检测到HA。但是，要用HA实验检测到那些在编辑位点含有1或2个核苷酸取代的修饰病毒(NDV-P1、NDV-PG2、NDV-PC4、NDV-PG5和NDV-PCG12)，就需要再用鸡卵传代1到2次。令人惊讶的是，用得自缺失突变体(NDV-Δ6和NDV-Δ12)、具有3个或更多个核苷酸取代的突变体(NDV-PA、NDV-PD、NDV-PR、NDV-PRR)或者缺乏V蛋白的独特羧基端部分的突变体(NDV-Vstop)的转染上清液接种的胚胎期卵，在它们的尿囊液中没有检测到传染性病毒。尽管进行了3次重复拯救实验，每次实验中连续传代4次，我们在胚胎期卵的尿囊液中仍未能检测到传染性病毒。然后将那些可能被拯救的突变体在9-11天的胚胎期卵中连续传代2到6次。V蛋白的表达。为了确定是否存在V蛋白的表达，用各种突变体(NDV-P1、NDV-PG2、NDV-C4、NDV-PG5和NDV-PCG12)或者亲本病毒感染BSR-T7细胞，进行免疫荧光分析或者分离RNA。使用与NDVF或NP有反应的小鸡抗NDV血清或Mab，无法区分开感染了上述突变体之一或亲本病毒的细胞的荧光水平和样式。相反，抗V肽血清只与感染了F1NDV的细胞发生高荧光强度的反应。类似浓度的血清显示一个特异的但非常弱的荧光信号，该信号在突变体和较高代(5-9代)的NDVP1之间是有可比性的，表明在所有被检突变体中有类似的低水平V表达。这表明，尽管在突变体病毒中编辑位点的U延伸片段被打断，其中RNA编辑以及随后的V蛋白表达并没有完全消除，包括先前在39个被检mRNA克隆中均未显示VORFmRNA的第6代P1。因此选择突变体NDVP1作进一步分析。V蛋白是NDV的一个结构成分，因此我们有兴趣确定是否感染细胞中低水平的V表达会导致V低水平地进入毒粒。因此，对经20％蔗糖纯化和浓缩的NDVP1进行免疫印迹实验。使用NP特异性Mab(其与两种病毒的NP蛋白反应敏感度相同)就可能使加样到凝胶中的蛋白质的量标准化(图2)。尽管用了相当量的亲本病毒和NDVV-突变体P1蛋白进行Western印迹分析，但NDVV-突变体的V蛋白比亲本病毒少很多，这证明进入NDVV-毒粒的V蛋白水平低。Western印迹分析稀释过的样品，显示NDVV-毒粒的V蛋白含量比亲本病毒低大约20倍。然后由来源于第5到9代质粒的总共319个独立菌落确定出NDVV-P基因mRNA编辑位点周围的序列(表2)。为了进行比较，对F1NDV测定了共41个独立菌落的序列，41个被测序质粒中的28个(68．3％)编码未编辑形式的P蛋白。编码有1个非模板性G残基插入的V蛋白的质粒在41个中有12个(29．3％)。41个中只有一个质粒具有两个非模板性G残基插入(表2)。相反，在NDVV-突变体P1的共319个被测序的独立菌落中，只有4个质粒含有一个导致V-ORF的非模板性G残基插入。第6、8和9代的V编码质粒有一个G插入，而第7代的质粒具有4个G残基的插入，它也会导致表达V蛋白。总之，这些结果显示在RNA编辑位点处的取代不能完全阻断P基因mRNA编辑，但会显著地降低RNA编辑频率。与亲本病毒相比，NDVV-病毒编辑其P基因mRM的频率低10-20倍，因此以相应的低水平合成V蛋白。表2确定NDVV-突变体P1的P基因mRNA编辑频率实施例2用NDVV-突变体进行的体内实验接种SPF鸡胚材料与方法在含胚卵中测定病毒滴度。将重组病毒做10倍系列稀释，用系列稀释液接种两组11天的含胚卵。保温4天后，对一组接种过的卵进行HA实验，用Reed和Muench(美国卫生学杂志27493-497，1938)的方法计算滴度，表示为50％胚胎感染剂量(EID50)。另一组接种过的卵每天观察胚胎死亡率，并用同样的方法确定50％胚胎致死剂量(ELD50)。卵内接种和侵染。18天的SPF鸡受精卵经一个在鸡卵平头的穿孔进行接种。用一个23G针头，将O．1ml病毒稀释液或者阴性尿囊液注射到气膜(airmembrane)下。记录孵化率，每天观察所有鸡的健康状况。在14天龄时，将所有鸡称重并放血。在标准NDV血细胞凝集抑制实验中检查血清样品中是否存在NDV的抗体。在14天龄(大约接种后17天)时，用毒性NDVHerts株肌侵染全部动物。在10天内每天观察鸡的疾病临床症状发生率或死亡率。