专利名称：幽门螺杆菌基因工程疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种以减毒鼠伤寒沙门菌为载体的幽门螺杆菌基因工程疫苗及其制备方法。
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)现已被公认为慢性胃炎和消化性溃疡的重要致病菌，并与胃腺癌和胃淋巴瘤形成关系密切。虽然联合化学药物治疗可取得较高的根除率，但也存在一定问题，如抗生素的耐药率升高，药物副反应及价格昂贵，故难以在人群中推广。因此，人群H.pylori感染的防治应建立在有效疫苗应用的基础上。目前研究的疫苗主要缺点有1.全菌体死疫苗成分复杂，可造成胃粘膜损伤，且H.pylori培养条件要求高，因而成本高；2.需要粘膜免疫佐剂，而现在常用佐剂(如霍乱毒素和大肠杆菌不耐热内毒素等)均有毒性作用，不适于人用；3.基因工程重组蛋白分离纯化程序繁杂，且蛋白组分可在消化道内变性和降解，从而影响免疫效果。
本发明的目的在于提供一种成本低、对人体无毒性作用、口服方便的幽门螺杆菌基因工程疫苗及其制备方法。
幽门螺杆菌基因工程疫苗为SL3261(pTrc99A-ureB)，SL3261(pTrc99A-hpaA)，SL3261(pTrc99A-ureB/hpaA)，SL3261(pGSTag-ureA)，SL3261(pGSTag-katA)和SL3261(pGSTag-ureA/katA)幽门螺杆菌基因工程疫苗制备方法1.系列原核表达载体的构建引物设计合成如下(下划线示酶切位点)PureB1 5’ CG GAAAAAAGATTAGCAGA 3’PureB2 5’ GC GAAAATGCTAAAGAG 3’
PhpaA1 5’ CG AGATGAAAACAAT 3’PhpaA2 5’ GC FCAAATCCATCG 3’Pubha1 5’ CG CTAAAAAGATTAGCA 3’Pubha2 5’ TTTGCCTCCACCGAAAATGCTAAAG 3’Pubha3 5’ TTCGGTGGAGGCAAAGCAAATAATC 3’Pubha4 5’ GC TTATCGGTTTCT 3’dPureA1 5’GC TAATGAAACTCACCCCAAAA 3’PureA2 5’GC CTCCTTAATTGTTTTTAC 3’PkatA1 5’GC TCATGGTTAATAAAGATGTG 3’PkatA2 5’GC TGTGTGGTGCATGTCTT 3’PkatA1’ 5’GC ATGGTTAATAAAGATGTG 3’据载体质粒pTrc99A的多克隆位点已在PureB1，PhpaA1和Pubha1的5’端加NcoI酶切位点CCATTG，PureB2，PhpaA2和Pubha4的5’端加SalI酶切位点GTCGAC，并确保读框正确。提取H.pylori基因组DNA为模板，以PureB1，PureB2为引物用PCR扩增ureB。扩增前94℃变性10分钟。92℃变性45秒钟，55℃复性1分钟，72℃延伸2分钟，共30循环，最后72℃再延长5分钟。以PhpaA1，PhpaA2为引物用PCR扩增hpaA。扩增前94℃变性10分钟。92℃变性45秒钟，55℃复性45秒钟，72℃延伸1分钟，共30循环，最后72℃再延长5分钟。相似地，以Pubha1-4为引物用交叉PCR扩增ureB/hpaA融合基因。琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段。ureB、hpaA和ureB/hpaA分别与pTrc99A质粒同时用NcoI和SalI双酶切，去除小片段，然后用T4 DNA连接酶将酶切后ureB、hpaA和ureB/hpaA分别连接入pTrc99A Nco I-SalI位点。连接产物转化大肠杆菌JM105菌株，挑选amp抗性克隆，提取质粒，基因测序、PCR和NcoI与SalI双酶切后电泳鉴定，筛选阳性克隆。三重组质粒分别命名为pTrc99A-ureB、pTrc99A-hpaA和pTrc99A-ureB/hpaA。
