专利名称：：通过分子伴侣的共分泌制备天然折叠的和分泌的蛋白质的方法
技术领域：
：本发明涉及一种在原核细胞中表达后通过分子伴侣的共分泌制备一种水溶性的，自然折叠和分泌的多肽。原核生物中蛋白质的合成，也称作翻译，发生在细胞质的核糖体上。当重组DNA在原核宿主生物中表达时，通常需要将这一过程中得到的重组基因产物或蛋白质从细胞质中通过细菌内膜分泌至内膜和外膜之间的周质腔中。然后，分泌的蛋白质可通过例如渗透冲击从周质腔中释放进培养基中。这一方法的缺点是分泌的多肽常常不形成天然的，具有生物活性的构型(Hockney，TJBTECH12(1994)456-463)。最近，分子伴侣和折叠催化剂，例如肽基脯氨酸顺/反异构酶或蛋白质二硫键异构酶(Glockshuber等，EP-A0510658)被用于提高天然重组蛋白质在体内折叠时的产率(Thomas等，Appl.Biochem.Biotechnol.66(1997)197-238)。在某些情况下，这可引起表达的极大的改善，例如，对核酮糖二磷酸羧化酶(RUBISCO；Goloubinoff等，Nature337(1989)44-47)，人类胶原酶原(Lee&Olins，J.Biol.Chem.267(1992)2849-2852)或来自大鼠的神经元氧化氮合成酶(Roman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)8428-8432)即属于这种情况。在这些例子中，来自大肠杆菌的GroEL/ES或者DnaK系统在胞质中被共过量表达。当重组蛋白质被分泌至大肠杆菌的周质中时也对分子伴侣的共表达进行了检测。但是，在这种情况下，仅对分子伴侣的胞质过表达进行了评估，以使向周质中的分泌最适化(Perez-Perez等，Biochem.Biophys.Res.Commun.210(1995)524-529；Sato等，Bioehem.Biophys.Res.Commun.202(1994)258-264；Berges等，Appl.Environ.Microbiol.62(1996)55-60)。以前在大肠杆菌中的共表达的实验集中在折叠-辅助蛋白质，例如蛋白质二硫键异构酶(PDI；Glockshuber等，EP-A0510658)或者肽基脯氨酸顺/反异构酶(Knappik等，Bio/Technology11(1993)77-83；Qiu等，Appl.Environm.Microbiol.64(1998)4891-4896和Schmidt等，Prot.Engin.11(1998)601-607)或者Skp蛋白质(Hayhurst和Harris，ProteinExpr.Purif.15(1999)336-343)。本发明的目的是提供一种在原核细胞中表达后制备一种水溶性的，自然折叠的多肽的方法，这可以一种简单的方式进行，不需要费力的体外后处理，例如包含体的溶解，还原和复性。本发明的目的通过一种制备含有两个或几个通过二硫键连接的半胱氨酸的天然折叠的真核多肽的方法，该方法包括a)培养原核细胞，其中，所说的原核细胞含有一种表达载体，该载体编码所说的在N-末端含有一种原核细胞信号序列的多肽，b)将该多肽分泌至周质中或培养基中，c)切割信号序列，并从周质或培养基中分离该多肽。其中，在所说的原核细胞中还表达一种编码一种分子伴侣的核酸，并且该分子伴侣被分泌至周质中，其先决条件是，培养是在没有精氨酸或一种通式ⅠR2-CO-NRR1(Ⅰ)的化合物的存在下进行的，其中，R和R1表示氢或一种饱和的或不饱和的支链或非支链的C1-C4烷基链和R2表示氢，NHR1或一种饱和的或不饱和的支链或非支链的C1-C3烷基链。在这一方法中，优选该分子伴侣是过表达的。在本发明的方法的一个优选实施方案中，含有SH基团的还原硫醇(thiol)试剂被额外加入在用于培养原核细胞的培养基(发酵培养基)中，这进一步提高重组产生的蛋白质的产率。优选加入0.1-15mmol/l的硫醇试剂。按照本发明，术语“硫醇试剂”或者表示具有SH基团的还原(还原的)硫醇试剂，或者表示具有SH基团的还原硫醇试剂与具有二硫键基团的氧化硫醇试剂的混合物。优选的物质为还原的谷胱甘肽(GSH)，半胱氨酸，N-乙酰半胱氨酸，半胱胺，β-巯基乙醇以及类似的化合物。这种硫醇试剂可单独使用，也可以混合物的形式使用。每分子具有单个SH基团的硫醇试剂例如谷胱甘肽(GSH)特别适用。当重组DNA在原核细胞中表达时已知诸如谷胱甘肽的硫醇试剂可改善天然折叠的蛋白质的产率(Glockshuber等，EP-AO510658)。