专利名称：一株广谱苏云金芽孢杆菌及其制备杀虫剂的方法
技术领域：
本发明涉及芽孢杆菌，更具体涉及一株广谱苏云金芽孢杆菌；本发明还涉及该苏云金芽孢杆菌制备杀虫剂的方法。
本发明所称的一株广谱苏云金芽孢杆菌已于2002年6月7日在中国武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，编号CCTCC NOM202025，名称苏云金芽孢杆菌Hcy08-02(Bacillus thuringiensisHcy08-02)。
苏云金芽孢杆菌Hcy08-02(以下简称菌株Hcy08-02)是由土壤样品中分离、并以甜菜夜蛾、棉铃虫和小菜蛾等鳞翅目害虫为试虫，经过毒力生物测定所筛选出的对多种鳞翅目害虫有高毒力地菌株。根据分离该菌株的土壤样品来源地的名称和该菌株的编号命名为Hcy08-02。
背景技术：
鳞翅目害虫是主要的农、林、果、蔬菜害虫，对农业生产有重大危害。苏云金芽孢杆菌杀虫剂是一种无污染的生物农药，为了扩大苏云金芽孢杆菌的杀虫谱和提高杀虫活性，目前国内外均致力于新菌株的分离鉴定和新的杀虫基因的开发。在苏云金芽孢杆菌菌株的分离鉴定、筛选方面，文献“土壤来源的苏云金芽孢杆菌的形态、δ-内毒素蛋白质及其毒力特性(微生物学报，1992，32(6)387-393)”、“从土壤分离的410株苏云金芽孢杆菌的鉴定(华中农业大学学报，1994，第二期)、“我国南北方土壤中苏云金芽孢杆菌的分布及杀虫特性”(微生物学报，1996，36(4)；295-302)、及“上壤来源的五个苏云金芽孢杆菌新亚种的鉴定(微生物学报，1999，39(2)154-159)等对我国苏云金芽孢杆菌的分离、鉴定、分布特点、晶体蛋白质形态、杀虫特性等进行了研究。在高效、特异性菌株的筛选方面，文献“对斜纹夜蛾高毒力的Bt新分离株及其特性的研究(微生物学通报，1997，24(5)262-265)”、“对夜蛾幼虫高毒力的苏云金芽孢杆菌菌株及其晶体蛋白质特征(中国生物防治，1997，13(2)82-85)”、及“苏云金芽孢杆菌对甜菜夜蛾毒性的筛选(中国病毒学，2000，Vol.1598-101)”等分别从众多的苏云金芽孢杆菌菌株中筛选到了杀鳞翅目夜蛾科害虫的高效特异性菌株。但天然广谱高效的苏云金芽孢杆菌的分离及应用仍很少报道。Hcy08-02是目前分离得到的一株天然高效广谱杀鳞翅目害虫的苏云金芽孢杆菌，含有多个杀虫蛋白质编码基因，对鳞翅目的棉铃虫、小菜蛾、甜菜夜蛾、菜青虫等害虫有高效毒杀作用；发酵性能优良，是一株极具开发、应用前景的天然苏云金芽孢杆菌。
发明内容
本发明的目的是，提供一株广谱苏云金芽孢杆菌Hcy08-02(Bacillus thuringiensis Hcy08-02)，该菌株有优良的发酵性，含有多个杀虫蛋白质编码基因，对鳞翅目的棉铃虫、小菜蛾、甜菜夜蛾、菜青虫等害虫具有高效的毒杀作用；本发明的另一目的是提供该菌株制备杀虫剂的方法。
为了达到上述目的，发明采用如下技术方案
菌株Hcy08-02是按下列步骤分离得到
(1)将含有菌株Hcy08-02的土壤放入无菌培养皿中；
(2)在培养皿中加入75-85℃的琼脂培养基，待其凝固后，倒置放入28-30℃恒温箱中，培养3天，挑选产生伴孢晶体的单菌落；
(3)将单菌落接种于发酵培养基，在28-30℃、200转/分钟的摇瓶中发酵，至伴孢晶体脱落，即为发酵液；
(4)将发酵液分别与其重量1000倍、2000倍、4000倍和8000倍的人工饲料混合；
(5)将每种混合物放在3个养虫板中，每种混合物的3个养虫板分别放入初孵甜菜夜蛾、棉铃虫和3龄小菜蛾的试虫，置于25-28℃恒温箱中培养3天，进行靶标昆虫的生物测定；
(6)挑选杀虫效果最佳的菌株，命名为Hcy08-02。
