专利名称：一株杀鞘翅目害虫的苏云金芽孢杆菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及芽孢杆菌，更具体涉及杀鞘翅目害虫的苏云金芽孢杆菌。
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)，本发明所称的一株杀鞘翅目害虫的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis yc-03)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NOM201003，培养物名称为Bacillusthuringiensis yc-03(cry3A)，该菌株是从我国土壤样品中分离、并以柳兰叶甲、马铃薯甲虫为试虫，经过毒力生物测定所筛选出的对鞘翅目害虫有高毒力的菌株。根据分离该菌株的土壤样品来源地的名称和杀鞘翅目昆虫的特点，取云南(Yunnan)、鞘翅目(Coleoptera)的第一个字母组成其代码YC，又因该菌株是从同一土壤样品中分离的多株芽孢杆菌中筛选出来的、且编号为03的一株，因此将该苏云金芽孢杆菌命名为YC-03。
基本的技术原理是利用芽孢可耐80℃高温的特性，在80℃高温下通过弹土法分离苏云金芽孢杆菌。以2龄柳兰叶甲和马铃薯甲虫的幼虫为试虫，进行毒力生物测定，经过比较毒力致死中量Lc50，筛选到该高毒力菌株。
鞘翅目害虫的危害仅次于鳞翅目害虫，对农林牧业生产有重大危害，1991年我国新疆霍城地区首次发现马铃薯甲虫入侵，迅速蔓延并对农作物造成巨大危害。因此，筛选出对鞘翅目有高效的苏云金芽孢杆菌并运用其生产新型杀虫剂具有现实意义和紧迫性。为了扩大苏云金芽孢杆菌的杀虫谱和提高杀虫活性，目前国内外均致力于新菌株的分离鉴定和新的杀虫基因的开发。在苏云金芽孢杆菌菌株的分离鉴定、筛选方面，文献“土壤来源的苏云金芽孢杆菌的形态、δ-内毒素蛋白质及其毒力特性(微生物学报，1992，32(6)387-393)”、“从土壤分离的410株苏云金芽孢杆菌的鉴定(华中农业大学学报，1994，第二期)、“我国南北方土壤中苏云金芽孢杆菌的分布及杀虫特性”(微生物学报，1996，36(4)；295-302)、及“土壤来源的五个苏云金芽孢杆菌新亚种的鉴定(微生物学报，1999，39(2)154-159)等对我国苏云金芽孢杆菌的分离、鉴定、分布特点、晶体蛋白质形态、杀虫特性等进行了研究。在高效、特异性菌株的筛选方面，文献“对斜纹夜蛾高毒力的Bt新分离株及其特性的研究(微生物学通报，1997，24(5)262-265)”、“对夜蛾幼虫高毒力的苏云金芽孢杆菌菌株及其晶体蛋白质特征(中国生物防治，1997，13(2)82-85)”、及“苏云金芽孢杆菌对甜菜夜蛾毒性的筛选(中国病毒学，2000，Vol.1598-101)”等分别从众多的苏云金芽孢杆菌菌株中筛选到了杀鳞翅目夜蛾科害虫的高效特异性菌株；在杀虫基因克隆和工程菌构建方面，目前全世界已克隆了33类近200个苏云金芽孢杆菌的基因，文献“抗鞘翅目δ-内毒素及毒素基因文库的构建(生物工程学报，1994，10(2)103-108)”、“苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因的启动子及其转录调控(微生物学通报，1999，26(2)130-134)”、“苏云金芽孢杆菌高效菌株cry基因分析及多价基因组合的研究(南开大学学报，1999，32(3)163-168)”等分别建立了抗鞘翅目δ-内毒素的基因文库、克隆了杀鳞翅目害虫的基因，对苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因的表达与调控进行了阐述。文献“杀虫防病基因工程枯草芽孢杆菌的构建”(生物工程学报，-1999，15(2)215-220)以枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒载体pHB201和pRP22为载体，通过感受态转化方法，将苏云金芽孢杆菌HD-1杀虫蛋白质基因crylAc导入水稻纹枯病生防菌株枯草芽孢杆菌B916。工程菌株质粒酶切电泳分析，核酸印记(Southern)分析和杀虫生物活性测定结果证实了crylAc基因的导入及其在B916中的有效表达。抑菌测定证明了工程菌保持了原野生型菌株良好的抑菌活性。文献“苏云金芽孢杆菌以色列亚种130000道尔顿杀蚊蛋白质基因在枯草芽孢杆菌中的表达”将苏云金芽孢杆菌以色列亚种杀蚊蛋白质基因亚克隆到pNQ122载体上，通过枯草芽孢杆菌原生质体转化，得到KMr-CMs的正反向克隆子。蛋白质免疫杂交(Western-blotting)证明杀蚊蛋白质基因在枯草芽孢杆菌中表达了具有免疫活性的杀蚊蛋白质。所表达的杀蚊蛋白在实验中具有杀蚊活性。