本发明中，分子伴侣是指可防止其它的非天然蛋白质在体内聚集并促进它们的天然构型的形成的蛋白质(综述Silver和Way，Cell74(1994)5-6和Cyr等，TIBS19(1994)176-181)。分子伴侣在现有技术中被用于稳定蛋白质，防止它们聚集和失活(Buchner等，EP-A0556726A1)。优选使用HSP40型的ATP-依赖性分子伴侣(分子量约为40kDa)或者小热休克蛋白质(sHSP)。DnaJ是一种40kDa的热休克蛋白质，它存在于大肠杆菌的细胞质中并且是所谓的Hsp70分子伴侣系统的一部分(Bukau，B.&Horwich，A.，Cell92(1998)351-366)。DnaK(Hsp70)和GrpE也属于这一系统。特定的蛋白通过DnaK系统在一种ATP-依赖性过程中被折叠成天然构型(Schroder等，EMBOJ.12(1993)4137-4144；Langer等，Nature356(1992)683-689)。这一系统另外还需要ATP将变性的蛋白质进行重新折叠。DnaJ也在不存在DnaK和ATP的情况下防止非天然蛋白质的聚集，并介导可折叠状态(Schroder等，EMBOJ.12(1993)4137-4144)。优选含有氨基酸1-108的DnaJ的N-末端片段(下文称作J-区域)的共分泌(Kelley，TIBS23(1998)222-227)。负责与DnaK相互作用的J-区域和一种G/F-富集区域位于这一区域中(Wall等，J.Biol.Chem.270(1995)2139-2144)。已有实验显示DnaJ在胞液中的共表达可导致可溶性蛋白质的产率的提高(Yokoyama等，Microbiol.Ferment.Techno1.62(1998)1205-1210)。Hsp25(例如来自小鼠)是一个小热休克蛋白质的代表(sHsps；Gaestel等，Eur.J.Biochem.179(1989)209-213)，它是一种遍在类型的分子伴侣。这些蛋白质的分子量在15和30kDa之间。在热休克过程中，细胞中有相当量的sHsp聚集(高达细胞总蛋白的1％-Arrigo&Landry(1994)，InMorimoto(Ed.)TheBiologyofHeatShockProteinsandMolecularChaperones，ColdSpringHarbourPress，335-373)。与DnaJ蛋白质一样，sHsp具有防止非天然蛋白质聚集并将它们保持在可折叠的状态的功能(Jakob等，J.Bio1.Chem.268(1993)1517-1520；Ehrnsperger等，FMBOJ.16(1997)221-229)。所有的sHsp具有与真核细胞的眼睛玻璃体蛋白质αA和αB-晶体蛋白同源性的区域，αA和αB-晶体蛋白自身是sHsp家族的成员(Jakob和Buchner，TIBS19(1994)205-211)。本发明所使用的术语“过表达”是指分泌的蛋白质，例如DnaJ和Hsp25的表达与相应的原核宿主生物体中的野生型表达相比表达的提高(优选至少提高100％)。这种过表达可在例如这些基因(蛋白质的，分子伴侣的和/或信号肽的)在强的原核的，优选可诱导的，表达信号(例如lac或者T7启动子或者它们的衍生物)的控制之下得到。包括重组DNA上的调节区域(启动子和终止子)的用于多肽(蛋白质)过表达的分泌构建体优选被整合进一种载体中，该载体还编码精氨酸-tRNAAGA/AGG，这在原核细胞中是罕见的，或者它与编码这种tRNA的载体共表达(Brinkmann等，Gene85(1989)109-114)。这能够使各种蛋白质共过表达至细菌的周质中以及使这种罕见的tRNAArgAGA/AGG转录，这导致所需的蛋白质在细菌宿主生物中合成的提高。编码该多肽和分子伴侣的核酸可被定位在一个载体或两个不同的载体上。本发明中的原核信号序列是指一种来源于原核细胞的核酸片段，优选来源于格兰氏阴性细菌，并保证与该信号肽结合的蛋白质可穿过细菌内膜。结果，该蛋白质位于周质中或细胞上清液中。这种信号序列通常具有18-30个氨基酸的长度，描述于，例如，Murphy&BeckwithExportofProteinstotheCellEnvelopeinEscherichiacoli，以及Neidhardt等(editors)Escherichiacoli和Salmonella，SecondEdition，Vol.1，ASMPress，Washington，1996，p.967-978。