据载体质粒pTrc99A的多克隆位点在PureA1的5’端附加EcoRI酶切位点(GAATTC)，其下游增补2个碱基以保证读框正确；PureA2的5’端附加SalI酶切位点(GAATTC)。该引物能扩增出含起始码ATG的ureA全长序列，预测片段长度约800bp。在PkatA1的5’端附加SalI酶切位点，其下游增补2个碱基以保证读框正确；PkatA2的5’端附加SacI酶切位点。该引物能扩增出含起始码ATG的katA全长序列，预测片段长度约1600bp。PkatA1’是用于扩增表达UreA/KatA双价抗原的融合基因中katA的5’端引物，在其5’端也引入一个SalI酶切位点，不需要增加碱基即可与位于其上游的ureA 3’端同一酶切位点形成的粘性末端互补连接成读框正确的融合基因，由于ureA 3’端引物已去除终止码，因而，翻译过程能够通读整个融合基因。
扩增ureA的条件扩增前97℃变性5分钟。95℃变性45秒钟，55℃复性45秒钟，72℃延伸1分钟，共30循环，最后72℃再延长7分钟。扩增katA的条件扩增前97℃变性5分钟。95℃变性45秒钟，55℃复性1分钟，72℃延伸3分钟，共30循环，最后72℃再延长7分钟。扩增产物做琼脂糖凝胶电泳后，回收PCR产物。经酶切-连接反应将ureA和katA融合在一起为ureA/katA基因。经适当的酶切-连接反应，将ureA，katAt ureA/katA分别连接入pGSTagEcoRI-SaII，Sal I-SacI位点。连接产物转化大肠杆菌JM109菌株，挑选amp抗性克隆，提取质粒，PCR和相应的双酶切后电泳鉴定，筛选阳性克隆。三个重组质粒分别命名为pGSTag-ureA，pGSTag-katA和pGSTag-ureA/katA 。
2.系列重组H.pylori活疫苗的构建系列重组质粒分别用氯化钙法转化减毒鼠伤寒沙门氏菌LB5000，筛选阳性克隆，提取修饰后质粒进一步转化终宿主疫苗菌SL3261，挑选amp抗性克隆，PCR和双酶切后电泳鉴定，得重组H.pylori疫苗菌SL3261(pTrc99A-ureB)，SL3261(pTrc99A-hpaA)，SL3261(pTrc99A-ureB/hpaA)，SL3261(pGSTag-ureA)，SL3261(pGSTag-katA)和SL3261(pGSTag-ureA/katA)。
3.系列重组H.pylori活疫苗对小鼠的免疫保护作用II级C57BL/6小鼠(雌性，8周龄，由中山医科大学动物中心提供)随机分成单纯H.pylori感染组，空载体处理组和相应疫苗菌免疫组，设或不设空白对照组和空载体菌对照组，每组15只，后两组灌喂相应菌量均为35108CFU/0.4ml/只(10D约为108CFU/ml，600nm)，单纯H.pylori感染组只灌喂生理盐水0.4ml，除一组外均只处理1次。四周后，各组均用107CFU/只SS1攻击。四周后，用颈椎脱臼法处死各组小鼠，去除前胃，取一部分胃组织做快速尿素酶试验，一部分做H.pylori定量培养，三天后鉴定并计算H.pylori菌落，结果以CFU/g胃组织表示。结果用SPSS 9.0 for Windows软件Mann-Whitney U test检验进行统计分析。
结果提示SL3261(pGSTag-katA)减毒疫苗具有免疫保护作用，尤以KatA3×108接种菌量所产生的效果最佳；SL3261(pGSTag-ureA/katA)疫苗亦有保护性作用；但SL3261(pGSTag-ureA)的作用不明显；SL3261(pTrc99A-ureB)和SL3261(pTrc99A-hpaA)具有免疫保护作用；快速尿素酶试验表明SL3261(pTrc99A-ureB/hpaA)对小鼠的保护率为75％；单纯使用转化空载体质粒的重组菌亦不能诱导有效保护作用。
本发明具有如下优点1.不需要大规模H.pylori培养，从而降低疫苗成本；
2.不需要粘膜免疫佐剂，避免了粘膜免疫佐剂对人体的毒性作用；3.避免了重组蛋白分离纯化的复杂程序；4.避免了重组蛋白在消化道内变性和降解；5.口服方便。