结果NDVV-的病原性。NDV分离物对含胚卵和鸡的毒力各不相同。可以通过体内评估病毒的病原性来测量给定NDV分离物的毒力程度。一个这样的方法包括计算用最小致死剂量的病毒感染的10-12天龄的鸡胚的平均死亡时间(meandeathtime，MDT)。某些已鉴定的NDV株，MDT在48小时(对于强毒株和中等毒力株)到160小时(对于轻毒株，即多数疫苗株)。为了确定NDVV-突变体的平均胚胎致死剂量，用10倍系列病毒稀释液接种11天龄含胚卵，并保温7天。令人惊讶的是，对用NDVP1和NDVPC4(表3)接种的组进行观察时没有检测到特异胚胎死亡率，这表明即使在11天时接种，且剂量较高，这些NDVV-突变体对鸡胚也是安全的(表3)。就我们所知，这是首例不会引起胚胎死亡的NDV株。类似的条件下，包括PG2、PG5和PCG12的第2组突变体导致低水平的胚胎死亡率，但对鸡胚的病原性仍显著地弱化了。这些突变体的EID50和ELD50之间的差别至少为4．8log10，而对亲本病毒是0．3log10，表明它们比亲本病毒减速毒了至少30000倍(表4)。表3将NDVP1或NDVPC4接种到11天的胚胎期SPF鸡卵后，保温7天期间确定的胚胎死亡率表4各NDV突变体在EID50和ELD50之间的差别NDVV-卵内给药时的NDVV-孵化率。目前没有活的ND疫苗能卵内给药，这主要是因为即使是高度减毒的NDV株也存在高胚胎死亡率和非常低的孵化率。由于发现了NDVV-突变体P1和PC4在胚胎期第11天给药时，对胚胎无病原性，因此用NOVV-突变体P1和NDW(PoulvacNDW_，一种市售的孵化后活疫苗，FortDodgeUSA)对18天龄的含胚卵进行胚胎接种实验。孵化率对NDVV-达到93％(30个中28个孵化)，对照组是96％(30个中29个孵化)(表5)。最小孵化率(23％)是用NDW(最大程度减毒的活疫苗)接种的一组卵得到的。这些结果显示NDVV-突变体不会显著影响孵化率。NDVV-保护鸡对抗致死因子侵袭。在两周龄，将所有由卵内接种卵孵化出的鸡放血，称重并用NDV的Herts株经肌内接种来侵染(表5)。在胚胎期用NDVV-接种的鸡产生高抗体水平，平均增重131gm，对于NDW接种的动物是85gm，对照动物是141gm。有趣的是，95％以上接种的动物得到保护不被侵染，而未接种的鸡全部死亡。这些数据表明将NDVV-突变体给予来源于SPF鸡的18天含胚卵是安全并有效的。表5用重组NDVV-突变体P1在胚胎期第18天接种的鸡受到致死性NDV侵染时的孵化率和保护力<tablesid="table3"num="005"><table>病毒剂量log10EID50／卵孵化率在第2周的平均重量(gm)在第2周的平均HI滴度A侵染后的存活率BNDVV-(a)3．522／30(73％)1334．0±1．119／20(95％)NDVV-(b)4．328／30(93％)1354．8±1．020／20(100％)NDVV-(c)5．421／30(70％)1255．4±1．219／19(100％)NDW5．17／30(23％)857．5±0．9Nd对照029／30(96％)1410．7±0．50／20(0％)</table></tables>A在2周龄时的血细胞凝集抑制(HI)滴度(2log)。B用NDV105．5ELD50／鸡的Herts株肌内侵染鸡。Nd未做实施例3用NDVV-突变体P1进行的卵内实验商业鸡胚的接种材料与方法卵内接种和侵染。在具有来源于母体的抗体的商业鸡胚内进行的该实验基本按照在SPF鸡胚内的卵内实验进行。简而言之，将总共120个18日龄的商业受精鸡卵分成4组，每组30个。将NDVV-以不同剂量卵内给予3个不同组。一组30个卵用阴性的尿囊液接种。在14天龄(大约接种疫苗后17天)时，用毒性NDV，Herts株肌内侵染全部动物。在10天内每天观察鸡的疾病临床症状或死亡率。就在侵染前，从所有接种疫苗的鸡和对照鸡个体中收集血样。通过HI实验检查血清中的抗NDV抗体。结果接种NDVV-的鸡的孵化率和增重。与得自SPF鸡卵的结果类似，卵内给予NDVV-不会影响胚胎期商业鸡卵的孵化率(表6)。侵染前，所有组中的全部孵出的鸡都是健康的。