细菌信号序列的切除可发生在例如一个Ala-X-Ala序列之后(vonHeijne等，J.Mol.Biol.184(1985)99-105)。细菌信号肽酶的结构描述于Paetzel等，Nature396(1998)186-190。优选使用通过位于原核细胞的周质中的蛋白酶从所需的蛋白质再次切除的信号序列。或者，这种蛋白酶可被加入在细胞上清液中或者加入在分离的蛋白质中来切除信号序列。本发明的方法可改善大量的真核蛋白质的异源性表达，例如蛋白酶，干扰素，蛋白质激素，抗体或者它们的片段。该方法特别适用于在天然状态下含有至少两个通过二硫键相连的半胱氨酸的蛋白质的异源性表达，特别是当它们不具有在N-末端融合的原核信号序列，以及在它们的原核表达过程中形成了不溶性的包含体的情况下。该方法特别适用于在天然状态下含有多于5个二硫键的蛋白质。这样一种蛋白质是例如一种重组血纤蛋白溶酶原激活物(下文称作rPA，Martin等，Cardiovasc.DrugRev.11(1993)299-311，US-PatentNo.5，223，256)。rPA具有9个二硫键，这9个二硫键在大肠杆菌的还原性胞液中不会形成。蛋白质和分子伴侣在周质中的定位是通过与可穿过细菌内膜的信号肽的“可操纵连接”保证的。为了从大肠杆菌中分离功能形式的分泌性rPA蛋白，将来自质粒pA27fd7(Kohnert等，ProteinEngineering5(1992)93-100)的这种蛋白质的基因通过基因工程方法融合到格兰氏阴性细菌的原核信号序列上，例如融合到来自胡萝卜软腐欧文氏菌的果胶酸酶(PelB)的信号序列上。基因融合是通过克隆进载体pET20b(+)(NovagenInc.，Madison，USA)构建的。结构，基因表达是在T7启动子的控制之下。融合蛋白质中存在的信号序列造成向周质中的分泌。信号序列在分泌的过程中或之后被位于内膜中的肽酶切割。然后分泌的蛋白质可在周质中折叠。在这一空间中的氧化条件促使二硫桥的形成(WulfingundPluckthun，Mol.Microbiol.12(1994)685-692)。在周质中DnaJ，J-区域或者Hsp25的同时共过表达促使功能性蛋白质的产率提高约5-10倍(表1)。下文通过实施例，出版物，序列表和附图对本发明进行进一步的说明，权利要求限定保护范围。所描述的方法应被认为是举例性的，即使在改动之后仍描述本发明的主题。序列表简要描述SEQIDNO1显示表达质粒pUBS520-pIN-dnaJ的部分序列，它编码由OmpA信号序列和DnaJ以及调节序列(启动子，终止子)组成的融合蛋白质，它是从pINⅢompA3-dnaJ扩增的。SEQIDNO2显示OmpA-DnaJ融合多肽的氨基酸序列。SEQIDNO3显示表达质粒pUBS520-pIN-J-区域的部分序列，它编码由OmpA信号序列和J-区域以及调节序列(启动子，终止子)组成的融合蛋白质，它是从pINⅢompA3-dnaJ扩增的。SEQIDNO4显示OmpA-J-区域融合多肽的氨基酸序列。SEQIDNO5显示表达质粒pUBS520-pIN-hsp25的部分序列，它编码由OmpA信号序列和Hsp25以及调节序列(启动子，终止子)组成的融合蛋白质，它是从pINⅢompA3-hsp25扩增的。SEQIDNO6显示OmpA-Hsp25融合多肽的氨基酸序列。SEQIDNO7显示表达质粒pUBS520-pIN-ScFvOx的部分序列，它编码由PelB信号序列和ScFvOxazolon以及调节序列(启动子，终止子)组成的融合蛋白质，它是从pHEN-ScFv或者pINⅢompA3扩增的。SEQIDNO8显示PelB-scFvoxazolon融合多肽的氨基酸序列。SEQIDNO9显示表达质粒pET20b(+)-rPA的部分序列，它编码由PelB信号序列和rPA组成的融合蛋白质。SEQ-IDNO10显示PelB-rPA融合多肽的氨基酸序列。附图简要描述图l显示周质和胞液中表达的DnaJ用50μg/ml的胰蛋白酶进行限制水解的Western印迹，以检测该蛋白质在细胞中的定位和天然折叠。分子量标准加在左边和右边。作为对照，对纯化的DnaJ(左)进行了同样的处理，但使用6.25μg/ml胰蛋白酶。图2显示表达质粒pUBS520-pIN-dnaJ。图3显示表达质粒pUBS520-pIN-J-区域。图4显示表达质粒pUBS520-pIN-hsp25。图5显示表达质粒pUBS520-ScFvOx。图6显示表达质粒pET20b(+)-rPA.