下面结合实施例对本发明作详细描述。1.材料和方法1.1菌株和质粒减毒鼠伤寒沙门氏菌LB5000(S.typhimurium LT2 Trp MetErpsl flaAetc，R-M+ for all three systems)和SL3261(S.typhimurium WARYhisG 46 aroA del 407 Fusaricres etc，R+M+)为本室保存菌株，用amp(-)LB培养基37℃培养。H.pylori Sydney strain 1(SS1)为澳大利亚新南威尔士大学Lee教授惠赠，用改良Skirrow培养基，37℃微需氧培养。原核表达载体pTrc99A质粒(有ampr筛选标志)和JM105菌株(用LB培养基37℃培养)购自Amersham Pharmacia公司。1.2试剂和仪器Taq DNA聚合酶(用于重组质粒鉴定)、SalI、T4 DNA连接酶、山羊抗小鼠IgG-HRP(华美生物工程公司)，高保真Taq DNA聚合酶(Taq PlusDNA Polymerase)(用于基因克隆)(上海生工生物工程有限公司)，NcoI[宝生物工程(大连)有限公司]，丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺(Promega公司)，TEMED(SERVA公司)，过硫酸铵(MERCK公司)，牛血白蛋白、4-氯-1-萘酚(毕龙转基因)，一抗为小鼠经4次H.pylori超破全菌体蛋白免疫所得免疫血清(本室制备)，QIAprep Spin Miniprep Kit、QIAquick Gel Extraction Kit(基因有限公司)，GeneAmp PCR系统2400、ABIPRISMTM377XL DNA测序仪(Perkin Elmer公司)，Sonics-VCX600超声细胞粉碎仪、蛋白电泳仪和电转移仪(Bio-Rad公司)，CS930型双波长薄层扫描仪(岛津公司)。2.系列原核表达载体的构建引物设计合成如下(下划线示酶切位点)PureB1 5’ CG GAAAAAAGATTAGCAGA 3’PureB2 5’ GC GAAAATGCTAAAGAG 3’PhpaA1 5’ CG AGATGAAAACAAT 3’PhpaA2 5’ GC TCAAATCCATCG 3’Pubha1 5’CG CTAAAAAGATTAGCA 3’Pubha2 5’ TTTGCCTCCACCGAAAATGCTAAAG 3’Pubha3 5’ TTCGGTGGAGGCAAAGCAAATAATC 3’Pubha4 5’ GC TTATCGGTTTCT 3’PureA1 5’GC TAATGAAACTCACCCCAAAA 3’PureA2 5’GC CTCCTTAATTGTTTTTAC 3’PkatA1 5’GC TCATGGTTAATAAAGATGTG 3’PkatA2 5’GC TGTGTGGTGCATGTCTT 3’PkatA1’ 5’GC ATGGTTAATAAAGATGTG 3’据载体质粒pTrc99A的多克隆位点已在PureB1，PhpaA1和Pubhal的5’端加NcoI酶切位点CCATTG，PureB2，PhpaA2和Pubha4的5’端加SalI酶切位点GTCGAC，并确保读框正确。提取H.pylori基因组DNA为模板，以PureB1，PureB2为引物用PCR扩增ureB。扩增前94℃变性10分钟。92℃变性45秒钟，55℃复性1分钟，72℃延伸2分钟，共30循环，最后72℃再延长5分钟。以PhpaA1，PhpaA2为引物用PCR扩增hpaA。扩增前94℃变性10分钟。92℃变性45秒钟，55℃复性45秒钟，72℃延伸1分钟，共30循环，最后72℃再延长5分钟。相似地，以Pubha1-4为引物用交叉PCR扩增ureB/hpaA融合基因。琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段。ureB、hpaA和ureB/hpaA分别与pTrc99A质粒同时用NcoI和SalI双酶切，去除小片段，然后用T4 DNA连接酶将酶切后ureB、hpaA和ureB/hpaA分别连接入pTrc99A Nco I-SalI位点。连接产物转化大肠杆菌JM105菌株，挑选amp抗性克隆，提取质粒，基因测序、PCR和NcoI与SalI双酶切后电泳鉴定，筛选阳性克隆。三重组质粒分别命名为pTrc99A-ureB、pTrc99A-hpaA和pTrc99A-ureB/hpaA。