YC-03是国内首次分离获得的杀鞘翅目害虫的苏云金芽孢杆菌，并对其有关特性进行了研究。该苏云金芽孢杆菌菌株的杀虫特点和毒力水平国内领先，达到国际先进水平。
本发明的目的是，提供一株对鞘翅目害虫具有特异性毒杀作用的苏云金芽孢杆菌。
为了达到上述目的，本发明利用芽孢可耐80℃高温的特性，在80℃高温下通过弹土法从我国云南的土壤样品中分离出苏云金芽孢杆菌。以2龄柳兰叶甲和马铃薯甲虫的幼虫为试虫，进行毒力生物测定，经过比较毒力致死中量Lc50，筛选到该高毒力菌株。
该菌株的具体特征如下1、血清型以YC-03的鞭毛抗原与Bt的标准抗血清进行交叉凝集反应及交叉吸收凝集反应试验，YC-03的H血清型为H8ab，属苏云金芽孢杆菌的莫氏亚种(Bacillus thuringiensissubsp.morrisoni)。
2、生化特性按Barjac的经典方法进行生理生化试验。
苏云金芽孢杆菌YC-03菌株的生化特征
图5(c)为对比样CaS∶Eu的余辉特性曲线(发红光)图6为实例2材料的X射线衍射图为了更详细地说明本发明，下面结合实例进行详细描述。实例1Me＝Ca， Ln＝Y， Yb，R＝NH4Cl，Na2CO3a＝0.004， b＝0.9945， c＝0.81x＝0.0015， y＝0原料配方
将上述原料放入研钵中仔细研细混匀后，放入刚玉坩埚中，在1200℃的通98％N2/2％H2的还原炉中烧结4小时，冷却后研细，用水仔细洗涤后烘干即得实施例样品。该材料呈橙红发光。实例2Me＝Ca， Ln＝La， R＝Li3PO4，K2CO3Re＝Sia＝1.0，b＝0.994， c＝0.9x＝0.001， y＝0.001原料配方
不污染环境，有良好的经济和生态效益。因而，从优越而独特的杀虫特性、生产和使用成本低、对人和动植物安全、不污染环境及市场需求等方面考虑，苏云金芽孢杆菌YC-03有良好的推广应用前景。并且由于该菌株遗传特性比较稳定，故该菌适合用作构建广谱或高效工程菌的受体菌。
用本发明制备的杀鞘翅目害虫的苏云金芽孢杆菌YC-03杀虫剂经发酵小试及中试、菌剂生产、田间试验、示范应用，其质量达到农业部规定的一级标准；防治马铃薯甲虫、猿叶虫等鞘翅目害虫的防效达到80％以上；并用该菌株的高含量粉剂制备了杀鞘翅目害虫的苏云金芽孢杆菌杀虫剂的质量检测标准。
权利要求
1.一株杀鞘翅目害虫的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis yc-03)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NOM 201003，培养物名称为Bacillusthuringiens yx-03 (cry3A)其特征在于，该菌株是具有如下特性的苏云金芽孢杆菌a、以该菌株的鞭毛抗原与Bt的标准抗血清进行交叉凝集反应及交叉吸收凝集反应试验，该菌株的H血清型为H8ab，属苏云金芽孢杆菌的莫氏亚种(Bacillus thuringiensis subsp.morrisoni)；b、按Barjac的经典方法进行生理生化试验，该菌株的生化特征为
c、经SDS-PAGE分析，该菌株产生68-70kD的杀虫晶体蛋白质；d、该菌株至少含64、45及9.0MD三种质粒；e、该菌株的杀虫晶体蛋白质基因为cry3A，并且杀虫晶体蛋白质基因的表达为非芽孢依赖型，即杀虫晶体蛋白质的形成不依赖于芽孢的形成。
全文摘要
一株杀鞘翅目害虫的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensisyc－03),中国典型培养物保藏中心保藏号:CCTCCNO:M 201003,该菌株以柳兰叶甲、马铃薯甲虫为试虫,经过毒力生物测定筛选对鞘翅目害虫有高毒力的菌株,利用该菌株生产的杀虫剂,可扩大苏云金芽孢杆菌杀虫剂的使用范围,降低农药防治费用、减少化学农药的污染,对人、畜及动植物无害,具有良好的经济和生态效益,由于该菌株遗传特性比较稳定,故适合用作构建广谱或高效工程菌的受体菌。
文档编号C12N1/20GK1330140SQ01114288
公开日2002年1月9日 申请日期2001年6月15日 优先权日2001年6月15日
发明者高梅影, 戴顺英, 彭可凡 申请人:中国科学院武汉病毒研究所