编码β－微管蛋白的DNA及其应用的制作方法

专利名称：编码β－微管蛋白的DNA及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及到编码β-微管蛋白的DNA，该微管蛋白来自圆线科(strongylidae)的线虫，还涉及到该DNA所编码的多肽，该DNA在对这些线虫的驱肠虫药物抗性进行诊断中的应用、在对这些线虫的种类进行鉴别中的应用、β-微管蛋白作为一种疫苗的一个组分的应用，以及一种用于对新的驱肠虫或抗生素化合物进行鉴别的方法。
寄生类蠕虫(蠕虫)造成人类和动物的健康问题并且导致可观的经济损失。在1996年，世界范围内用于驱肠虫药物的花费超过了20亿美元。目前所使用的最重要的驱肠虫药物根据其作用机制可以被分为3类1.环脒噻嘧啶和Morantel，同imidazothiazoles四咪唑和左旋四咪唑一起作为寄生虫的神经系统的胆碱能受体发挥作用。
2.苯并咪唑为微管多聚化的抑制剂并且导致微管单倍的解聚，随后一系列细胞功能丧失，例如细胞内转运和细胞分裂。
3.大环内酯类结合并打开谷氨酰胺能氯通道并且随后作为线虫和节肢动物的神经系统的抑制剂发挥作用。
微管通过微管蛋白亚基而构建。微管蛋白为一种二聚体蛋白，该蛋白由α-和β-微管蛋白组成并且处于微管蛋白和微管的一种动态平衡之中。该平衡可受到外源物质的影响，该物质被称为微管抑制剂。这样的抑制剂的其中一些，例如苯并咪唑，通过同微管蛋白相结合而起作用，由此它们阻止了这些亚基自解离以形成微管，而同时在相反的一端该微管的解体在继续进行。由此，细胞内的维系生存的进程发生了功能紊乱并且最终发生了细胞和整个生物体的死亡(Lacey，E.(1990)Mode of action of benzimidazoles.Parasitology Today6，112-115)。这样的微管抑制剂包括多类化合物，这些化合物可以人工合成制备或者由各种生物体产生。
微管抑制剂同来自各种生物体的微管蛋白的结合在结合的亲合性上表现出巨大的差异。由此，驱肠虫药物奥芬达唑(oxfendazole)和噻苯达唑(thiabendazole)对于来自ascarida galli的微管蛋白表现出高亲合性而对诸如绵羊这样的哺乳类动物的微管蛋白仅仅表现出低微的亲合性(Dawson et al.(1983)Purification andcharacterisation of tubulin from the parasitic nematode，Ascaridia galli，Molecular and Biochemical Parasitoloigy7，267-277)。苯并咪唑的选择毒性可通过这一选择性亲合性来解释(Lacey，E.(1988)The role of the cytoskeletal protein，tubulin，in the mode of action and mechanism of drug resistanceto benzimidazoles，Internationl Journal for Parasitology 18，885-936)。
这些驱肠虫药物的广泛使用已经导致了对这三类药物的相当严重的抗性问题，特别是在家畜之中(Bauer et al.(1994)Anthelminticresistance in nematodes of farm animals. A seminar organizedfor the European Commission，Brussels，Belgium，8 to 9November 1993，pp.17-24)。最广为使用的驱肠虫药物为苯并咪唑。对苯并咪唑的抗性已经在世界范围内在绵羊、牛、猪、和马的寄生虫病例之中有所描述。苯并咪唑是一种广谱驱肠虫药物，它可作用于线虫、绦虫和吸虫。在德国种马农场中的调查在80％以上的情况下显示出小圆线虫对苯并咪唑的抗性(Ullrich et al.(1988)Benzimidazole resistance to small strongylids(Cyathostominae)distribution in horse stock in Nothrhine-Westphalia，BerlinerMünchner Tierrztliche Wochenschrift 101，406-408)。
对于以驱肠虫药物进行的有效治疗，获得关于在马体内或马群中的蠕虫的可能抗性的信息是十分重要的。为检查小圆线虫(kleinenStrongyliden)的一个蠕虫群体的可能的抗性已经开发出一种诊断方法，该方法基于在寄生虫发育阶段(卵、蚴)的驱肠虫药物的活性(Coles et al.(1992)World Association for the Advancement ofVeterinary Parasitology(W.A.A.V.P.)Methods for the detectionof anthelmintic resistance in nematodes of veterinary importance，Veterinary Parasitology，44，35-44)。“蚴发育分析”(LDA)描述了驱肠虫药物在非寄生的第一蚴阶段的效果对于所使用的驱肠虫药物浓度的函数。通过类似的方式，第二种方法，“卵孵化分析”(EHA)使用驱肠虫药物在蚴的孵化中的抑制作用作为所使用的驱肠虫药物浓度的函数。这两个方法的缺点在于结果的低可重复性。进一步，这两种方法均耗时费力。
进一步，这两种方法的敏感性均很低。存在的抗性只有在25％以上的群体为抗性时才能被检测到(Roos et al.(1995)New geneticand practical implications of selection for anthelminticresistance in parasitic nematodes，Parasitoligy Today 11，148-150)。
因此，迫切需要敏感、迅速和可重复的诊断方法。对于绵羊寄生虫捻转血矛线虫(haemonchus contortus)和Teladorsagiacircumcincta，一种基于PCR技术的方法已经有所描述。这是根据于β-微管蛋白同型l基因在密码子200上的至少一个点突变(Elardet al.(1999)PCR diagnosis of benzimidazole-susceptibilityor-resistance in natural population of the small ruminantparasite，Teladorsagia circumcincta，Veterinary Parasitology80，231-237)。在密码子200上的点突变导致酪氨酸对苯丙氨酸的氨基酸替换并且同该突变蛋白的苯并咪唑抗性相关联(Kwa et al.(1995)β-tubulin genes from parasitic nematode haemonchuscontortus modulate drug resistance In Caenorhabditis elegans，Journal of Molecular Biology 246，500-510)。
从对捻转血矛线虫的研究中已知编码微管蛋白的线虫序列是种属特异的(WO 92/03549)。
马的小圆线虫的各种类的区别在于流行病学发生频率。世界上最重要和最常见的种类包括细颈杯环线虫(Cylicocyclus nassatus)、冠状盅口线虫(cyathostomum coronatum)、碗状盅口线虫(cyathostomum catinatum)。这些种类对于苯并咪唑的抗性已经在不同国家中有所描述，包括在德国(Burger，H-J.and Bauer，C.(1987)Efficacy of four anthelmintics against benzidazole-resistant cyathostomes of horse，Veterinary Record 120，293-296)。
根据本发明，来自小圆线虫种类的β-微管蛋白cDNA的核酸序列所具有的同一性大于95％。但是，上文提及的已知的绵羊寄生虫β-微管蛋白的序列的同一性仅为75.4-82.6％。
本发明的序列范围内的所产生的氨基酸序列非常相似。对于绵羊寄生虫的所产生的β-微管蛋白氨基酸序列也是这样。同一性在95到99.8％之间。仅有非常少的位置发生了氨基酸替换。在此着重强调的为密码子200，在该密码子中一个苯丙氨酸被酪氨酸替换。
但是，迄今为止来自发表的各种蠕虫种类的非编码β-微管蛋白序列均不表现出明显的同一性。因此而令人吃惊的是在此提出的申请中的各种小圆线虫种类的编码和非编码部分的序列具有很高的同一性。
因此，这些区域适合于区分不同种类的小圆线虫以及其它线虫种类。衍生自这些内含子区域的PCR引物可被用于在一个含有来自其它蠕虫生物体的遗传物质的样品中进行的对小圆线虫的特异性检测。