上述(2)中琼脂培养基为(重量％)
蛋白胨1、牛肉膏0.5、琼脂2、食盐0.5、余者为水；其pH值为7.0～7.5。
上述(3)中的发酵培养基为(重量％)
淀粉4.0、豆饼粉2.4、棉子饼粉1.5、蛋白胨0.5、酵母粉0.4、玉米浆2.0、MgSO47H2O 0.04、KH2PO4 0.2、K2HPO4 0.2、CaCO4 0.1、α-淀粉酶0.01、余者为水；
其pH值为7.5-8.0。
上述(4)中的人工饲料(重量％)为
琼脂1.5、大豆粉7、酵母粉5、Vc 0.5、苯甲酸钠0.2、余者为水。
菌株Hcy08-02的特征如下
1.H血清型以Hcy08-02的鞭毛抗原与Bt的标准抗血清进行交叉凝集反应及交叉吸收凝集反应试验，Hcy08-02的H血清型为H7。
2.生化特性按伯杰斯(Barjac)的经典方法进行生理生化试验。
苏云金芽孢杆菌Hcy08-02菌株的生化特征
3.杀虫晶体蛋白质经SDS-PAGE分析，菌株Hcy08-02产生68-70千道尔顿和130～135千道尔顿两种杀虫晶体蛋白质。
4.质粒菌株Hcy08-02至少含有12个质粒，其中有一个分子量大于染色体DNA的质粒。
5.杀虫晶体蛋白质基因经过PCR检测，菌株Hcy08-02的杀虫晶体蛋白质基因为crylAc、crylAb、crylC、crylAa。
6.杀虫特性经毒力生物测定，菌株Hcy08-02对鳞翅目的棉铃虫、甜菜夜蛾、小菜蛾、菜青虫均有较高杀虫活性。
菌株Hcy08-02制备杀虫剂的方法按下列步骤顺序进行
(1)在发酵罐中配置发酵培养基(重量％)淀粉4.0、豆饼粉2.4、棉子饼粉1.5、蛋白胨0.5、酵母粉0.4、玉米浆2.0、MgSO47H2O0.04、KH2PO4 0.2、K2HPO4 0.2、CaCO4 0.1、α-淀粉酶0.01、余者为水；
(2)用NaOH将培养基的pH值调至7.5-8.0；
(3)蒸汽115-120℃灭菌25-30分钟；
(4)将发酵培养基重量的0.001-0.005％的菌种放入60℃的温水中30分钟，制成孢子悬液；
(5)待培养基的温度降至37℃时，把孢子悬液接入发酵罐中；
(6)在32℃、400转/分、通气量(立方米/分钟)与发酵罐容积比为0.8～1.2∶1的条件下发酵10小时；
(7)在29℃、500转/分、通气量(立方米/分钟)与发酵罐容积比为1.0～1.5∶1的条件下发酵10-14小时；
(8)在32℃、500转/分、通气量(立方米/分钟)与发酵罐容积比为1.0～1.5∶1的条件下发酵10-15小时；
(9)在芽孢脱落50％时终止发酵，用HCL将发酵液的pH值调至4.5-5.0；
(10)按照常规方法制备成各种规格的杀虫剂。
与现有技术相比，本发明具有杀多种鳞翅目害虫的特点，扩大苏云金芽孢杆菌杀虫剂的使用范围，降低农药防治费用、减少化学农药对环境的污染，增加农作物产量。本发明的菌株及其制备的杀虫剂对人、畜及动植物无害，不污染环境，生产和使用成本低、工业化生产技术成熟具有良好的推广应用前景。
具体实施例方式
以下是利用菌株Hcy08-02制备杀虫剂粉剂的
具体实施例方式
(1)在3吨的发酵罐中放入2吨发酵培养基；发酵培养基的配比为(重量％)淀粉4.0、豆饼粉2.4、棉子饼粉1.5、蛋白胨0.5、酵母粉0.4、玉米浆2.0、MgSO47H2O 0.04、KH2PO4 0.2、K2HPO4 0.2、CaCO4 0.1、α-淀粉酶0.01、其余为水；
(2)用NaOH将培养基的pH值调至7.8；
(3)蒸汽120℃灭菌30分钟；
(4)将25克的菌种放入60℃的温水中30分钟，制成孢子悬液；
(5)待培养基的温度降至37℃时，把孢子悬液接入发酵罐中；
(6)在32℃、400转/分、通气量2立方米/分钟的条件下发酵10小时；