另外，用NDVV-接种过的所有组鸡的增重与阴性对照组相当，表明当卵内给予18日龄的商业胚胎期鸡卵时，NDVV-是安全的。血清转化和抗致命侵染的保护力。胚胎时用NDVV-接种过的鸡的抗体应答水平和保护力见表6。接受最高剂量的组平均HI滴度为1．8，该组中85％的鸡对侵染有保护力。NDVV-突破母体抗体可能的高水平的能力以及保护85％的鸡的能力是显著的。由于保护水平是剂量依赖性的，预计稍高的剂量能保护90％以上的接种鸡。表6用重组NDVV-突变体P1在胚胎期第18天接种的鸡受到致死性NDV侵染时的孵化率和保护力(a)在2周龄时的血细胞凝集抑制(HI)滴度(2log)。(b)用NDV105．5ELD50／鸡的Herts株肌内侵染鸡。图1向新城疫病毒基因组中P基因的编辑位点处导入突变。在负链基因组RNA中显示NDV基因顺序的示意图。编辑位点附近的序列(第2274-2300位)标在有义链中。修饰示于框中。由于各种修饰导致的氨基酸改变用粗体表示。核苷酸序列和核苷酸位点与Romer-Oberdorfer等(普通病毒学杂志802987-2995，1999；EMBL编号Y18898)一致。图2用蔗糖纯化过的重组病毒的NP和V蛋白。经20％蔗糖离心纯化感染的胚胎期卵的尿囊液中的毒粒，对病毒蛋白进行免疫印迹分析。根据NP的含量使加样到凝胶中的体积标准化。样品上样两份，并将印迹与抗NP的Mab(1-3道)或抗V肽的血清(4-6道)一起保温。AF来自未感染的胚胎期卵的尿囊液；P1NDVV-突变体P1；rNDV亲本F1NDV病毒。权利要求1．一种V蛋白表达量减少的NDV突变体(NDVV-)，其特征在于该突变体是V蛋白表型阳性的，感染细胞中≤6％的来源于P基因的mRNA编码VORF。2．权利要求1的NDV突变体，其特征在于感染细胞中≤3％，更优选≤1％的来源于P基因的mRNA编码VORF。3．权利要求1或2的NDV突变体，其特征在于磷蛋白(P)基因mRNA编辑位点UUUUUCCC(基因组RNA有义链)包含一个降低编辑的突变。4．权利要求1-3中任意一项的NDV突变体，其特征在于编辑位点处的突变是核苷酸取代。5．权利要求4的NDV突变体，其特征在于所述突变是沉默突变。6．权利要求3-5中任意一项的NDV突变体，其特征在于所述突变包含1或2个核苷酸，优选1个核苷酸。7．权利要求4的NDV突变体，其特征在于所述突变体包含一个位于编辑位点1-5位的突变。8．权利要求7的NDV突变体，其特征在于所述突变体包含一个位于编辑位点3或4位的突变，优选在3或4位的突变。9．权利要求8的NDV突变体，其特征在于该NDV突变体的编辑位点的核苷酸序列为UUCUUCCC或UUUGUCCC。10．权利要求1-9中任何一项的NDV突变体，其特征在于该NDV突变体包含另外的减毒突变。11．权利要求1-10中任何一项的NDV突变体，其特征在于该突变体另外包含一个编码禽类病原体的抗原的异源基因。12．抗禽类新城疫的活疫苗，其特征在于它包含权利要求1-11中任何一项所述的NDV突变体，以及药学可接受的载体。13．用于卵内给药的抗禽类新城疫的活疫苗，其特征在于它包含权利要求1-11中任何一项所述的NDV突变体，以及药学可接受的载体。14．权利要求12或13的活疫苗，其特征在于该疫苗所含剂量为每卵100μl或以下，优选50μl。15．权利要求12-14中任何一项的活疫苗，其特征在于所述疫苗还包含另一种禽类病原体的对胚胎安全的疫苗株。16．一种抗禽类新城疫的灭活疫苗，其特征在于该疫苗包含灭活的权利要求1-11中任何一项的NDV突变体，药学可接受载体和佐剂。17．权利要求1-11中任何一项所述NDV突变体用于制备经卵内给药而保护禽类抗ND的疫苗的用途。18．保护禽类抗ND的一种方法，包括将权利要求12-16中任意一项的疫苗经卵内途径给予禽类。全文摘要本发明提供了一种适合作为经卵内接种的候选疫苗的NDV突变体。该突变体V蛋白表达量减少,并且可以安全地在鸡胚孵化前给药。文档编号C12N15/09GK1281863SQ0012193公开日2001年1月31日申请日期2000年7月26日优先权日1999年7月27日发明者M·T·泰肖姆,S·C·C·卡拉克里斯提纳申请人:阿克佐诺贝尔公司