来自线虫或其部分的β-微管蛋白已知具有一种保护性的免疫能力(Bughio et al.(1993) Characterisation and Biologicalactivities of anti-Brugia pahangi tubulin monoclonalantibodies，International Journal for Paraitology，7，913-924)。由于单克隆抗体可被使用而针对该β-微管蛋白，由上文提及的DNA编码的小圆线虫的β-微管蛋白可被用作一种疫苗。
微管蛋白或其亚基的相互作用的抑制剂，如苯并咪唑、colchizine和紫杉醇是一系列针对人类、动物或植物疾病的治疗的引导结构(Leistrukturen)。微管蛋白用于寻找控制这些疾病的新活性化合物的能力延伸和强化了其作为这些化合物的靶位的重要性。
本发明还涉及到用于编码来自圆线科特别是cyathostominae亚科的线虫的β-微管蛋白的DNA或其片段。在该情况下该β-微管蛋白DNA可以为基因组DNA或cDNA。本发明涉及到的DNA序列可被认为是圆线虫目特别是cyathostominae亚科的寄生性线虫的微管蛋白基因科的新成员。本发明特别地涉及到编码来自盅口线虫属和环杯线虫属的寄生性线虫的β-微管蛋白的DNA序列。
本发明还涉及到一些DNA序列，这些DNA序列同编码SEQ IDNO.2、4、6、8或10所描述的氨基酸序列之一的多核苷酸具有高于85％的同一性。
本发明还涉及到一些优选的DNA序列，这些DNA序列同编码SEQID NO.2、4、6、8或10所描述的氨基酸序列之一的多核苷酸具有高于95％的同一性。
本发明特别涉及到编码β-微管蛋白的DNA序列，这些序列来自盅口线虫属和环杯线虫属的寄生性线虫，本发明特别涉及到来自细颈杯环线虫种的寄生性线虫的序列，在优选的情况下涉及到的DNA由SEQID NO.3、5、7、9、或11所描述或来自冠状盅口线虫(Cyathostonumcoronatum)，在优选情况下为SEQ ID NO.1的DNA。
本发明还涉及到上文描述的DNA，该DNA同这些DNA相比较在密码子200具有至少一个点突变如一个核苷酸替换。这些点突变导致由该DNA所编码的氨基酸序列中的变化，例如，氨基酸苯丙氨酸被酪氨酸替换，并且这些点突变正相关于具有适当的突变的微管蛋白对苯并咪唑的抗性。
本发明还涉及到一些DNA序列，这些序列同上文所描述的DNA或其片段相互补。这些DNA序列或片段含有的寡聚核苷酸来自上文描述的DNA序列之一或SEQ ID NO.1、3、5、7、9、或11所描述的序列，或来自同上述序列具有85％同一性的序列之一，在优选情况下为具有95％的同源性的序列，并且还来自同其互补并可以杂交的链。
本发明在此优选地涉及到一些寡聚核苷酸，这些寡聚核苷酸含有SEQ ID NO.12到SEQ ID NO.51所描述的序列之一或由其组成，这些序列同上述的DNA序列可杂交，在优选的情况下杂交在该β-微管蛋白基因的非编码序列部分的区域上进行。
本发明还在优选的情况下涉及到一些寡聚核苷酸，这些寡聚核苷酸含有SEQ ID NO.12到SEQ ID NO.51所描述的序列之一或由其组成，这些序列同上述序列的编码区杂交。
本发明还涉及到一些RNA序列，这些序列同上述的DNA序列或其片段互补的RNA序列，本发明还涉及到这些RNA序列的片段。这些RNA序列或片段所含有的核糖寡聚核苷酸衍生于上文所提及或SEQ IDNO.1、3、5、7、9、或11所描述的DNA序列，与上述序列具有85％同一性，在优选情况下为具有95％的同一性，并且衍生于与之互补的链，且可以同这些序列杂交。
本发明还涉及到一种含有上文所描述的DNA序列之一的表达结构体以及一种与其相连的DNA序列，该序列使得该DNA的表达成为可能。这些包括，例如，至少一个用于组成型或者诱导型表达的启动子或替代性的增强子。用于在大肠杆菌中表达的适当的启动子为天然杂合的或细菌噬菌体启动子，在优选的情况下为λ噬菌体、hsp、omp或合成启动子的群体，例如在WO 98/5625、DE 3 430 683或者EP 0173 149中作为例子所描述的启动子。
本发明还涉及到一些载体，这些载体含有一种上文所描述的DNA序列，并且这些载体使得本发明的β-微管蛋白或其片段在一种宿主细胞中的表达成为可能。
本发明还涉及到一些宿主细胞，这些宿主细胞含有上述的DNA、上述的表达结构体或者一种载体，并且该宿主细胞允许β-微管蛋白或其片段的表达。
本发明还涉及到一些多肽及其片段，这些多肽由上述的DNA序列或这些DNA序列的片段所编码。
本发明在这种情况下还优选地涉及到一些多肽，这些多肽由含有SEQ ID NO.1、3、5、7、9、或11的DNA序列、同这些序列具有85％同一性的序列所编码，优选情况下为95％的同一性，或由该DNA的片段所编码。
本发明还涉及到一些多肽及其片段，这些多肽由上述的DNA序列所编码，该DNA片段如上所述在密码子200处至少含有一个点突变，并且该多肽表现出对苯并咪唑的抗性。
本发明在这种情况下还特别优选地涉及到一些多肽或其片段，这些多肽含有在SEQ ID NO.2、4、6、8或10中所描述的氨基酸序列之一。
本发明在这种情况下涉及到一些多肽，特别涉及到纯化的多肽或重组方法制备的多肽。
本发明涉及到全长的多肽以及这些多肽的一些对应片段，例如特定的基序或结构域。这些片段可以长度各不同一并且含有，例如，5、10、25、50、100、150、200、250或300个氨基酸。
本发明还涉及到含有上述多肽的融合蛋白。该融合蛋白在该情况下可含有一种其它的不与β-微管蛋白相连的多肽组分(例如LexA、B42、谷胱甘肽S-转移酶、组氨酸标记、具有诸如碱性磷酸酶这样的酶活性的多肽或一种表位标记)。
本发明还涉及到一种制备方法，该制备方法用于在适当的原核或真核表达系统中制备上文所描述的多肽。该表达在这种情况下可如上文所述在各种情况所对应的细胞系或对应的宿主细胞中稳定或者瞬时进行。适当的原核表达系统为已知的宿主-载体系统，例如细菌(例如streptomyces spp.、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门菌、粘质沙雷菌，特别是大肠埃希氏杆菌)。
在优选的情况下，真核系统中的表达在杆状病毒系统中进行，特别是在可以引入翻译后修饰的系统中进行。
本发明还涉及到上文所述的DNA在对来自圆线科的线虫的DNA的检测中的应用，在优选的情况下该检测针对cyathostominae亚科，特别优选的情况下针对盅口线虫属和环杯线虫属，非常特别优选的情况下针对冠状盅口线虫种和细颈杯环线虫种。本发明在这种情况下涉及到如上文所述的寡核苷酸，这些寡核苷酸同编码β-微管蛋白的DNA或其互补链互补，并且该寡核苷酸可同该DNA杂交。在优选的情况下，这些寡核苷酸同内含子区域相杂交，即，同非编码DNA序列杂交。本发明涉及到这些寡核苷酸或其部分的使用，该寡核苷酸或其部分被用作a)Northern或Southern印迹分析中的样品b)诊断方法中的PCR引物，该方法用于检测上文提及的具有苯并咪唑抗性线虫，所涉及的线虫的DNA经具体的鉴定并在该引物和PCR技术的辅助下扩增。
本发明在该情况下优选地涉及到一些寡核苷酸，该寡核苷酸含有SEQ ID NO.12至51所描述的序列之一或由其组成。
本发明还涉及到上文所述的DNA在对来自圆线科的线虫的DNA的检测中的应用，在优选的情况下该检测针对cyathostominae亚科，特别优选的情况下针对盅口线虫属和环杯线虫属，非常特别优选的情况下针对细颈杯环线虫种和冠状盅口线虫种，该DNA编码对苯并咪唑具有抗性的β-微管蛋白或其片段。本发明在这种情况下涉及到如上文所述的寡核苷酸，这些寡核苷酸同编码具有苯并咪唑抗性的β-微管蛋白的DNA或其互补链互补，并且该寡核苷酸可同该DNA特异地杂交。
本发明涉及到这些寡核苷酸或其部分的使用，该寡核苷酸或其部分被用作a)Northern或Southern印迹分析中的样品
b)诊断方法中的PCR引物，该方法用于检测上文提及的具有苯并咪唑抗性的线虫，所涉及的线虫的DNA经具体的鉴定并在该引物和PCR技术的辅助下扩增。
本发明在该情况下优选地涉及到一些寡核苷酸，该寡核苷酸含有SEQ ID NO.12至51所描述的序列之一或由其组成。
本发明还涉及到一种方法，该方法用于对来自圆线科的线虫的DNA进行检测，在优选的情况下该检测针对cyathostominae亚科，特别优选的情况下针对盅口线虫属和环杯线虫属，非常特别优选的情况下针对细颈杯环线虫种和冠状盅口线虫种，其中的上文所描述的寡核苷酸同所述的生物体所产生的DNA序列特异性地杂交，并且该DNA序列可通过PCR技术的辅助而扩增。该杂交在优选的情况下在β-微管蛋白的非编码区域进行(内含子)。