据载体质粒pTrc99A的多克隆位点在PureA1的5’端附加EcoRI酶切位点(GAATTC)，其下游增补2个碱基以保证读框正确；PureA2的5’端附加SalI酶切位点(GAATTC)。该引物能扩增出含起始码ATG的ureA全长序列，预测片段长度约800bp。在PkatA1的5’端附加SalI酶切位点，其下游增补2个碱基以保证读框正确；PkatA2的5’端附加SacI酶切位点。该引物能扩增出含起始码ATG的katA全长序列，预测片段长度约1600bp。PkatA1’是用于扩增表达UreA/KatA双价抗原的融合基因中katA的5’端引物，在其5’端也引入一个SalI酶切位点，不需要增加碱基即可与位于其上游的ureA 3’端同一酶切位点形成的粘性末端互补连接成读框正确的融合基因，由于ureA 3’端引物已去除终止码，因而，翻译过程能够通读整个融合基因。
扩增ureA的条件扩增前97℃变性5分钟。95℃变性45秒钟，55℃复性45秒钟，72℃延伸1分钟，共30循环，最后72℃再延长7分钟。扩增katA的条件扩增前97℃变性5分钟。95℃变性45秒钟，55℃复性1分钟，72℃延伸3分钟，共30循环，最后72℃再延长7分钟。扩增产物做琼脂糖凝胶电泳后，回收PCR产物。经酶切-连接反应将ureA和katA融合在一起为ureA/katA基因。经适当的酶切-连接反应，将ureA，katAtureA/katA分别连接入pGSTagEcoRI-SaII，SalI-SacI位点。连接产物转化大肠杆菌JM109菌株，挑选amp抗性克隆，提取质粒，PCR和相应的双酶切后电泳鉴定，筛选阳性克隆。三个重组质粒分别命名为pGSTag-ureA，pGSTag-katA和pGSTag-ureA/katA。3.系列重组H.pylori活疫苗的构建系列重组质粒分别用氯化钙法转化感受态减毒鼠伤寒沙门氏菌LB5000，筛选阳性克隆，提取修饰后质粒进一步转化感受态终宿主疫苗菌SL3261，挑选Amp抗性克隆，PCR和双酶切后电泳鉴定，得重组H.pylori疫苗菌SL3261(pTrc99A-ureB)，SL3261(pTrc99A-hpaA)，SL3261(pTrc99A-ureB/hpaA)，SL3261(pGSTag-ureA)，SL3261(pGSTag-katA)和SL3261(pGSTag-ureA/katA)。4.重组蛋白SDS-PAGE和薄层扫描分析挑取重组菌落和对照菌落(转化pTrc99A空载体的SL3261)，在LB培养液中37℃振荡过夜，取20μl加入1880μl LB培养液中PureB1，PhpaA1振荡培养5小时，各取1ml培养物于4℃1200g离心30秒，收集菌体，用0.5ml冰预冷的50mmol.L-1Tris.Cl(pH7.4)重悬菌体，再次于4℃ 1200g离心30秒，弃上清，加25μl水重悬，加入25μl 2×SDS凝胶加样缓冲液(含100mmol.L-1Tris.Cl pH6.8，200mmol.L-1DTT，4％SDS，0.2％溴酚蓝和20％甘油)，沸水浴5分钟，于0℃超声处理1分钟，1200g离心10分钟，上清于-20℃保存。取重组菌和对照菌各10μl蛋白样品在10％SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳，凝胶于考马斯亮蓝R250液中染色，然后固定脱色，并进行薄层扫描分析。5.Western Blot分析按上述方法进行蛋白表达和SDS-PAGE电泳的凝胶电转移至硝酸纤维素膜，2％牛血清白蛋白(BSA)37℃封闭30分钟，加入一抗4℃过夜，山羊抗小鼠IgG-HRP 37℃1小时，经TBS振洗后，4-氯-1-萘酚显色。6.系列重组H.pylori活疫苗对小鼠的免疫保护作用II级C57BL/6小鼠(雌性，8周龄，由中山医科大学动物中心提供)随机分成单纯H.pylori感染组，空载体处理组和相应疫苗菌免疫组，设或不设空白对照组和空载体菌对照组，每组15只，后两组灌喂相应菌量均为35108CFU/0.4ml/只(10D约为108CFU/ml，600nm)，单纯H.pylori感染组只灌喂生理盐水0.4ml，除一组外均只处理1次。