专利名称：玉米dreb类转录因子及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及玉米DREB类转录因子及其编码基因与应用，特别是涉及玉米DREB类耐寒和耐旱转录因子及其编码基因与应用。
玉米(Zea mays L.)是重要的粮食作物之一，培育耐寒，耐旱的品种对提高玉米产量具有重要意义。
本发明提供的2个玉米DREB类转录因子之一为maDREB1，它具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
序列表中序列2的玉米DREB类转录因子maDREB1由281个氨基酸残基组成。
玉米DREB类转录因子maDREB1的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中序列1编码玉米DREB类转录因子maDREB1的基因由1388个碱基组成。该基因的读码框为自3’端第57到第902位碱基。
本发明提供的另一个玉米的DREB类转录因子是maDREB2，它具有序列表中序列4的氨基酸残基序列或将序列4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列4的氨基酸残基序列相同活性的由序列4衍生的蛋白质。
序列表中序列4的玉米DREB类转录因子maDREB2由267个氨基酸残基组成。
玉米DREB类转录因子maDREB2的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列3的DNA序列；2)与序列表中序列3限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中序列3编码玉米DREB类转录因子maDREB2的基因由1085个碱基组成。该基因的读码框为自3’端第120到第923位碱基。
本发明所提供的2个玉米DREB类转录因子maDREB1和maDREB2具有与DRE顺式作用元件结合的能力，并能激活下游基因的表达。其编码基因都含有保守的AP2/EREBP结构域序列，代表了玉米中的一种转录因子家族。
用本发明所提供的编码转录因子maDREB1和maDREB2的基因，使用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体(这些植物表达载体包括双元农杆菌载体以及用于单子叶植物微弹轰击的载体)转化植株，都可获得对低温和干旱胁迫耐受力得到增强的转基因植株。载体还可包括3’非翻译区域，包含聚腺苷酸信号和任何其它的可效应mRNA加工或基因表达的DNA片段。聚腺苷酸信号引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。3’区域的例子有农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’转录的非翻译区等。本发明的maDREB1和maDREB2基因的3’非翻译区域可被用于在植物中表达。本发明的2个基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种强启动子或诱导型启动子。这些启动子很多，如花椰菜花叶病毒(CAMV 35S)和Ubiqutin启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。本发明的2个基因在构建到植物表达载体中时，也可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。这些增强子区域可以是ATG起始密码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。翻译控制信号和起始密码子可以是天然或合成等多种不同来源的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，包括加入植物可选择性标记。使用的选择性标记可以是编码对抗生素抗性酶的基因，抗生素包括庆大霉素、潮霉素、卡那霉素等。也可以是产生颜色变化的酶或发光化合物的基因，如GUS、荧光酶，还可以是抗化学试剂(例如除莠剂)的基因。当然，也可以不用任何筛选标记。
携带有本发明maDREB1和maDREB2基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，Now York，pp.421-463；Geiserson and Corey，1998，Plant Molecular Biology(2ndEdition)。
可使用包括本发明的2个基因maDREB1和maDREB2的植物表达载体转化植物宿主(既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等)，培育抗寒和抗旱的植物品种。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
图2为maDREB2基因转化酵母双报导子细胞后，在0mM 3-AT SD/-His-Ura-Trp平板和30mM 3-ATSD/-His-Ura-Trp平板上的生长情况。
图3为Southern杂交分析maDREB1基因在玉米基因组中组成的结果。
图4为Southern杂交分析maDREB2基因在玉米基因组中组成的结果。
图7为maDREB1基因在低温、干旱条件下表达状态的RT-PCR检测结果。
图8为maDREB2基因在低温、干旱条件下表达状态的RT-PCR检测结果。
实施例2、含有DRE顺式作用元件的酵母双报道子细胞的获得将从rd29A启动子区分离的由75bp组成的DRE顺式作用元件通过HindIII酶切位点将其串联成4个重复，获得含有4个串联重复的DRE元件的DNA片段。将所得到的DNA片段插入pHISi-1载体的PminHIS3启动子的上游，并获得能在缺乏组氨酸的SD培养基上正常生长的酵母转化体。同时将这个DNA片段构建到pLacZi载体的PCYC1启动子的上游，然后将载体转化到含有pHISi-1载体的酵母转化体中。这样，在同时缺乏组氨酸和尿氨酸的培养基上，选择获得含有pHISi-1和pLacZi载体的酵母转化体。以同样的方法获得含有突变型DRE顺式作用元件的酵母双报导子细胞。HIS和LacZ基因作为2个报告基因，当其上游的DRE元件被DREB转录因子识别后，其表达强度会显著增强。通过3-AT(组氨酸合成酶竞争性抑制剂)来检测HIS基因的表达强度，同时通过β-半乳糖苷酶活力的测定来检测LacZ基因的表达强度。若其上游为突变型的DRE顺式作用元件，则其表达将无法得到增强。图3和图4分别显示了本发明编码DREB类转录因子maDREB1和maDREB2的2个基因转化酵母双报导子细胞后在含3-AT的SD/-His-Ura-Trp平板上的生长情况。图3中，A、B、C分别表示拟南芥DREB1A、maDREB1、YepGAP空载体转化酵母细胞所得的转化子。图4中，A、B、C分别表示拟南芥DREB1A、maDREB2、YepGAP空载体转化酵母细胞所得的转化子。