上文所述的生物体的检测可通过以下方法进行a)产生一种寡聚核苷酸探针或引物，该探针或引物可同上述的编码β-微管蛋白的DNA或其互补链或与其5’或3’-侧生区域互补的链杂交，b)使该寡聚核苷酸探针或引物同一种通过适当方法制备的含有DNA的样本(DNA enthaltenden Probe)相接触，c)检测该寡聚核苷酸探针或引物的杂交(例如，通过聚合酶链反应的辅助)，d)对该β-微管蛋白的被检测序列进行测序，并且e)将该序列同本发明在上文所描述的DNA序列进行比较，在优选的情况下同在SEQ ID NO.1、3、5、7、9、或11中所描述的DNA序列进行比较。
本发明还涉及到一种方法，该方法用于对来自圆线科的线虫进行检测，在优选的情况下该检测针对cyathostominae亚科，特别优选的情况下针对盅口线虫属和环杯线虫属，非常特别优选的情况下针对细颈杯环线虫种和冠状盅口线虫种，这些线虫对苯并咪唑具有抗性，其中的上文所描述的寡核苷酸同所述的生物体所产生的DNA序列特异性地杂交，并且该DNA序列可通过PCR技术的辅助而扩增。该杂交在优选的情况下在β-微管蛋白的非编码区域进行(内含子)。
上文所述的生物体的检测可通过以下方法进行
a)产生一种寡聚核苷酸探针或引物，该探针或引物可同上述的编码β-微管蛋白的DNA或其互补链或与其5’或3’-侧生区域互补的链杂交，b)使该寡聚核苷酸探针或引物同一种通过适当方法制备的含有DNA的样本相接触，c)检测该寡聚核苷酸探针或引物的杂交(例如，通过聚合酶链反应的辅助)，d)对该β-微管蛋白的被检测序列进行测序，并且e)将该序列同本发明在上文所描述的DNA序列进行比较，在优选的情况下同在SEQ ID N0.1、3、5、7、9、或11中所描述的DNA序列进行比较，其在密码子200具有至少一个点突变该点突变导致了这些序列所编码的β-微管蛋白对苯并咪唑的抗性。
本发明还涉及到一种诊断测试试剂盒，该试剂盒用于对圆线科的线虫进行检测和鉴别，在优选的情况下该检测和鉴别针对cyathostominae亚科，特别优选的情况下针对盅口线虫属和环杯线虫属，非常特别优选的情况下针对细颈杯环线虫种和冠状盅口线虫种，除此之外该试剂盒还可提供上文所描述的寡核苷酸，这些寡核苷酸可在对所提及的种类进行检测的方法中使用。本发明还可产生一些寡聚核苷酸，这些寡聚核苷酸可同在SEQ ID NO.1、3、5、7、9、或11中所描述的DNA序列、同这些序列互补的序列、在密码子200具有至少一个突变的序列或这些序列的片段进行特异性杂交。在该情况下，含有SEQ ID NO.12至51所描述的序列或由其组成的寡聚核苷酸是别优选的。
本发明还涉及到一种诊断测试试剂盒，该试剂盒用于对圆线科的线虫进行检测，在优选的情况下该检测针对cyathostominae亚科，特别优选的情况下针对盅口线虫属和环杯线虫属，非常特别优选的情况下针对细颈杯环线虫种和冠状盅口线虫种，这些线虫对苯并咪唑具有抗性，除此之外该试剂盒还可提供上文所描述的寡核苷酸，这些寡核苷酸可在对所提及的种类进行检测的方法中使用。本发明还可产生一些寡聚核苷酸，这些寡聚核苷酸可同在SEQ ID NO.1、3、5、7、9、或11中所描述的DNA序列、同这些序列互补的序列、在密码子200处具有至少一个突变的序列或这些序列的片段进行特异性杂交。在该情况下，含有SEQ ID NO.12至51所描述的序列或由其组成的寡聚核苷酸是别优选的。
本发明还涉及到一种如上文所描述的试剂盒，其中向在该试剂盒中所产生的寡聚核苷酸提供一种可检测的标记。这样的可检测标记可特别地包括酶、酶的底物、辅酶、酶抑制剂、荧光标记、生色团、发光标记和放射性同位素。
本发明还涉及到一些抗体，这些抗体同β-微管蛋白的一个表位特异地反应，该β-微管蛋白来自圆线科的线虫，在优选的情况来自cyathostominae亚科的线虫，特别优选的情况下来自盅口线虫属和环杯线虫属，非常特别优选的情况下来自细颈杯环线虫种和冠状盅口线虫种。
本发明还涉及到一些单克隆抗体，这些抗体同β-微管蛋白的一个表位特异地反应，该β-微管蛋白来自圆线科的线虫，在优选的情况来自cyathostominae亚科的线虫，特别优选的情况下来自盅口线虫属和环杯线虫属，非常特别优选的情况下来自细颈杯环线虫种和冠状盅口线虫种。
本发明还涉及到上文所述的抗体作为杀线虫剂的使用。
本发明还涉及到上文提及的β-微管蛋白多肽或其片段的使用，这些多肽或片段来自圆线科的线虫，在优选的情况来自cyathostominae亚科的线虫，特别优选的情况下来自盅口线虫属和环杯线虫属，非常特别优选的情况下来自细颈杯环线虫种和冠状盅口线虫种，这些多肽或片段被用于制备一些疫苗，这些疫苗含有至少一种所述的β-微管蛋白多肽或其片段。该疫苗在这种情况下能够产生一种免疫反应，该反应对于上文所描述的某种β-微管蛋白多肽是特异的。
在一个优选的实施方案中，该疫苗含有一种抗原决定簇，例如，一种多肽的独立决定簇，该多肽含有在SEQ ID NO.2、4、6、8或12中所描述的一种氨基酸序列或者由上文提及的DNA或其片段所编码的一种氨基酸序列。
本发明还涉及到一种制备方法，该制备方法用于制备一种免疫原性组合物，该组合物用于对一种哺乳类动物进行免疫化，该免疫原性组合物由至少一种上文提及的本发明的β-微管蛋白多肽或其片段或者至少一种上文提及的抗体组成。
本发明还涉及到上文所述的载体的使用，该载体含有一种编码本发明的一种β-微管蛋白的核酸，在优选的情况下该载体含有由SEQ IDNO.1、3、5、7、9、或11中所描述的序列或其片段或与其同源的序列，该载体用于制备一种免疫原性组合物，该组合物用于对一种宿主进行给药以在该宿主中激活一种保护性免疫反应，该反应针对来自寄生性线虫的β-微管蛋白。
本发明还涉及到一种免疫原性组合物，该组合物含有一种载体(含有一种编码本发明的β-微管蛋白的核酸，在优选的情况下该载体含有由SEQ ID NO.1、3、5、7、9、或11中所描述的序列或其片段或与其同源的序列，以及一种启动子序列，该序列同所述的核苷酸序列功能性地连接并且控制本发明的β-微管蛋白的表达，该表达产生一种免疫反应)以及一种适用于药学目的赋形剂。
本发明还涉及到一种方法，该方法用于对调控微管蛋白之间的相互作用或微管蛋白的亚基之间的相互作用的物质进行鉴定。该方法基于微管蛋白的应用，在优选的情况下基于来自寄生性线虫的微管蛋白，特别优选的情况下基于来自圆线虫目的寄生性线虫的微管蛋白，非常特别优选的情况下基于来自圆线科的寄生性线虫的微管蛋白，最优选的情况基于来自cyathostominae亚科的寄生性线虫的微管蛋白。在该方法中使用的β-微管蛋白的一个特别优选的群体为来自盅口线虫属和环杯线虫属的寄生性线虫的微管蛋白。
本发明涉及到对一些物质的鉴定，例如对有机小分子的鉴定，这些有机小分子能够调节微管蛋白分子或其亚基之间的相互作用。在优选的情况下，本发明涉及到对该相互作用进行抑制的化合物的鉴别。
本发明还涉及到一种上文描述的方法，该方法基于a)将待测物质同该微管蛋白相接触，所选用的条件允许该微管蛋白分子相互之间的相互作用以及待测物质同微管蛋白的结合。
b)通过测定该微管蛋白分子之间的相互作用的能力而对所发生的结合进行检测，以及c)将在该测试物质存在的情况下该微管蛋白分子之间的相互作用的能力同不存在该测试物质的情况下进行比较。
本发明还涉及到一种方法，该方法用于对调控微管蛋白之间的相互作用能力的物质进行鉴定。在特别优选的情况下，本发明在此涉及到一种方法，该方法使用了上文描述的一种多肽，该多肽由上文所描述的DNA其片段所编码，特别由含有SEQ ID NO.1、3、5、7、9、或11中所描述的序列或由其组成的DNA所编码，以及由同上述序列具有85％的同一性的序列编码，在优选的情况下为具有95％的同一性的序列，并且这些序列所编码的β-微管蛋白具有在SEQ ID NO.2、4、6、8或10中所描述的一种氨基酸序列。
本发明还涉及到一种方法，该方法用于对调控上文所述的微管蛋白之间的相互作用能力的物质进行鉴定，所使用的方法基于在一种测试物质存在的情况下对微管蛋白的相互作用的调控的检测，该检测由基于细胞的检测系统辅助完成。这样的一种检测系统的一个优选的方案为“双杂交系统”(US 5 283 317，Zervos et al.(1993)Cell72，223-232；WO 94/10300)。该系统适用于通过引发可检测信号的相互作用对两种蛋白间的相互作用进行描述或提供证据支持。这样的系统还可适配成为一种具有高通量(throughput numbers)的测试系统。
本发明还涉及到一种方法，该方法用于对调控上文所述的微管蛋白之间的相互作用能力的物质进行鉴定，所使用的方法基于在一种测试物质存在的情况下对微管蛋白的相互作用的调控的检测，该检测由一种无细胞检测系统辅助完成。这样的一种检测系统的一个特别优选的实施方案为“闪烁近似分析”(SPA)(EP 015 473)。该测试系统基于对一种受体的相互作用的检测，受体的例子如具有配基的微管蛋白分子，该受体结合于微球体或小珠，该微球体或小珠具有一种闪烁分子。如果受体-配基复合体解离，可以检测到一种信号。
本发明还涉及到一些物质，这些物质迄今为止未被描述，这些物质在上文所描述的方法的辅助下进行鉴定，并且这些物质适于调节微管蛋白分子的相互作用，在优选的情况下抑制该相互作用。