四周后，各组均用107CFU/只SS1攻击。四周后，用颈椎脱臼法处死各组小鼠，去除前胃，取一部分胃组织做快速尿素酶试验，一部分做H.pylori定量培养，三天后鉴定并计算H.pylori菌落，结果以CFU/g胃组织表示。结果用SPSS 9.0for Windows软件Mann-Whitney U test检验进行统计分析。7.结果经PCR和酶切分析表明，6个疫苗菌株均构建成功，且目的蛋白均能在宿主菌中不同程度表达。小鼠腺胃H.pylori定植情况及经SPSS 9.0 forWindows软件Mann-Whitney U test检验进行统计分析如下二表。
表1各组小鼠腺胃粘膜H.pylori的定植密度的比较(CFU/g)(-)
注①三对照组之间无显著性差异(P＞0.05)；②KatA各组与对照组相比差异有显著性意义(P＜0.05)，特别是KatA3×108组与其它组之间均有显著性差异(P＝0.000)；③UreA/KatA组与对照组相比有显著性差异(P＜0.05)；④UreA组与对照组之间差异无显著性意义(P＞0.05)，与KatA组和UreA/KatA组之间有显著性差异(P＜0.05)。
各组腺胃组织中H.pylor的定植密度的比较(CFU/g)(二)
注①两对照组之间无显著性差异(P＝0.847)；②UreB 3×108组与对照组之间均有显著性差异(P＝0.000)；③HpaA3×108组与对照组相比有显著性差异(P＝0.000)。
以上结果表明，SL3261(pGSTag-katA)减毒疫苗具有免疫保护作用，尤以KatA3×108接种菌量所产生的效果最佳；SL3261(pGSTag-ureA/katA)疫苗亦有保护性作用；但SL3261(pGSTag-ureA)的作用不明显；SL3261(pTrc99A-ureB)和SL3261(pTrc99A-hpaA)均具有免疫保护作用；快速尿素酶试验表明SL3261(pTrc99A-ureB/hpaA)对小鼠的保护率为75％；单纯使用转化空载体质粒的重组菌亦不能诱导有效保护作用。
权利要求
1.一种幽门螺杆菌基因工程疫苗，其特征在于它为SL3261(pTrc99A-ureB)，SL3261(pTrc99A-hpaA)，SL3261(pTrc99A-ureB/hpaA)，SL3261(pGSTag-ureA)，SL3261(pGSTag-katA)和SL3261(pGSTag-ureA/katA)。
2.一种幽门螺杆菌基因工程疫苗之制备方法，其特征在于1.系列原核表达载体的构建引物设计合成如下(下划线示酶切位点)PureB1 5’ CG GAAAAAAGATTAGCAGA 3’PureB2 5’ GC GAAAATGCTAAAGAG 3’PhpaA1 5’ CG AGATGAAAACAAT 3’PhpaA2 5’ GC TCAAATCCATCG 3’Pubha1 5’ CG CTAAAAAGATTAGCA 3’Pubha2 5’ TTTGCCTCCACCGAAAATGCTAAAG 3’Pubha3 5’ TTCGGTGGAGGCAAAGCAAATAATC 3’Pubha4 5’ GC TTATCGGTTTCT 3’PureA1 5’GC TAATGAAACTCACCCCAAAA 3’PureA2 5’GC CTCCTTAATTGTTTTTAC 3’PkatA1 5’GC TCATGGTTAATAAAGATGTG 3’PkatA2 5’GC TGTGTGGTGCATGTCTT 3’PkatA1’ 5’GC ATGGTTAATAAAGATGTG 