实施例3、玉米cDNA文库的筛选和编码转录因子maDREB1和maDREB2的基因的克隆利用含有DRE顺式作用元件的酵母双报导子细胞，在含30mM 3-AT的SD/-His-Ura-Leu的平板上筛选玉米cDNA文库，(具体操作步骤见Clontech Mathchmakerone-hybrid system)。所得到的阳性克隆在YPD液体培养基中培养，提取质粒转化大肠杆菌。将所插入的cDNA片段从载体上切下，构建到YepGAP酵母表达载体中。由于此载体上无GAL4转录激活区域，因此只有既能与DRE元件结合又能激活下游报导基因表达的蛋白才能在30mM 3-AT的SD/-His-Ura-Leu的平板上生长。对于这样的阳性克隆，将其cDNA片段再构建到SK+载体上，经过测序获得了编码转录因子maDREB1和maDREB2的基因的核苷酸序列。maDREB1基因包括843bp的开放读码框架，编码由281个氨基酸组成的多肽，其5’端为56bp，3’端为488bp，为序列表中的序列1。maDREB2基因包括816bp的开放读码框架，编码由272个氨基酸组成的多肽，其5’端为119bp，3’端为165bp，为序列表中的序列3。
实施例4、maDREB1和maDREB2基因在玉米基因组中的分析提取玉米品种P138和水6的基因组总DNA，分别用EcoRI、XbaI、PstI3种限制性内切酶进行消化。将消化后的DNA转到N+Hybond膜上，用全长的maDREB1作探针，进行Southern杂交分析。在高严谨度条件下洗膜(65℃，0.2×SSC，0.1％SDS)得到2-3杂交条带，结果如图3所示，图中E带是用EcoRI进行消化的、X带是用XbaI进行消化的、P带是用PstI进行消化的，表明maDREB1基因在玉米基因组中以低拷贝形式存在。提取玉米品种P138的基因组总DNA，分别用BamHI、SalI、XbaI、PstI 4种限制性内切酶进行消化。以同样的方法进行Southern杂交分析，在高严谨条件下同样得到2-3杂交条带，结果如图4所示，图中B带是用BamHI进行消化的、S带是用SalI进行消化的、X带是用XbaI进行消化的、P带是用PstI进行消化的，结果表明maDREB2基因在玉米基因组中与maDREB1基因一样以低拷贝形式存在。
实施例5、玉米maDREB1和maDREB2基因在逆境中的表达特征对在1/2MS培养基上生长10-14天的玉米植株，在4℃下低温处理4小时，或在干旱条件下处理4小时，经液氮速冻，提取RNA作RT-PCR分析。RT-PCR反应中以玉米actinl基因为内对照，以控制PCR反应中模板cDNA浓度的一致。结果如图5、图6所示，图5中(A)是检测maDREB1基因在低温、干旱条件下表达状态的实验组、(B)是对照组、C带的样品未经逆境处理、L带的样品经低温处理4小时、D带的样品经干旱处理4小时，从图中可以看出maDREB1的转录受到低温和干旱的微弱诱导；图6中(A)是检测maDREB2基因在低温、干旱条件下表达状态的实验组、(B)是对照组、C带的样品未经逆境处理、L带的样品经低温处理4小时、D带的样品经干旱处理4小时，从图中可以看出maDREB2基因的转录受到低温和干旱的强烈诱导。
序列表<160>4<210>1<211>1388<212>DNA<213>玉米属玉米(Zea mays L.)<220><221>CDS<222>(57)...(902)<400>1ccagagtacc agacaccact gcgcatcagt gcaaagaggt agctacccta tctgcc atg 59Met1gct caa gag ctc cac gaa acg tcc tct tgc tct gcc acc acc acc tcg 107Ala Gln Glu Leu His Glu Thr Ser Ser Cys Ser Ala Thr Thr Thr Ser5 10 15tcg tgc acc aca tcc tgc tgc tcg tcc act gtc aca gac tcg tcc tct 155Ser Cys Thr Thr Ser Cys Cys Ser Ser Thr Val Thr Asp Ser Ser Ser20 25 30tcg ccc ccg tca ccg gcg gcg gcc aat gcc gcg ccc gcg aca cgg aag 203Ser Pro Pro Ser Pro Ala Ala Ala Asn Ala Ala Pro Ala Thr Arg Lys35 40 45cgg cag gcg ttg gag gcc gag gcc gag gcc gag gcg ggc ggt gag gag 251Arg Gln Ala Leu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Ala Gly Gly Glu Glu50 55 60 65gag gag gag gag gag gaa ggc tgt gct ggt aat aag gcg gcg ccg gcc 299Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Cys Ala Gly Asn Lys Ala Ala Pro Ala70 75 80aag aag cga ccg cgg ggc agc gag ggg aag cac ccg acg ttc cgc ggc 347Lys Lys Arg Pro Arg Gly Ser Glu Gly Lys His Pro Thr Phe Arg Gly85 90 95gtg cgg atg cgg gcg tgg ggc aag tgg gtg tcg gag atc cgc gag ccg 395Val Arg Met Arg Ala Trp Gly Lys Trp Val Ser Glu Ile Arg Glu Pro100 105 110cgc aag aag tcg cgc ata tgg ctc ggc acg ttc ccc acc gcc