本发明还涉及到一些物质的迄今为止未被描述的应用，这些物质使用上文所描述的一种方法进行鉴定，该应用用于制备一种制剂，该制剂用于对可能受到或已经受到线虫侵袭的动物体或人类进行预防性或治疗性处理。本发明的这些制剂含有至少一种通过上文所描述的方法进行鉴定的物质，并且这些制剂可通过鼻腔、皮肤、肠道外或肠道内进行给药。
为更好地理解，在诸如实施例或附上的权利要求这样的描述中所使用的特定用词或术语的意义在下文进行更详细的解释。
与蛋白质或DNA相关的术语“片段”描述的为在SEQ ID NO.1到11中所描述的核酸或氨基酸序列、同其互补的序列或同其85％同一，在优选的情况下为95％同一的序列的某些部分。该DNA和多肽序列的片段含有至少5个核苷酸或氨基酸，但可含有多至447个氨基酸或1343个核苷酸，或者在序列由SEQ ID NO.11描述的情况下可高达2565个核苷酸。
术语“同源性”、“同一性”或“相似性”涉及到两个肽或核酸分子间的序列相似性。同源性可通过将每个序列中的某一位置在各种情况下同另一序列进行比较而测定。如果在被比较序列中的一个位置被同一种碱基或氨基酸占据，那么这两种分子在该位置上是同源的。序列间的同源性的测量结果为这些序列共同具有的对应或同源位置数量的函数。“非同源”序列所具有的同一性低于40％，但在优选的情况下低于25％。
术语“同源”特别指长度为至少15个碱基对的DNA片段或同该DNA互补的链，这些DNA至少85％，在优选的情况下95％的核苷酸同对应的DNA一致。同源性特别可以在计算机方法的辅助下测定，如GCG方法(Devereux et al.(1983)，Nucleic Acids Res.12，387-395)。
在一个DNA片段可以同相关的DNA链或其互补片段杂交时也存在“同源性”。
术语“进行杂交”或“杂交”描述的是一种方法，在该方法中一条单链核酸分子同一条互补的DNA链进行碱基配对，单链核酸分子的能力取决于杂交条件的严格性。
术语“严格性”涉及到杂交条件。如果造成碱基配对困难则产生“高严格性”。如果对碱基配对进行辅助则产生“底严格性”。
术语“互补”涉及到嘌呤和嘧啶核苷酸之间通过氢键形成碱基对的能力。互补碱基特别为鸟嘌呤和胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶以及腺嘌呤和尿嘧啶。
本领域中的技术人员明了，由于兼并遗传密码子(即，对应于20种氨基酸的64种密码子)，众多的核苷酸碱基的“沉默”替换因此可被引入编码序列而不改变所编码的蛋白产物的同一性。这样的全部替换均被包含入本发明的范围内。
术语“特异性杂交”涉及到本发明中的一种核酸分子同上述的一种β-微管蛋白基因的6、12、20、30、50、100、150、200、300、350、400或440个连续的核苷酸进行杂交的能力，在优选的情况下该β-微管蛋白基因为SEQ ID NO.1、3、5、7、9、或11中所描述的序列或与其同源或互补的序列，即，通过该途径杂交的分子同细胞核酸相比(例如，mRNA或基因组DNA)多出10倍，在优选的情况下多出100倍，在特别优选的情况下多出100倍，该细胞核酸编码上文所述的β-微管蛋白以外的蛋白。
术语“质粒”涉及到一种染色体外的遗传元件。用于本发明的源质粒可以是通过商业购得、免费获取或者可来自于根据已知的方法获得的质粒。
术语“载体”描述的为一种DNA元件，该元件被用于向宿主细胞中引入外源DNA。载体含有一种核苷酸序列，该序列编码一种或多种多肽。能够控制其所含有的基因的表达的载体被称为“表达载体”。
术语“基因”在本发明的范围内涉及到一种核酸，该核酸含有一种开放读码框架，该框架编码上文所描述的一种β-微管蛋白多肽。此处还包括外显子和可能的内含子序列。
术语“进行相互作用”或“相互作用”描述的为分子间的相互作用。此处还包括术语“结合”在内。
术语“调节”涉及到对一种生化方法的刺激和压制或者抑制。在本发明的范围内，“调节”指的是对微管蛋白多肽或片段或其亚基之间的相互作用的抑制或压制，或者指对该相互作用的刺激，这些刺激和压制或者抑制可以表现在，例如，微管蛋白之间的一种不可逆的结合。
术语“核酸”涉及到一些多核苷酸，如脱氧核糖核苷酸(DNA)，或者如果适当还涉及到核糖核苷酸(RNA)。该术语还等价地包括RNA或者DNA的类似物，该类似物从核苷酸类似物制备，并且在相关的情况下还包括单链(“正义”或“反义”)以及双链多核苷酸。
术语“启动子”涉及到一些DNA序列，这些序列调节特异的某个DNA的表达，该DNA同该启动子功能地连接。该术语还涉及到“组织特异性”启动子，即，仅在特定的细胞(例如，一种特定的组织的细胞)中控制该特异基因的表达的启动子。“非组织特异性”启动子以及引导组成型表达的启动子或可诱导启动子也包括在内。
术语“蛋白质”、“多肽”或“肽”如果涉及到一种基因产物，则它们在本应用的范围内的使用中是可互换的。
“融合蛋白”为编码上文描述的一种β-微管蛋白多肽的第一种氨基酸序列同第二种氨基酸序列的融合物，该第二种蛋白同该微管蛋白序列不具备同一性或功能上的同源性。该第二种蛋白在此于第一种蛋白产自同一生物体，或者在替代情况下可产自另一种生物体(基因间)。融合蛋白通常可以公式X-微管蛋白-Y来表示，其中微管蛋白为上文所述的一种多肽，而X和Y为一种同微管蛋白氨基酸序列不相连的多肽。X或Y可以互相独立的缺少。
术语“细胞”或者“宿主细胞”可在本应用的范围内以同一的含义使用。根据理解这些术语不仅涉及到个体细胞而且涉及到这些细胞的后代。由于在后代中的特定的修饰(例如，突变)这样的后代可能与干细胞并不同一，但它们也包含于本发明内。
术语“内含子”描述的为被转录但随后通过“剪切”从该转录本中除去的所述DNA序列，该DNA在优选情况下为基因组DNA，其邻近序列(内含子)在剪切后被连接。
核酸如所描述，本发明的一个方面涉及到一些核酸序列，这些序列来自于圆线科的线虫，特别来自cyathostominae亚科的线虫，非常特别的情况下来自盅口线虫属和环杯线虫属，尤其是细颈杯环线虫种和冠状盅口线虫种，这些序列编码β-微管蛋白多肽或其片段，或者涉及到这些序列的同源核酸，这些同源核酸同SEQ ID NO.1、3、5、7、9或11中的序列具有85％的同源性，在优选的情况下具有95％的同源性，并且这些同源核酸编码在SEQ ID NO.2、4、6、8或10中所描述的氨基酸序列或其片段。SEQ ID NO.3为来自细颈杯环线虫种的编码β-微管蛋白的核酸序列的简并序列，其中“r”代表一种嘌呤(鸟嘌呤或腺嘌呤)，“y”代表一种嘧啶(胸腺嘧啶或尿嘧啶或胞嘧啶)，并且“w”代表一个腺嘌呤或胸腺嘧啶或一个尿嘧啶。SEQ ID NO.3由此而包括一批序列，这些序列可能存在于细颈杯环线虫种的生物体内。SEQ ID NO5、7、和11中所描述的序列表示的为3个限定的编码β-微管蛋白的序列，它们为SEQ ID NO.3所描述的序列的示例性和优选的实施方案。
同样本发明的部分为寡核苷酸，这些寡核苷酸根据情况编码β-微管蛋白多肽，这些多肽含有至少为2、5、10、25、50、100、150、200、250、300、350或400个氨基酸的长度。这样的寡核苷酸可被用作引物或者反义分子(即，用作非编码核酸)并且含有至少约6、12、24、30、60、100、120、150或210个碱基对，其中编码核苷酸含有约200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200或1300个碱基对。
本发明还描述了一些寡核苷酸，这些寡核苷酸在严格的条件下同SEQ ID NO.1、3、5、7、9或11中描述的序列之一的核酸进行特异性杂交。其对应的严格条件为，例如，6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，在约45℃下进行，随后在50℃下以2×SSC进行洗涤步骤，并且这些条件为本领域的技术人员所熟悉(例见，Current Protocol inMolecular biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6)。这样，在洗涤步骤中的盐浓度可经选择以使该严格性较低(2×SSC，50℃)或较高(0.2×SSC，50℃)。进一步，洗涤步骤中的温度可从用于低严格性的的条件(例如，约22℃)到高严格性的条件的范围内进行变化(例如，约65℃)。盐浓度和温度均可变动并彼此进行适配。
特别优选的寡核苷酸在SEQ ID NO.12-51中进行描述，这些寡核苷酸可用作引物或者用于在一种诸如基因组DNA这样的存在的DNA的鉴别和特征研究中的杂交。但是，其它寡核苷酸也可衍生自SEQ IDNO.1、3、5、7、9或11中描述的序列，这些寡核苷酸可随后被用作引物或杂交。在存在的(基因组)DNA的内含子区域进行杂交的寡核苷酸对于种属鉴定是特别优选的，对于这些种属可以指定一种存在的DNA。在SEQ ID NO.11中以细颈杯环线虫种为例描述了编码β-微管蛋白的基因组DNA的内含子，所述的β-微管蛋白可分离自上文提及的线虫。由此，这些内含子为定位于编码外显子之间的序列。在一个优选的实施方案中，所描述的引物和杂交探针含有一种标记基团，该基团使对该寡核苷酸的检测成为可能，即，例如，放射性同位素、荧光基团、酶或酶辅因子。