综述对于DnaJ，J-区域和Hsp25在大肠杆菌中的周质过表达，将编码这些蛋白质的DNA通过基因工程技术与大肠杆菌的外膜蛋白质A(OmpA)的信号序列融合，并将该融合体在1ac-1pp启动子的控制之下在大肠杆菌中在一个重组质粒上表达。结果，DnaJ和Hsp25的多肽链被转移至原核宿主生物体的周质中并在其中进行天然折叠。它们的定位和DNAJ的天然折叠通过使用胰蛋白酶的限制水解和通过Western印迹来显示。实施例1表达质粒pINⅢompA3-dnaJ的构建分子遗传技术基于Ausubel等(Ed.)，J.Wiley&Sons，1997，Curr.ProtocolsofMolecularBiology。寡核苷酸得自以下公司MWGBiotech，EbersbergorGIBCOLifeSciences，Eggenstein，GER。编码DnaJ，GeneBankAccessionNo.M12565，的基因通过限制性内切酶位点EcoRⅠ和BamHⅠ被克隆进表达质粒pINⅢompA3(Ghayreb等，EMBOJ.3(1984)2437-2442)。被克隆的PCR片段的序列通过双脱氧测序方法检测(LiCorDNA-Sequencer4000，MWGBiotech，Fbersberg)。将得到的质粒命名为pINⅢompA3-dnaJ。在周质中表达的DnaJ的序列不同于野生型蛋白，不同点为该多肽序列的开始为Gly-Ile-Pro而不是Met，因而具有一个2个氨基酸的N-末端延伸。因而，DnaJ是在lac-lpp启动子的控制之下，该启动子被IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导。实施例2表达质粒pUBS520-pIN-dnaJ的构建将来自质粒pINⅢompA3-dnaJ的编码lac-lpp操纵子，信号序列，dnaJ基因和该操纵子的终止子的区段通过PCR扩增(SEQIDNO1)。将该PCR产物用限制性内切酶BglⅡ进行切割并克隆进用限制性内切酶BamHI线性化的载体pUBS520。将得到的质粒命名为pUBS520-pIN-dnaJ(图2)。实施例3表达质粒puBS520-pIN-J-区域通过使用QuikChange诱变系统(Promega，Mannheim，DE)将两个终止密码子插入在质粒puBS520-pIN-dnaJ的核苷酸324之后，从而仅使最初的108个氨基酸被表达。通过双脱氧测序(LiCorDNA-Sequencer4000，MWGBiotech，Ebersberg)确定突变的区域的序列，并通过Western印迹和用抗-DnaJ抗体检测测定截短的蛋白质片段的表达。将形成的质粒命名为puBS520-pIN-J-区域(图3)。实施例4表达质粒pINⅢompA3-hsp25的构建将编码Hsp25，GeneBankAccessionNo.L07577，的基因通过限制性酶切位点EcoRⅠ和BamHⅠ克隆进表达质粒pINⅢompA3(Ghayreb等，EMBOJ.3(1984)2437-2442)。通过双脱氧测序检测克隆的PCR片段的序列(LiCorDNA-Sequencer4000，MWGBiotech，Fbersberg)。将得到的质粒命名为pINⅢompA3-hsp25。在周质中表达的Hsp25的序列不同于野生型蛋白质的序列，其不同点为该多肽序列的开始为Gly-Ile-Leu而不是Met，因而在N-末端具有2个氨基酸的延伸。因而，Hsp25是在lac-lpp启动子的控制之下，该启动子被IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导。实施例5表达质粒pUBS520-pIN-hsp25的构建将来自质粒pINⅢompA3-hsp25的编码lac-lpp操纵子，信号序列，hsp25基因和该操纵子的终止子的区段通过PCR扩增(SEQIDNO5)。将该PCR产物用限制性内切酶BglⅡ进行切割并克隆进用限制性内切酶BamHⅠ线性化的载体pUBS520。将得到的质粒命名为pUBS520-pIN-hsp25(图4)。实施例6表达质粒pUBS520-ScFvOx的构建对一种不具有伴侣分子性能的针对半抗原oxazolon的单链Fv片段(ScFvOxazolon；Fiedler和Conrad，Bio/Technology13(1995)的共表达进行检测，作为负对照。将来自质粒pHFN-ScFvOx的编码lac启动子的区域、信号序列pelB和scfvox基因通过PCR扩增。来质粒pINⅢompA3的编码lpp终止子的区域在第二个PCR中扩增。在下一个PCR中将这两个片段融合。