(7)在29℃、500转/分、通气量2.5立方米/分钟的条件下发酵12小时；
(8)在32℃、500转/分、通气量2.5立方米/分钟的条件下发酵15小时；
(9)在芽孢脱落50％时终止发酵，用HCL将发酵液的pH值调至4.5；
(10)在2吨发酵液中加入200公斤的轻质碳酸钙、20公斤农乳700号乳化剂、20公斤961粉渗透剂和50公斤食盐，充分混合；
(11)在喷雾干燥塔中，采用进口温度175℃、出口温度90℃，将混合液制成杀虫剂粉剂。
权利要求
1、一株广谱苏云金芽孢杆菌，其特征在于，该菌株名称为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Hcy08-02，CCTCC NO.M202025。
2、根据权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌，其特征在于，该菌株有以下特征
(1)H血清型为H7；
(2)生化特征为
(3)产生68～70千道尔顿和130～135千道尔顿两种杀虫晶体蛋白质；
(4)至少含有12个质粒，其中有一个分子量大于染色体DNA的质粒；
(5)杀虫晶体蛋白质基因为crylAc、crylAb、crylC、crylAa；
(6)对鳞翅目的棉铃虫、甜菜夜蛾、小菜蛾、菜青虫均有较高杀虫活性。
3、用权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌Hcy08-02制备杀虫剂的方法，其特征在于，该方法按下列步骤顺序进行
a、在发酵罐中放入发酵培养基；
b、用NaOH将培养基的pH值调至7.5-8.0；
c、蒸汽115-120℃灭菌25-30分钟；
d、将发酵培养基重量的0.001-0.005％的菌种放入60℃的温水中30分钟，制成孢子悬液；
e、待培养基的温度降至37℃时，把孢子悬液接入发酵罐中；
f、在32℃、400转/分、每分钟通气量与发酵罐容积比为0.8～1.2∶1的条件下发酵10小时；
g、在29℃、500转/分、每分钟通气量与发酵罐容积比为1.0～1.5∶1的条件下发酵10-14小时；
h、在32℃、500转/分、每分钟通气量与发酵罐容积比为1.0～1.5∶1的条件下发酵10-15小时；
i、在芽孢脱落50％时终止发酵，用HCL将发酵液的pH值调至4.5-5.0；
j、按照常规方法制备成各种规格的杀虫剂。
4、根据权利要求3所述的制备杀虫剂的方法，其特征在于，所述的发酵培养基各组份的重量百分比为淀粉4.0、豆饼粉2.4、棉子饼粉1.5、蛋白胨0.5、酵母粉0.4、玉米浆2.0、MgSO47H2O 0.04、KH2PO4 0.2、K2HPO4 0.2、CaCO4 0.1、α-淀粉酶0.01、余者为水。
全文摘要
本发明公开了一株广谱苏云金芽孢杆菌Hcy08－02，在武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，编号CCTCCNOM202025，该菌株有优良的发酵性，含有多个杀虫蛋白质编码基因，对鳞翅目的棉铃虫、小菜蛾、甜菜夜蛾、菜青虫等害虫具有高效的毒杀作用。本发明还公开了该菌株制备杀虫剂的方法，该杀虫剂具有杀多种鳞翅目害虫的特点，扩大了苏云金芽孢杆菌杀虫剂的使用范围，降低农药防治费用、减少化学农药对环境的污染。本发明的菌株及其制备的杀虫剂对人、畜及动植物无害，不污染环境，生产和使用成本低、工业化生产技术成熟具有良好的推广应用前景。
文档编号C12N1/20GK1392248SQ0213871
公开日2003年1月22日 申请日期2002年6月26日 优先权日2002年6月26日
发明者高梅影, 彭可凡, 戴顺英 申请人:中国科学院武汉病毒研究所