这样的寡核苷酸可被应用于诊断测试试剂盒以检测一种存在的DNA的来源(即，生物体)。由于其同SEQ ID NO.1、3、5、7、9或11所描述的DNA其片段、其同源序列以及互补序列能进行特异性杂交，这些寡核苷酸适于识别限定的序列。这样，这些寡核苷酸还使对编码β-微管蛋白的序列的识别和鉴定成为可能，这些序列由于在密码子200上的一个或多个点突变而导致了苯并咪唑抗性β-微管蛋白的表达。由此，这些来自SEQ ID NO.1、3、5、7、9或11寡核苷酸，在优选情况下SEQ ID NO.12到51所描述的实施方案，适用于对cyathostominae亚科的常见线虫种类的鉴别以及对存在的苯并咪唑抗性的识别。
本发明的寡核苷酸可使用标准方法进行制备，这些方法为领域的技术人员所熟悉，例如，通过DNA从头合成。
此处提及的核酸可以是部分纯化或以生物学纯的形式存在于完整细胞或者细胞裂解物中，即，如果其它细胞组分或化学前体和副产物在DNA为化学合成的情况下已经被分离出去。
编码β-微管蛋白的核酸如上文所述可从mRNA开始而获得，该mRNA存在于一批真核细胞中。从来自于相关的线虫细胞的基因组DNA开始来获得本发明的DNA也是可能的(见下文实施例)。编码β-微管蛋白的一种基因可以通过，例如，一个cDNA文库或者一个基因组DNA文库来获得。cDNA可通过分离一种细胞的总mRNA来获得，例如一种线虫细胞。从mRNA开始，双链的cDNA可随即被制备并且插入一个适当的质粒或适当的载体。本发明的DNA可通过在已知的多聚酶链反应(PCR)的辅助下进行扩增或在替代的情况下通过DNA从头合成来获得(又见J.Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning，2ndEdition，Chap.14)。
载体和质粒本发明还包括含有本发明的一种核酸序列的载体，该核酸序列同一种转录调控序列功能性地连接。“功能性地连接”意指该核酸序列同该调控序列的连接方式可以使该核酸序列所编码的蛋白的表达被控制。“转录调节序列”包括，例如，启动子、增强子以及其它控制元件。该表达载体含有，例如，一种编码本发明的β-微管蛋白或其片段的基因。这些载体可被用于整合入细胞，在其中随后形成了其对应的多肽或替代性的融合蛋白。适于在大肠杆菌中表达本发明的蛋白的启动子包括天然杂合或者细菌噬菌体启动子。在优选的情况下，它们为来自噬菌体λ启动子、omp启动子或合成的启动子(又见WO98/15625，DE 3 430 683，EP 0 173 149)。适当的启动子是可以购得的，例如pET系列(例如pET3a、pET23a、pET28a以及组氨酸标记或者具有组氨酸标记的pET32a)或者具有谷胱甘肽合成酶融合物的pGEX表达载体。这些表达载体可随即被转化入，例如，DE3-溶原性大肠杆菌菌株，如，BL21(DE3)、HMS174(DE3)或者AD494(DE3)。
该β-微管蛋白多肽的表达本发明还涉及到含有本发明的核酸序列(例如，被插入一个载体或者基因组的核酸)的细胞。这些宿主细胞可以是原核的或真核的细胞。
适当的原核表达载体为，例如，细菌系统，如streptomycesspp.、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门菌、粘质沙雷菌，在优选的情况下为大肠埃希氏杆菌。
一种优选的真核表达载体为杆状病毒载体，特别优选的为允许翻译后修饰的杆状病毒系统。
其它的真核表达(例如，酵母，昆虫细胞)也可使用。
多肽本发明还包括一些β-微管蛋白多肽，这些β-微管蛋白由本发明的DNA、其片段或上文所述的同源序列所编码，在优选的情况下为SEQ IDNO.1、3、5、7、9或11所描述的DNA序列。这些β-微管蛋白多肽的优选的实施方案在SEQ ID NO.2、4、6、8和10设定的序列中描述。在一个优选的实施方案中，所描述的多肽为纯化的多肽，该多肽中不含产生本发明的多肽的细胞中的蛋白污染。
所描述的多肽为全长的蛋白或其片段、基序或结构域，这些多肽含有至少5、10、25、50、75、100、125、150、200、250、300、350或400个氨基酸的长度。多肽片段可通过对多肽的测试而获得和选择，这些多肽由来自SEQ ID NO.1、3、5、7、9或11所描述的序列的核酸片段所编码。
这些多肽片段还可通过已知的方式进行化学合成。
本发明还包括一些多肽，这些多肽由SEQ ID NO.3所描述的简并序列所编码。由于在DNA序列的限定位置上的多种可能的碱基，在各种情况下产生了具有由所产生的密码子编码的一个氨基酸的多种多肽(various polypeptides result having an amino acid encodedby the codon resulting in each case)。由SEQ ID NO.3所描述的序列所编码的多肽在SEQ ID NO.4中描述，可编氨基酸被标记为“Xaa”。
这些多肽的优选的实施方案在SEQ ID NO.2、4、6、8或10中描述。
本发明还包括用于本发明的多肽的制备的所有方法。
本领域的技术人员已知本发明的多肽可通过多种方法获得，例如，通过诸如固相方法这样的化学方法。对于较大量的蛋白，建议使用重组方法。
用于充足的β-微管蛋白的制备的一些基础的步骤为1.一种天然的、合成的或者半合成的DNA的获得，该基因编码本发明的β-微管蛋白。
2.该DNA向一种表达载体的引入，该表达载体适用于表达本发明的原本形式或者作为融合蛋白的β-微管蛋白。
3.使用该载体对一种适当的宿主细胞的转化，在优选的情况下该宿主细胞为原核细胞。
4.该宿主细胞在适于本发明的β-微管蛋白表达的条件下的生长。
5.通过适当的已知方法进行的这些细胞的收集和β-微管蛋白的纯化例如，该表达载体可被转化入λDE3-溶源生长的大肠杆菌菌株，例如，BL21(DE3)、HM S174(DE3)或者AD494(DE3)。这些细胞在本领域的技术人员所熟悉的标准条件下进行生长后使用IPTG进行诱导。对细胞进行诱导之后，在18到37℃下进行3到24小时的温育。破碎这些细胞，通过层析方法纯化所表达的蛋白，在蛋白同组氨酸标记一起表达时通过在Ni-NTA柱上使用FPLC的方法纯化，还通过离子交换层析、凝胶过滤层析、超滤、电泳或替代的免疫亲和纯化方法进行纯化，该免疫亲和纯化方法对本发明的多肽是特异的。
本发明的类似物或片段可通过突变或删除来产生，例如，通过定向(点)突变。
本发明的多肽也可经化学修饰，例如，以糖基集团、脂、磷酸、乙酰基团或者类似基团进行修饰。共价衍生物可通过将修饰基团同该多肽的氨基酸侧链或者N末端或者C末端的功能基团进行连接。
在本发明的多肽的表达中，改变特定的密码子以进行最佳的表达是有利的。这种情况在特定密码子(密码子偏倚性)在异源表达系统中的使用不同于本发明的生物体的情况下是存在的。进一步，5’或3’非编码区域的删除是可能的，例如，在该cDNA的3’区域中存在几个稳定化序列基序(例如，ATTTA)的情况下。
融合蛋白本发明的多肽还可以一种融合蛋白的形式存在。在需要获得β-微管蛋白的免疫原性片段时可以使用这些蛋白(例见，EP 0 259 149；Schlienger et al.(1992)J.Virol.66，2)。在特定的情况下，融合蛋白辅助多肽的表达。例如，本发明的多肽可制备成为谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白。这样的GST融合蛋白辅助进行该多肽的方便纯化(例见，Current Protocols of Molecular Biology，eds.Aussubelet al.(John Wiley & Sons，N.Y.1991))。融合蛋白可以含有，例如，一种被用于纯化的“引导”序列，例如，允许该蛋白的N末端(或者C-末端)的一种多聚-组氨酸序列，该蛋白的纯化[空白]通过在Ni2+NTA柱进行的层析来完成(例见，Hachuli et al.(1987)J.Chromatography 411，177)。
用于制备这样的融合蛋白的工艺为本领域的技术人员所熟悉。
抗体本发明的另一个方面涉及到一些抗体，这些抗体同本发明的β-微管蛋白多肽特异性地结合。
例如，抗蛋白或者抗肽血清或者单克隆抗体可根据标准方案通过使用免疫原来进行制备，这些免疫原来自本发明的β-微管蛋白多肽(例见，AntibodiesA.Laboratory Manual ed.by Harlow andLane(Cold Spring Harbor Press，1988))。