gag atg 443Arg Lys Lys Ser Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala Glu Met115 120 125gcc gcg cgc gcc cac gac gtc gcg gcg ctc gcc atc aag ggc cgc gcc 491Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Leu Ala Ile Lys Gly Arg Ala130 135 140 145gcg cac ctc aac ttc ccg gac ctc gcc ggc gcg ctc ccg cgc gcc gcg 539Ala His Leu Asn Phe Pro Asp Leu Ala Gly Ala Leu Pro Arg Ala Ala150 155 160tcc gcg gcg ccc aag gac gtc cag gca gcc gcc gca ttg gcc gct gcg 587Ser Ala Ala Pro Lys Asp Val Gln Ala Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala165 170 175ttc acg tcg ccg tca tcg gag ccc ggc gcc ggc gcg cac gag gag ccc 635Phe Thr Ser Pro Ser Ser Glu Pro Gly Ala Gly Ala His Glu Glu Pro180 185 190gct gcc aag gac ggc gcc gcg ccc gag gag gca gcc gcc gac gca cag 683Ala Ala Lys Asp Gly Ala Ala Pro Glu Glu Ala Ala Ala Asp Ala Gln195 200 205gca cca gta cca gta gca cta cca ccg ccg gcg gcc tct cgg cca ggg 731Ala Pro Val Pro Val Ala Leu Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg Pro Gly210 215 220 225acg ccg tcg agc ggc gtg gag gac gag cgg cag ctg ttc gac ctg ccg 779Thr Pro Ser Ser Gly Val Glu Asp Glu Arg Gln Leu Phe Asp Leu Pro230 235 240gac ctg ctc ctc gac atc cgg gac ggg ttc ggg cgc ttc ccg ccg atg 827Asp Leu Leu Leu Asp Ile Arg Asp Gly Phe Gly Arg Phe Pro Pro Met245 250 255tgg gcc ccg ctc act gac gtg gag gag gtg gtc aat gcg gag ctg cgc 875Trp Ala Pro Leu Thr Asp Val Glu Glu Val Val Asn Ala Glu Leu Arg
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Ala Asp Val Ala Leu Trp Ser Tyr Tyr260 26权利要求
1.玉米的DREB类转录因子maDREB1，它具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的转录因子，其特征在于它具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。
3.玉米DREB类转录因子maDREB1的编码基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述玉米DREB类转录因子maDREB1的编码基因是序列表中序列1的DNA序列。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于该基因的读码框为自3’端第57到第902位碱基。
6.玉米的DREB类转录因子maDREB2，它具有序列表中序列4的氨基酸残基序列或将序列4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列4的氨基酸残基序列相同活性的由序列4衍生的蛋白质。
7.根据权利要求6所述的转录因子，其特征在于它具有序列表中序列4的氨基酸残基序列。
8.玉米DREB类转录因子maDREB2的编码基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列3的DNA序列；2)与序列表中序列3限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
9.根据权利要求8所述的基因，其特征在于所述玉米DREB类转录因子maDREB2的编码基因是序列表中序列3的DNA序列。
10.根据权利要求9所述的基因，其特征在于该基因的读码框为自3’端第120到第923位碱基。
11.含有权利要求3或/和8所述基因的表达载体。
12.含有权利要求3或/和8所述基因的细胞系。
13.权利要求3和权利要求8所述的基因在培育抗寒和抗旱植物品种中的应用。
全文摘要
本发明公开了2个玉米DREB类转录因子及其编码基因与应用，具体的说是公开了2个玉米DREB类耐寒和耐旱转录因子及其编码基因与应用。本发明的目的是提供玉米的2个DREB类转录因子及其编码基因，该转录因子在植物抗寒和抗旱反应中具有调控作用。本发明提供的2个玉米DREB类转录因子分别为maDREB1和maDREB1，具有序列表中序列2和序列4的氨基酸残基序列或将序列2和序列4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2和序列4的氨基酸残基序列相同活性的由序列2和序列4衍生的蛋白质。本发明的转录因子在培育抗寒和抗旱植物品种中具有重要意义。
文档编号C12N15/82GK1472222SQ0212537
公开日2004年2月4日 申请日期2002年7月29日 优先权日2002年7月29日
发明者刘强, 秦峰, 赵军, 陈受宜, 刘 强 申请人:清华大学, 中国科学院遗传与发育生物学研究所