3’据载体质粒pTrc99A的多克隆位点已在PureB1，PhpaA1和Pubha1的5’端加NcoI酶切位点CCATTG，PureB2，PhpaA2和Pubha4的5’端加SalI酶切位点GTCGAC，并确保读框正确；提取H.pylori基因组DNA为模板，以PureB1，PureB2为引物用PCR扩增ureB；扩增前94℃变性10分钟，92℃变性45秒钟，55℃复性1分钟，72℃延伸2分钟，共30循环，最后72℃再延长5分钟；以PhpaA1，PhpaA2为引物用PCR扩增hpaA；扩增前94℃变性10分钟，92℃变性45秒钟，55℃复性45秒钟，72℃延伸1分钟，共30循环，最后72℃再延长5分钟；相似地，以Pubha1-4为引物用交叉PCR扩增ureB/hpaA融合基因，琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段；ureB、hpaA和ureB/hpaA分别与pTrc99A质粒同时用NcoI和SalI双酶切，去除小片段，然后用T4 DNA连接酶将酶切后ureB、hpaA和ureB/hpaA分别连接入pTrc99A NcoI-SalI位点；连接产物转化大肠杆菌JM105菌株，挑选amp抗性克隆，提取质粒，基因测序、PCR和NcoI与SalI双酶切后电泳鉴定，筛选阳性克隆；三重组质粒分别命名为pTrc99A-ureB、pTrc99A-hpaA和pTrc99A-ureB/hpaA；据载体质粒pTrc99A的多克隆位点在PureA1的5’端附加EcoRI酶切位点(GAATTC)，其下游增补2个碱基以保证读框正确；PureA2的5’端附加SalI酶切位点(GAATTC)；该引物能扩增出含起始码ATG的ureA全长序列，预测片段长度约800bp；在PkatA1的5’端附加SalI酶切位点，其下游增补2个碱基以保证读框正确，PkatA2的5’端附加SacI酶切位点，该引物能扩增出含起始码ATG的katA全长序列，预测片段长度约1600bp；PkatA1’是用于扩增表达UreA/KatA双价抗原的融合基因中katA的5’端引物，在其5’端也引入一个SalI酶切位点，不需要增加碱基即可与位于其上游的ureA 3’端同一酶切位点形成的粘性末端互补连接成读框正确的融合基因，由于ureA 3’端引物已去除终止码，因而，翻译过程能够通读整个融合基因；扩增ureA的条件扩增前97℃变性5分钟，95℃变性45秒钟，55℃复性45秒钟，72℃延伸1分钟，共30循环，最后72℃再延长7分钟；扩增katA的条件扩增前97℃变性5分钟，95℃变性45秒钟，55℃复性1分钟，72℃延伸3分钟，共30循环，最后72℃再延长7分钟；扩增产物做琼脂糖凝胶电泳后，回收PCR产物；经酶切-连接反应将ureA和katA融合在一起为ureA/katA基因；经适当的酶切-连接反应，将ureA，katAt ureA/katA分别连接入pGSTagEcoRI-SaI I，SalI-SacI位点；连接产物转化大肠杆菌JM109菌株，挑选amp抗性克隆，提取质粒，PCR和相应的双酶切后电泳鉴定，筛选阳性克隆；三个重组质粒分别命名为pGSTag-ureA，pGSTag-katA和pGSTag-ureA/katA；2.系列重组H.pylori活疫苗的构建系列重组质粒分别用氯化钙法转化减毒鼠伤寒沙门氏菌LB5000，筛选阳性克隆，提取修饰后质粒进一步转化终宿主疫苗菌SL3261，挑选amp抗性克隆，PCR和双酶切后电泳鉴定，得重组H.pylori疫苗菌SL3261(pTrc99A-ureB)，SL3261(pTrc99A-hpaA)，SL3261(pTrc99A-ureB/hpaA)，SL3261(pGSTag-ureA)，SL3261(pGSTag-katA)和SL3261(pGSTag-ureA/katA)。
全文摘要
本发明涉及一种幽门螺杆菌基因工程疫苗及其制备方法。它为SL3261(pTrc99A－ureB),SL3261(pTrc99A－hpaA),SL3261(pTrc99A－ureB/hpaA),SL3261(pGSTag－ureA),SL3261(pGSTag－katA)和SL3261(pGSTag－ureA/katA)。该疫苗通过系列原核表达载体的构建、系列重组H.pylori活疫苗的构建制备而成。本发明具有成本低、对人体无毒性、口服方便等优点。
文档编号C12N15/31GK1338306SQ0111472
公开日2002年3月6日 申请日期2001年5月23日 优先权日2001年5月23日
发明者陈旻湖, 胡品津, 朱森林, 廖文俊 申请人:中山医科大学附属第一医院