诸如小鼠、仓鼠或兔这样的哺乳动物可使用本发明的多肽的一种免疫原形式或免疫源片段进行免疫化，例如，使用一种能够产生抗体反应的多肽进行(又见上文的“融合蛋白”)。适当的工艺为本领域的技术人员所熟悉。这样，β-微管蛋白的一种免疫原片段可在佐剂的存在下进行给药。可通过检查血浆或血清中的抗体滴度来观察免疫化的方法，例如，通过ELISA分析或其它免疫分析。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体对于本发明的β-微管蛋白多肽的免疫决定簇是免疫特异的，该微管蛋白多肽的例子如SEQ IDNO.2、4、6、8或10所描述的多肽或者由SEQ ID NO.1、3、5、7、9或11所描述的DNA所编码的多肽，或者与上述多肽具有85％的同一性的序列，在优选的情况下该序列与上述多肽具有95％的同一性。
在哺乳动物的免疫化之后，可从血清中分离出多克隆的抗β-微管蛋白抗体。为获得单克隆抗体，产生抗体的细胞(淋巴细胞)可获自一种免疫化的动物并且根据已知方法将该细胞同诸如骨髓瘤细胞这样的永生细胞进行融合以获得杂交瘤细胞(例见，Khler and Milstein(1975)Nature 256.495-497；Kozbar et al.(1983)Immunology Today4，72；Cole et al.(1985)Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.pp.77-96)。
在此提及的“抗体”应当还包括同本发明的β-微管蛋白特异地反应的抗体片段。可使用传统的工艺将抗体破碎成片段并对该片段进行检测。
一个优选的实施方案涉及到诸如上文所述这样的抗体，这些抗体携带一种可检测标记(例如，放射性同位素、荧光基团、酶或酶辅因子)。
同本发明的β-微管蛋白特异地结合的抗体还可被用于组织样本的免疫组化染色以检测某种具体的β-微管蛋白的表达。该抗β-微管蛋白抗体还可用于诊断目的，例如，用于免疫沉淀或免疫染色。
诊断测试方法本发明还可提供可被用于诊断目的的核酸分子。
这些分子包括的核酸分子如，SEQ ID NO.1、3、5、7、9或11所描述的DNA序列的片段或同其互补的DNA序列。例如，在SEQ ID NO.12到51中描述的寡核苷酸已经可以获得，这些寡核苷酸能够同编码β-微管蛋白的有义或者反义序列以及内含子部分进行杂交，该内含子序列以SEQ ID NO.11为例进行描述。
在该方法中，细胞的核酸分子经处理以使其可被接近以进行杂交，该DNA探针同该寡核苷酸进行接触并且使用该寡核苷酸对该样品的杂交进行检测。
一种方法以该方式被提供，该方法使得区分不同种类的小圆线虫和以及或其它线虫种类成为可能，该区分通过本发明的寡核苷酸同一种DNA探针的特异性杂交来进行，在优选的情况下以同编码β-微管蛋白的DNA的内含子区域进行杂交的寡核苷酸进行辅助。在一个特别优选的实施方案中，本发明的寡核苷酸允许对在小(Cyathostaminae)中的抗性进行鉴别，特别是细颈杯环线虫种、冠状盅口线虫种和碗状盅口线虫种的抗性。在该方法中，可以利用的一个事实是β-微管蛋白的的抗性形式在本发明的编码DNA中携带有至少一个突变，该突变可如所描述通过PCR的方法进行检测，例如，以同Elard et al.(1998)在小型反刍动物寄生虫Teladorsagia circumcincta的天然种群中对天然苯并咪唑敏感或抗性的诊断，Veterinary Parasitology 80，231-237中类似的方式进行。
所描述的方法特别有助于在感染有线虫的人类或动物中对可能的治疗策略进行评估，例如，马、绵羊、猪、山羊、骆驼、野牛、驴、野兔、狍、有毛动物、鸟类(例如，小鸡、火鸡、鸭)、淡水和成水鱼(鳟鱼、鲤鱼)。这使得对寄生性线虫的鉴定和区分以及对其抗性群体的识别成为可能，并且避免了以无活力的杀线虫剂进行的处理。
在此描述的方法可以以诸如预制诊断测试试剂盒这样的形式提供，该试剂盒含有至少一种上文提及的核酸分子或者如上文所述的抗体，这些抗体或核酸分子被制备成即用形式。
用于发现线虫杀灭物质的方法本发明涉及到一种方法，在该方法中通过微管蛋白或其片段的辅助而鉴定了新的特异的驱肠虫物质。
在一个优选的实施方案中，本发明的β-微管蛋白被用于该方法。但是，该方法还可使用来自此处所提及的种类之外的微管蛋白。使用来自本发明的β-微管蛋白之外的β-微管蛋白多肽的方法也全部包含在本发明内。在特别优选的情况下在SEQ ID NO.2、4、6、8或10中描述的β-微管蛋白多肽被用于所提及的方法。在本发明中，来自常见的线虫的重组β-微管蛋白多肽可额外地获得。这些多肽可被用于各种用于鉴定微管蛋白或微管蛋白亚基相互作用的新抑制剂的测试系统。
无细胞测试系统许多以化合物或天然抽提物的测试为目的的测试系统着眼于高通量以在给定的期间内使被检测的物质的数量达到最大。基于无细胞研究的测试系统使用纯化或半纯化的蛋白。它们适于一种“初级(first)”测试，该测试原始目的在于检测一种物质对靶蛋白的可能的影响。
诸如细胞毒作用这样的影响为这种体外系统所忽略。该测试系统在这种情况下检测这一物质的抑制(inhibierende)和抑制(suppressive)作用以及刺激作用。一种物质的效率可通过浓度决定的测试系列来检验。无测试物质的参照群组可被用于估测该作用。
一种用于对调控微管蛋白或其亚基的相互作用的物质进行检测的可能性为“闪烁近似分析”(SPA)，见EP 015 473。这一测试系统利用一种受体(例如，微管蛋白)同一种放射性标记的配基(例如，一种小有机分子或第二种放射性标记的蛋白分子)之间的相互作用。该受体在这一情况下同小球(微球体)或小珠结合，该小球或小珠被提供以闪烁分子。在放射性衰变期间，在微球体中的闪烁物质被放射性标记的亚原子粒子激发并且发射出可检测的光子。该测试条件经最优化以使发射自配基的这样的粒子引发一种信号，该信号从同受体或者微管蛋白结合的配基中发射。
在一个可能的实施方案中，微管蛋白同相作用的或与其结合的测试物质一起或单独同微珠相接合。在此可使用α-或β-微管蛋白亚基。放射性标记的配基可以是，例如，被标记的苯并咪唑或一种进一步的标记的β-微管蛋白。在该配基同该固定化微管蛋白相结合的情况下，该配基必须抑制或者消除固定化的和游离的微管蛋白之间的存在的相互作用以在接触区域结合该配基本身。已经发生的同固定化的微管蛋白的结合可随后通过一次光闪烁来检测。相应地，存在的固定化和游离的标记微管蛋白之间的复合体被测试物质的结合所破坏，这导致了检测到的闪光强度的降低。该测试系统随即对应于一种互补的抑制系统。
基于细胞的测试系统可通过本发明的方法获得的β-微管蛋白以及来自其它种类的微管蛋白可以开发一种测试系统，该测试系统以细胞为基础用于鉴定抑制微管蛋白相互作用的物质。
该系统的一个例子为“双杂交系统”。该系统的一个具体例子为“作用陷阱(interaction trap)”。这是在酵母中进行的对相互作用的蛋白的遗传选择(例见，Gyuris et al.(1993)Cdi 1，一种同Cdk2相联系的人类G1和S期蛋白磷酸酶(Cdi 1，a human G1 and Sphase protein phosphatase that associates with Cdk 2.)Cell75，791-803)。该测试系统经设计用于检测和描述两种蛋白之间的相互作用，这是由于所发生的相互作用导致了一种可检测的信号。
这样的一种系统可适配于在给定期间内对大量测试物质的测试。
该系统基于两种载体的构建，“诱饵”载体以及“捕获”载体。编码微管蛋白的一种基因被克隆入该“诱饵”载体并表达成为同LexA蛋白的融合蛋白，在优选的情况下该基因为编码本发明的一种β-微管蛋白的基因。第二种基因编码微管蛋白被克隆入该“捕获”载体并表达成为同B42-捕获蛋白的融合蛋白，在优选的情况下该基因为编码本发明的一种β-微管蛋白的基因。这两种载体均存在于酿酒酵母宿主中，该宿主在一个lacZ或HIS3报告基因的5’-侧含有多个拷贝的结合LexA的DNA。如果在两种微管蛋白(融合)蛋白之间发生了相互作用，该报告基因的转录将被激活。如果存在一种导致对微管蛋白的相互作用的抑制或干扰的测试物质，这两种微管蛋白(融合)蛋白将不再能够相互作用并且该报告基因的产物将不会被制备。
在微管蛋白以及上述的制备方法的辅助之下，特别是在本发明β-微管蛋白或其片段的辅助之下，对新的和特异的抗寄生虫化合物的鉴定成为可能。
在上述的方法和多肽的辅助之下发现的化合物对于受到人类或者农业牲畜、宠物、动物园动物以及实验室和实验动物的病原性内生寄生虫感染的人类或者动物的治疗是有价值的。
这些化合物具有抗所有发育时期的普通、敏感株以及抗性株的活性。通过以含有一种或多种这样的化合物的试剂进行的治疗，对于牲畜造成的经济损失以及在人类和动物中的疾病均可被避免或进行治疗。在特定的目标下，下列寄生虫为所发现的活性化合物的目标Enoplida，例如，Trichuris spp.、Capillaria spp.、Trichomosoides spp.、trichinella spp.
小杆线虫属，例如，Micronema spp.、strongyloides spp.