将以这种方式形成的PCR产物(SEQIDNO7)用限制性内切酶BglⅡ切割并克隆进用限制性内切酶BamHⅠ线性化的载体pUBS520中。将得到的质粒命名为pUBS520-ScFvOx(图5)。实施例7表达质粒pET20b(+)-rPA的构建将来自质粒载体pA27fd7(Kohnert等，ProteinEngineering5(1992)93-100)的rPA的基因通过PCR扩增。将PCR产物用限制性内切酶NcoⅠ和BamHI切割并克隆进质粒载体pET20b(+)(NovagenInc.，Madison，USA)。该质粒编码一种融合蛋白质，它是由PelB的信号序列和rPA组成的，并且rPA向周质中的分泌通过双脱氧测序进行检测(LiCorDNA-Sequencer4000，MWGBiotech，Ebersberg，DE)。将该构建体命名为pFT20b(+)-rPA(SEQIDNO10)(图6)。rPA在质粒中在T7启动子的控制之下进行表达，在大肠杆菌菌株BL21(DF3)中的T7-RNA-聚合酶是在lacUV5启动子的控制之下。通过加入IPTG进行诱导。在周质中表达的rPA不同于由Kohnert等描述的血纤蛋白溶酶原激活物，其不同点在于第二个氨基酸(Ser)被Ala替换。实施例8rPA大肠杆菌周质中的功能性表达将静止过夜培养的大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Studier&Moffat，J.MoLBiol.189(1986)113-130)，它含有pET20b(+)-rPA和pUBS520-pIN-dnaJ(DnaJ的共表达)，过夜培养的大肠杆菌BL21(DE3)细胞，它含有pET20b(+)-rPA和pUBS520-pIN-J-区域(J-区域的共表达)，过夜培养的大肠杆菌BL21(DE3)细胞，它含有pET20b(+)-rPA和pUBS520-pIN-hsp25(Hsp25的共表达)，过夜培养的大肠杆菌BL21(DE3)细胞，它含有pET20b(+)-rPA和pUBS520-ScFvOx(ScFvOx的共表达)，过夜培养的大肠杆菌BL21(DE3)细胞，它含有pET20b(+)-rPA和pUBS520或者过夜培养的大肠杆菌BL21(DE3)细胞，它含有pET20b(+)和pUBS520(对照培养)，以1∶50的比率稀释在100mlLB-培养基中，该培养基中含有氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml，FlukaChemica，Neu-Ulm，GER)，并在24℃和170rpm下振荡。在生长3小时后，将5ml的培养物等份试样加入10mlLB培养基中，该LB培养基中含有上述量的氨苄青霉素和卡那霉素和5mMGSH(Fluka，GER)并将它们用1mMIPTG(AppliChem，Darmstadt，GER)诱导。将细胞再在24℃和170rpm下振荡21小时，并在测定OD600后取出1ml样品。将这些1ml的细胞样品在2mlEppendorf反应管中，按照Jacobi等(J.Biol.Chem.272(1997)21692-21699)的方法的改良方法进行分级。详细地说，将500μl的分级缓冲液(150mMNaCl(RothGmbH)，50mMTris/HCl(RothGmbH，5mMFDTA(Biomol)和1mg/ml多粘菌素B硫酸盐(Sigma)，pH7.5)加入细胞团粒中，在10℃在一个Eppendorf热振荡器上在1400rpm振荡1小时，然后在14000rpm在一个冷却至10℃的Eppendorf微离心器上离心15分钟，形成一个含有可溶性周质蛋白质的级分(上清液)和一个残留级分(团粒)。基本上按照Verheijen等Thromb.Haemostasis48(1982)266-269)的方法测定rPA的活性。将所有的在细胞抽提物中测定的rPA浓度对OD600=1的细胞悬液进行标准化，以校正在不同的缓冲液中测定时发生的误差。结果示于表1。表1分子伴侣的共表达在大肠杆菌周质中在发酵培养基中5mMGSH的存在下对rPA形成的影响<tablesid="table1"num="001"><table>共表达的蛋白质rPA(ng/ml*OD600)刺激因子0.030±0.00129DnaJ0.197±0.01929J区域0.339±0.00716Hsp250.053±0.00227ScFvOxazolon(对照)0.041±0.00313</table></tables>培养是在5mMGSH的存在下进行的。