Strongylida，例如，Strongylus spp.、Triodontophorus spp.、Oesophagodontus spp.、Trichonema spp.、Gyalocephalus spp.、Cylindropharynx spp.、Poteriostomum spp.、Cyclococercusspp.、Cylicostephanus spp.、Oesophagostomum spp.、Chabertiaspp.、Stephanurus spp.、Ancylostoma spp.、Uncinaria spp.、Bunostomum spp.、Globocephalus spp.、Syngamus spp.、Cyathostomum spp.、Cylicocyclus spp.、Neostrongylus spp.、Cystocaulus spp.、Pneumostrongylus spp.、Spicocaulus spp.、Elaphostrongylus spp.、Parelaphostrongylus spp.、Crenosomaspp.、Paracrenosoma spp.、Angiostrongylus spp.、Aelurostrongylus spp.、Filaroides spp.、Parafilaroides spp.、Trichostrongykus spp.、Haemonchus spp.、Ostertagia spp.、Marshallagia spp.、Cooperia spp.、Nematodirus spp.、Hyostrongylus spp.、Obeliscoides spp.、Amidostomum spp.、Olludanus spp.
Oxyurida，例如，Oxyuris spp.、Enterobius spp.、Passalurusspp.、Syphacia spp.、Aspiculuris spp.、Heterakis spp.
禽蛔虫属，例如，Ascaris spp.、Toxascaris spp.、Toxocaraspp.、Parascaris spp.、Anisakis spp.、Ascaridia spp.
Spirurida，例如，Gnathostoma spp.、Physaloptera spp.、Thelazia spp.、Gongylanema spp.、Habronema spp.、Parabronemaspp.、Draschis spp.、Dracunculus spp.
Filariida，例如，Stephanofilaria spp.、Parafilaria spp.、Setaria spp.、Loa spp.、Dirofilaria spp.、Litomosoides spp.、Brugia spp.、Wuchereria spp.、Onchocerca spp.
Giganotorhynchida，例如，Filicollis spp.、Moniliformisspp.、Macracanthorhynchus spp.、Prosthenorchis spp.
Mastigophora(鞭毛虫)Trypanosomatidae，例如，Trypanosoma b.brucei、T.b.gambiense、T.b.rhodesiense、刚果锥虫(T.congolense)、克[鲁斯]氏锥虫(T.cruzi)、伊氏锥虫(T.evansi)、马锥虫(T.equinum)、路[易士]氏锥虫(T.lewisi)、T.percae、猿锥虫(T.simiae)、活动锥虫(T.vivax)、巴西利什曼原虫(Leishmania brasiliensis)、杜氏利什曼原虫(L.donovani)、热带利什曼原虫(L.tropica)Trichomonadidae，例如，肠兰伯鞭毛虫(Giardia lambilia)、犬贾第虫(G.canis)Sarcomastigophora(Rhizopoda)，例如，溶组织内阿米巴Hartmanellidae，例如，Acanthamoeba sp.、Hartmanella spp.
Apicomplexa(Sporozoa)，例如，堆形艾美球虫、E.adenoides、E.alabahmensis、鸭艾美球虫、鹅艾美球虫、阿[洛尼]氏艾美球虫、E.ashata、奥博伦艾美球虫、牛艾美球虫、布氏艾美球虫、加拿大艾美球虫、E.chinchillae、E.clupearum、鸽艾美球虫、E.contorta、槌状艾美球虫、狄氏艾美球虫、分散艾美球虫、E.ellipsoidales、镰形艾美球虫、福氏艾美球虫、唇艾美球虫、兰氏艾美球虫、大型艾美球虫、巨型艾美球虫、中等艾美球虫、珠鸡艾美球虫、和缓艾美球虫、毒害艾美球虫、尼柯雅艾美球虫、E.ovis、小型艾美球虫、孔雀艾美球虫、有孔艾美球虫、法思艾美球虫、梨形艾美球虫、早熟艾美球虫、E.residua、粗糙艾美球虫、E.sepc.、E.stiedai、猪艾美球虫、柔嫩艾美球虫、树艾美球虫、特鲁特艾美球虫、朱氏艾美球虫、Globidium spec.、贝氏等孢子球虫、犬等孢子球虫、猫等孢子球虫、俄亥俄等孢子球虫、里沃特等孢子球虫、I.suis、Neospora canium、Cystisospora spec.、Cryptosporidiumspec.
Toxoplasmadidae，例如，鼠弓形虫Sarcocystidae，例如，Sarcocystis bovicanis、S.bovihominis、S.neuvona、羊肉孢子虫、S.ovifelis、S.spec.、猪人肉孢子虫Leucozoide，例如，Leucozytozoon simondiPlasmodiias，例如，伯格氏鼠疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、间日疟原虫、P.specPiroplasmea，例如，阿根廷巴贝虫、牛巴贝虫、犬巴贝虫、B.spec、小泰勒虫、T.specAdeleina，例如，犬肝簇虫、H.spec以下的具有进一步的重要性Myxospora和Microspora，例如，Glugea spec.和Nosemaspec.、卡氏肺囊虫，Ciliophora(Ciliata)，例如，结肠小袋纤毛虫、Ichthiophthirius spec.、Trichondina spec.或Epistylisspec.
所发现的化合物和试剂还可有效地抵抗昆虫的原生动物，例如Microsporidia株系，特别是微粒子虫目，非常特别的情况下为蜜蜂微粒子虫种，该种为蜜蜂的寄生虫。
实施例实施例1β-微管蛋白cDNA和基因组DNA的获得在Quick PrepMicro mRNA试剂盒(Pharmacia Biotech，Freiburg，Germany)的辅助下从细颈杯环线虫中，使用DynalmRNADirect试剂盒(Dynal，Hamburg，Germany)从冠状盅口线虫和碗状盅口线虫中获得mRNA。这些蠕虫分离自马的大肠并通过显微镜根据其头尾的特征结构进行区分(见R.S.Lichtenfeld(1975)，Helminths of domestic equids.Proceedings of theHelminthological Society，Washingtong，42(Special Issue)，1-92)。
对于来自细颈杯环线虫的mRNA，该cDNA的合成在“反转录系统的”(Promega，Madison，USA)辅助之下进行，而对于来自冠状盅口线虫和碗状盅口线虫的mRNA，该cDNA的合成使用superscriptRTII反转录酶(Gibco BRL Life Technologies)来进行。在所提及的情况下使用具有15个碱基对长度的寡核苷酸。在42℃下温育1小时。
基因组DNA使用QIA Amp-tissue试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)从4-40只成体蠕虫中获得。在该方法中，以蛋白酶K对这些蠕虫在55℃下消化2小时并且使用“旋柱(spin columns)”抽提基因组DNA。
实施例2β-微管蛋白序列的扩增全长的β-微管蛋白序列或其片段的扩增的进行可使用，例如，AmpliTap GoldTM聚合酶(Perkin Elmer，Foster City，California，USA)。
SEQ ID NO.1、3、5、7、9或11所描述的序列β-微管蛋白序列的扩增可在SEQ ID NO.1 2-51所描述的引物的辅助下进行。
对于来自冠状盅口线虫的cDNA的扩增，诸如SEQ ID NO.43和44所描述的序列这样的序列是适合的，对于来自碗状盅口线虫的cDNA的扩增，诸如SEQ ID NO.40和42所描述的序列这样的序列是特别适合的。
细颈杯环线虫的cDNA以及本发明的各个种类的基因组DNA的扩增在50μl的总体积内进行，其中含有5μl的10×缓冲液、2.5μl的MgCl2(25mM)、2μl的dNTP混合物(2mM的各种NTP)、1μl的各种特异引物(SEQ ID NO.12-47)(50p mol/μl)、0.5μl(2.5U)的聚合酶以及1-5μl的DNA模板。当使用简并引物时(SEQ ID NO.48-51)使用1μl的浓度为500pmol/μl的各种引物。对于简并引物在46℃下进行退火，对于特异性引物该温度根据所计算出的熔点而变化。PCR循环经选择如下95℃下进行10分钟，随后进行35-40个循环以及一个在72℃下10分钟的最终步骤，每次循环包括在94℃下变性1分钟、退火1分钟、72℃下1分钟。在从冠状盅口线虫和碗状盅口线虫进行的cDNA扩增中进行一种“触减(touchdown)”PCR温度方法，该方法具有以下特征首先进行15个循环，其中每个循环包括94℃下30秒、随后的在60℃下1分钟和72℃下1分钟，随后进行15个循环，其中每个循环包括95℃下30秒、55℃下1分钟和72℃下1分钟，最后进行10个循环，其中每个循环包括94℃下30秒、45℃下1分钟和72℃下1分钟。对于大片段(＞1000个碱基对)的克隆，72下的延伸阶段被延长至2.30分钟。
实施例3
来自细颈杯环线虫、冠状盅口线虫和碗状盅口线虫的cDNA或者基因组DNA扩增的PCR产物在“Original TA Cloning Kit”(Invitrogen，Leek，Netherlands)的辅助下进行克隆，即在“Original TA Cloning”载体中克隆。
序列表<110>Bayer AG<120>编码β-微管蛋白的DNA及其应用<130>Le A 33 759<140><141><160>51<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1380<212>DNA<213>冠状盅口线虫(Cyathostomum coronatum)<220><221>CDS<222>(1)..(1344)<400>1atg cgt gag atc gtg cat gta caa gct gga caa tgt gga aac caa att 48Met Arg Glu Ile Val His Val Gln Ala Gly Gln Cys Gly Asn Gln Ile1 5 10 15ggt tcc aag ttt tgg gaa gtg atc tct gac gag cat ggc att aag ccc 96Gly Ser Lys Phe Trp Glu Val Ile Ser Asp Glu His Gly Ile Lys Pro20 25 30gat ggc aca tac cac gga gaa tct gat cta caa tta gaa cga atc aat 144Asp Gly Thr Tyr His Gly Glu Ser Asp Leu Gln Leu Glu Arg Ile Asn35 40 45gtg tac tat aat gaa gca cat gga ggc aaa tat gtc cca cgt gca gtt192Val Tyr Tyr Asn Glu Ala His Gly Gly Lys Tyr Val Pro Arg Ala Val50 55 60ctt gtt gat ctc gag ccc gga act atg gat tcc gtc cgt tcc ggg cca240Leu Val Asp Leu Glu Pro Gly Thr Met Asp Ser Val Arg Ser Gly Pro65 70 75 80tac ggg caa ttg ttc cgc cct gat aac tac gtg ttt gga cag tct ggc288Tyr Gly Gln Leu Phe Arg Pro Asp Asn Tyr Val Phe Gly Gln Ser 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权利要求
1.一种DNA，该DNA编码来自Cyathostominae的β-微管蛋白或其片段。
2.权利要求1的一种DNA，这种DNA包括a)一种多核苷酸，该多核苷酸同编码SEQ ID NO.2所描述的一种氨基酸序列的多核苷酸具有至少85％的同一性；b)一种多核苷酸，该多核苷酸同编码SEQ ID NO.4所描述的一种氨基酸序列的多核苷酸具有至少85％的同一性；c)一种多核苷酸，该多核苷酸同编码SEQ ID NO.6所描述的一种氨基酸序列的多核苷酸具有至少85％的同一性；d)一种多核苷酸，该多核苷酸同编码SEQ ID NO.8所描述的一种氨基酸序列的多核苷酸具有至少85％的同一性；e)一种多核苷酸，该多核苷酸同编码SEQ ID NO.10所描述的一种氨基酸序列的多核苷酸具有至少85％的同一性；
3.权利要求1的一种DNA，这种DNA包括a)一种多核苷酸，该多核苷酸同编码SEQ ID NO.2所描述的一种氨基酸序列的多核苷酸具有至少95％的同一性；b)一种多核苷酸，该多核苷酸同编码SEQ ID NO.4所描述的一种氨基酸序列的多核苷酸具有至少95％的同一性；c)一种多核苷酸，该多核苷酸同编码SEQ ID NO.6所描述的一种氨基酸序列的多核苷酸具有至少95％的同一性；d)一种多核苷酸，该多核苷酸同编码SEQ ID NO.8所描述的一种氨基酸序列的多核苷酸具有至少95％的同一性；e)一种多核苷酸，该多核苷酸同编码SEQ ID NO.10所描述的一种氨基酸序列的多核苷酸具有至少95％的同一性；
4.权利要求1到3其中之一所要求的一种DNA，该DNA含有SEQID NO.1中所描述的一种片段。
5.权利要求1到3其中之一所要求的一种DNA，该DNA含有SEQID NO.3中所描述的一种片段。
6.权利要求1到3其中之一所要求的一种DNA，该DNA含有SEQID NO.5中所描述的一种片段。
7.权利要求1到3其中之一所要求的一种DNA，该DNA含有SEQID NO.7中所描述的一种片段。
8.权利要求1到3其中之一所要求的一种DNA，该DNA含有SEQID NO.9中所描述的一种片段。
9.权利要求1到3其中之一所要求的一种DNA，该DNA含有SEQID NO.11中所描述的一种片段。
10.权利要求1到3以及5到9其中之一所要求的一种DNA，其特征在于该DNA来自杯环线虫属。
11.权利要求1到4其中之一所要求的一种DNA，其特征在于该DNA来自盅口线虫属。
12.权利要求1到3以及5到10其中之一所要求的一种DNA，其特征在于该DNA来自细颈杯环线虫。
13.权利要求1到4以及11其中之一所要求的一种DNA，其特征在于该DNA来自冠状盅口线虫。
14.权利要求1到13其中之一所要求的一种DNA，其特征在于该DNA在密码子200含有至少一个碱基替换，该替换导致一种具有驱肠虫药抗性的多肽的表达。
15.一种DNA或其片段，其特征在于该DNA同权利要求1到14其中之一所要求的DNA互补。
16.一种RNA，其特征在于该RNA同权利要求1到14其中之一所要求的DNA或其片段互补。
17.一种表达结构体，其特征在于该结构体含有权利要求1到14其中之一所要求的DNA以及一种同其功能性连接的序列，该序列使得该DNA的表达成为可能。
18.一种载体，其特征在于该载体含有权利要求1到14其中之一所要求的DNA。
19.一种宿主细胞，该细胞含有权利要求1到14其中之一所要求的DNA、权利要求17所要求的一种表达结构体或者权利要求18所要求的一种载体。
20.一种多肽，该多肽由权利要求1到14其中之一所要求的一种DNA或其片段所编码。
21.权利要求20中的一种多肽，该多肽含有SEQ ID NO.2中所描述的一种氨基酸序列或由其组成。
22.权利要求20中的一种多肽，该多肽含有SEQ ID NO.4中所描述的一种氨基酸序列或由其组成。
23.权利要求20中的一种多肽，该多肽含有SEQ ID NO.6中所描述的一种氨基酸序列或由其组成。
24.权利要求20中的一种多肽，该多肽含有SEQ ID NO.8中所描述的一种氨基酸序列或由其组成。
25.权利要求20中的一种多肽，该多肽含有SEQ ID NO.10中所描述的一种氨基酸序列或由其组成。
26.一种多肽，该多肽由权利要求14的DNA所编码。
27.一种制备方法，该方法用于制备权利要求20到26其中之一所要求的一种多肽，该方法包括该多肽或其片段在一种原核或真核表达系统中的表达。
28.DNA寡核苷酸的应用，该寡核苷酸同权利要求1到15其中之一所要求的DNA特异性地杂交以检测来自Cyathostominae的DNA，在优选的情况下该寡核苷酸同非编码的DNA部分杂交。
29.DNA的应用，该DNA同权利要求1到15其中之一所要求的DNA特异性地杂交以检测来自Cyathostominae并且编码权利要求26的一种多肽的的DNA。
30.一种用于检测Cyathostominae的方法，其特征在于权利要求28中所描述的DNA同权利要求1到15其中之一所要求的DNA杂交并且该DNA通过PCR的方法进行扩增。
31.一种用于检测具有驱肠虫药抗性的Cyathostominae的方法，其特征在于权利要求29中所描述的DNA同权利要求1到15其中之一所要求的DNA杂交并且该DNA通过PCR的方法进行扩增。
32.一种DNA寡核苷酸，该寡核苷酸含有SEQ ID NO.12到SEQ IDNO.51所描述的序列之一或者一种衍生自权利要求1到15的DNA序列的序列。
33.一种诊断试剂盒，该试剂盒含有至少一种权利要求32所要求的寡核苷酸和/或权利要求35或36所要求的抗体。
34.权利要求33中所要求的一种诊断试剂盒，其特征在于该DNA寡核苷酸被提供以一种可检测的标记。
35.一种抗体，其特征在于该抗体同权利要求20到26中所要求的多肽的一种表位特异性地反应。
36.权利要求35所要求的一种抗体，其特征在于该抗体为单克隆抗体。
37.权利要求35或36中所要求的抗体作为线虫杀灭剂的应用。
38.权利要求20到26之一所要求的多肽在疫苗生产中的应用。
39.一种方法，该方法用于鉴定调控微管蛋白的相互作用的物质。
40.权利要求39所要求的方法，其特征在于a)将待测物质同该微管蛋白相接触，该接触的条件允许该微管蛋白分子相互之间的相互作用以及该待测物质同微管蛋白的结合，b)通过测定该微管蛋白-蛋白分子之间的相互作用的能力而对所发生的待测物质的结合进行检测，以及c)将在该测试物质存在的情况下该微管蛋白-蛋白分子之间的相互作用的能力同不存在该测试物质的情况下进行比较。
41.权利要求39或40所要求的方法，其特征在于所使用的微管蛋白为权利要求20到26之一所要求的多肽。
42.权利要求39到41之一所要求的方法，其特征在于使用一种基于细胞的测试系统以在测试物质存在下检测该微管蛋白相互作用的调节。
43.权利要求39到41之一所要求的方法，其特征在于使用一种无细胞的测试系统以在测试物质存在下检测该微管蛋白相互作用的调节。
44.一种物质，该物质在权利要求39到43之一所要求的一种方法中被鉴定。
45.在权利要求44中要求的物质的在生产一种药剂中的使用，该药剂用于对线虫侵袭的预防性或治疗性处理。
全文摘要
本发明涉及到编码β－微管蛋白的DNA,该微管蛋白来自圆线科的线虫,还涉及到该DNA所编码的多肽,该DNA在对涉及到的线虫对驱肠虫药物的抗性进行诊断中的应用、在对这些线虫的种类进行鉴别中的应用、β－微管蛋白作为一种疫苗的一个组分的应用,以及一种用于对新的线虫或抗生素化合物进行鉴别的方法。
文档编号C12N1/19GK1382216SQ00810121
公开日2002年11月27日 申请日期2000年6月30日 优先权日1999年7月9日
发明者G·冯萨姆森－希梅尔斯特杰纳, A·哈德, T·施尼德, M·帕佩 申请人:拜尔公司