实施例9通过pINⅢompA3表达的DnaJ的周质定位的测定制备原生质球，以改善通过pINⅢompA3-dnaJ分泌至周质中的DnaJ的周质定位和正确折叠。该含有pINⅢompA3-dnaJ的大肠杆菌XLI蓝色细胞是从含有100pg/ml氨苄青霉素(Sigma，Deisenhofen)的LB培养基(1LLB培养基含有l0gBacto-tryptone(DifcoFactories，Detroit，Michigan，USA)，5g酵母(DifcoFactories)和5gNaCl(RothGmbH，Karlsruhe))，在37℃和200rpm培养并在2.75小时后用1mMIPTG诱导(OD600约0.5)的静止预先培养物以1∶50的比例稀释后得到的。在诱导剂的存在下生长3小时后，通过离心收集细胞(Eppendorf微离心，5000rpm，5分钟)。将一个含有一种用于细胞内过表达DnaJ的质粒的大肠杆菌菌株作为对照进行培养，并诱导3小时。从离心后得到的细胞团粒按照下述方法制备原生质球将相应与QD600为1的等量的2ml细菌按照Thorstenson等，J.Bacteriol.179(1997)5333-5339的方法进行分级。将以团粒形式聚集的原生质球溶解在含有100mMNaCl的30μl50mMTris/HCI，pH8.0的溶液中，作为对照，将原生质球溶解在相同的缓冲液中，但加入0.1％Triton-X-100(Amresco，Solon，Ohio，USA)。对于随后的用胰蛋白酶限制水解来说，将15μl的各个原生质球制剂(含有或不含有Triton-X-100)与2μl的1mg/ml胰蛋白酶(RocheDiagnosticsGmbH，GER)和23μl的含有100mMNaCl的50mMTris/HCl，pH8.0混合，并在20℃温浴。在0，5和30分钟后，取出8μl样品，与2μl4mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂和3μlSDS-PAGE加样缓冲液(4％甘油(Sigma，Deisenhofen)，0.5％SDS(ICN)，2％巯基乙醇(Sigma)，0.0625MTris/HCl，pH6.8和溴酚兰(Sigma))混合，并沸煮5分钟。在对照实验中，将2μg纯化的DnaJ(2μg／μl)与lμl100μg/ml胰蛋白酶和含有100mMNaCl的14μl50mMTris/HCl，pH8.0混合，在20℃下温浴，并在所述的时间结束水解。将水解的产物按照Lammli等，Nature227(1970)680-685)所述的SDS-PAGE进行分离。将分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上(RioRadLaboratories，Munich)(Khyse-Anderson，J.Biochem.Biophys.Methods10(1984)203-207；Towbin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79(1979)267-271)。将该膜用TBS-5％奶粉(Glucksklee，NestleFrankfurt)封闭过夜，然后用TBS5％奶粉中的抗-DnaJ抗体反应2小时。在TBS中洗涤5分钟的三个洗涤步骤之后，将它们用TBS-5％奶粉中的额外的抗体(抗兔-IgG过氧化物酶，AmershamLifeSciences，Braunschweig)温浴1.5小时，并在用TBS缓冲液洗涤5次。使用AmershamCompany的ECLWestern印迹测定试剂盒进行检测。结果如图1所示。由于在原生质球制备后分泌的分子伴侣是蛋白酶敏感性的，这表明它位于内膜的周质侧。相反，细胞内DnaJ在原生质球制备后仍为蛋白酶保护的。由Triton-X-100造成的原生质球的通透化导致细胞内DnaJ被胰蛋白酶消化。在周质中表达的DnaJ的切割类型与纯化的天然的DnaJ的相同。因而这表明周质中表达的产物在这一空间中是天然形式的。参考文献Arrigo&Landry(1994)InMorimoto(publ.):TheBiologyofHeatShockProteinsandMolecularChaperones(热休克蛋白质和分子伴侣的生物学)，ColdSpringHarbourPress，335-373Ausubel等(publ.)CurrentProtocolsinMolecularBiology(当代生物学方法)，J.Wiley&Sons,1997Berges等，Appl.Environ.Microbiol.62(1996)55-60Brinknann等，Gene(基因)85(1989)109-114Bukau，B.&Horwich，A.，Cell(细胞)92(1998)351-366Cyr等，TIBS19(1994)176-181)Ehrnsperger等，FMBO1.16(1997)221-229EP-A0510658EP-A0556726Fiedler和Conrad，Bio/Technology13(1995)1090-1093Gaestel等，Eur.J.Biochem.(欧洲生物化学杂志)179(1989)209-213Ghayreb等，FMBOJ.3(1984)2437-2442Goloubinoff等，Nature(自然)337(1989)44-47Hayhurst和Harris，ProteinExpr.Purif．15(1999)336-343Hockney，TIBTECH12(1994)456-463Jacobi等J.Biol.Chem.(生物化学杂志)272(1997)21692-21699Jakob等，J.Biol．Chem.268(1993)1517-1520Jakob和Buchner，TIBS19(1994)205-211Kelley，TIBS23(1998)222-227Khyse-Anderson，J.Biochem.Biophys.Methods10(1984)203-207Knappik等，Bio/Technology11(1993)77-83Kohnert等，ProteinEngineering(蛋白质工程)5(1992)93-100Lammli等，Nature227(1970)680-685Langer等，Nature356(1992)683-689Lee&Olins，J.Biol.Chem.267(1992)2849-2852Martin等，Cardiovasc.DrugRev.11(1993)299-311Murphy&Beckwith:ExportofProteinstotheCellEnvelopeinEscherichiacoliNeidhardt等(publ.)Escherichiacoli和Salmonella，SecondEdition，Vol.1，ASMPress，Washington，1996，5.967-978Paetzel等，Nature396(1998)186-190Perez-Perez等，Biochem.Biophys.Res.Commun.(生物化学生物物理学研究通讯)210(1995)524-529Qiu等，Appl.Fnvironm.Microbiol.64(1998)4891-4896Roman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)8428-8432Sato等，Biochem.Biophys.Res.Commun.202(1994)258-264Schmidt等，Prot.Engin.11(1998)601-607Schroder等，EMBOJ.12(1993)4137-4144Silver和Way，Cell(细胞)74(1994)5-6Studier&Moffat，J.Mol.Biol.189(19&6)113-130Thomas等，Appl.Biochem.Biotechnol.(应用生物化学生物技术)66(1997)197-238Thorstenson等，J.Bacteriol.(细菌学杂志)179(1997)5333-5339Towbin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊)79(1979)267-271US-Patent(美国专利)No.5，223，256Verheijen等Thromb.Haemostasis48(1982)266-269Wall等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)270(1995)2139-2144WulflngundPluckthun，Mol.Microbiol.(分子微生物学)12(1994)685-692Yokoyama等，Microbiol.Ferment.Technol.(微生物发酵杂志)62(1998)1205-1210序列表<110>霍夫曼拉罗奇有限公司<120>通过分子伴侣的共分泌制备天然折叠的和分泌的蛋白质的方法<130>案号20381<140><141><150>EP99114811.5<151>1999-07-29<160>10<170>PatentlnVer.2.1<210>1<211>1881<212>DNA<213>大肠杆菌<220><221>CDS<222>(392)..(1591)<400>1taggcgtatcacgaggccctttggataaccagaagcaataaaaaatcaaatcggatttca60ctatataatctcactttatctaagatgaatccgatggaagcatcctgttttctctcaatt120tttttatctaaaacccagcgttcgatgcttctttgagcgaacgatcaaaaataagtgcct180tcccatcaaaaaaatattctcaacataaaaaactttgtgtaatacttgtaacgctacatg240gagattaactcaatctagctagagaggctttacactttatgcttccggctcgtataatgt300gtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacggat360tcactggaactctagataacgagggcaaaaaatgaaaaagacagctatcgcg412MetLysLysThrAlaIleAla15attgcagtggcactggctggtttcgctaccgtagcgcaggccggaatt460IleAlaValAlaLeuAlaGlyPheAlaThrValAlaGlnAlaGlyIle101520ccagctaagcaagattattacgagattttaggcgtttccaaaacagcg508ProAlaLysGlnAspTyrTyrGluIleLeuGlyValSerLysThrAla253035gaagagcgtgaaatcagaaaggcctacaaacgcctggccatgaaatac556GluGluArgGluIleArgLysAlaTyrLysArgLeuAlaMetLysTyr40455055cacccggaccgtaaccagggtgacaaagaggccgaggcgaaatttaaa604HisProAspArgAsnGlnGlyAspLysGluAlaGluAlaLysPheLys606570gagatcaaggaagcttatgaagttctgaccgactcgcaaaaacgtgcg652GluIleLysGluAlaTyrGluValLeuThrAspSerGlnLysArgAla758085gcatacgatcagtatggtcatgctgcgtttgagcaaggtggcatgggc700AlaTyrAspGlnTyrGlyHisAlaAlaPheGluGlnGlyGlyMetGly9095100ggcggcggttttggcggcggcgcagacttcagcgatatttttggtgac748GlyGlyGlyPheGlyGlyGlyAlaAspPheSerAspIlePheGlyAsp105110115gttttcggcgatatttttggcggcggacgtggtcgtcaacgtgcggcg796ValPheGlyAspIlePheGlyGlyGlyArgGlyArgGlnArgAlaAla120125130135cgcggtgctgatttacgctataacatggagctcaccctcgaagaagct844ArgGlyAlaAspLeuArgTyrAsnMetGluLeuThrLeuGluGluAla140145150gtacgtggcgtgaccaaagagatccgcattccgactctggaagagtgt892ValArgGlyValThrLysGluIleArgIleProThrLeuGluGluCys155160165gacgtttgccacggtagcggtgcaaaaccaggtacacagccgcagact940AspValCysHisGlySerGlyAlaLysProGlyThrGlnProGlnThr170175180tgtccgacctgtcatggttctggtcaggtgcagatgcgcc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