专利名称：一种超低变性温度的聚合酶链式反应方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术，特别是涉及一种聚合酶链式反应的方法及其应用。
背景技术：
聚合酶链式反应是一种高效的扩增特定DNA的方法，在生物医学的各个领域特别是临床诊断上有广泛的应用。聚合酶链式反应主要由25-35个温度呈周期变化的循环组成，每一个循环包括变性，退火和延伸三个步骤。其中，变性步骤目的是将原始模板或扩增产物的DNA双链解开使之成为二条单链，然后二条单链能在退火温度下与正、反引物分别互补结合，继而延伸完成一个循环。变性步骤可以看作是每一轮循环的起始步骤，是整个扩增过程中不可或缺的一环。
PCR反应的专一性和效率主要取决于退火和延伸步骤，对变性过程的研究远不及对退火和延伸的研究那样广泛深入。有关PCR的各种技术指南均指出变性温度范围通常为94-95℃，已发表的十余万篇应用PCR方法的论文中绝大多数应用这一温度，极少数使用较高的变性温度如96℃或较低的变性温度如90-94℃，文献报导的最低变性温度为87℃。
历来将变性温度界定为94-95℃有其道理，一方面这一温度接近DNA聚合酶能承受的极限，充分发挥了酶的耐热特性；另一方面在该温度下几乎所有的原始模板和不同长度的扩增产物均能被充分解链从而使整个扩增过程得以完成。正因为如此，十几年来从未有文章对普遍地使用如此高的变性温度是否有必要，是否合理和是否能作大幅度调整表示怀疑。
变性温度上限受DNA聚合酶的热稳定性所制约，DNA聚合酶的半衰期随温度升高而降低，温度高于90℃时半衰期急剧下降。以极耐热的被普遍应用的Taq酶为例，当温度为92.5，95或97.5℃时其半衰期分别为130，40或5分钟左右，通常每一循环的变性持续时间为30秒钟，显然，如果变性温度超过97℃则经过几个循环以后Taq酶的活力就会显著下降，难以完成30个左右循环的扩增。
变性温度的下限则受原始模板DNA和扩增产物解链温度(Tm)所制约。通常PCR扩增产物的长度为150-800碱基，它们在标准PCR反应液中的解链温度通常在85-92℃之间。如果变性温度较低原始模板或扩增产物的双链不能解开从而无法完成扩增过程。
为了能使有某种良好特性但耐热性较差的DNA聚合酶可以应用于PCR，九十年代初曾发展了在PCR反应液中添加高浓度化学变性剂的方法(Nucleic Acid Research，1999.Vol.27(6)1566-1568)，例如添加10-50％的甲酰胺，40％的甘油或5.5M的脯氨酸等，高浓度变性试剂使DNA的解链温度显著降低，从而可以在70℃左右完成变性步骤。但是，高浓度变性剂使反应体系中所有的DNA包括原始模板，目标扩增产物，非专一扩增产物和引物的解链温度都大大降低，因而退火温度和延伸温度必须作相应的大幅度下降，而且高浓度的化学变性剂不仅抑制DNA聚合酶活力，也改变了PCR反应液的比重，粘度和传热特性等，对PCR反应的专一性和效率等均有显著而复杂的负面影响。所以，这种方法除了能使耐热性较差的DNA聚合酶可以用于PCR以外，并没有其他令人兴趣的有实质性价值的优点。近年来具有各种良好特性又能耐高温的DNA聚合酶正在不断出现，所以应用高浓度化学变性剂来降低变性温度的方法无论在科学研究还是临床检验上都未能推广。
本发明在回顾检讨PCR方法的原理和分析变性步骤的作用和机制的基础上对传统的变性步骤方法提出了大幅度修正和改进，扩展了PCR反应的变性温度范围，可降低至60-87℃，带来了特殊的技术效果。
发明内容
所要解决的技术问题本发明所要解决的技术问题是提供一种超低变性温度聚合酶链式反应方法及其应用，以突破现有PCR方法中模板变性温度的常规，克服常规PCR反应不能利用变性温度的调节来排除非专一性扩增产物以及排除假阴性结果的缺陷。
发明构思本发明的原理和构思归纳如下
第一，首次模板变性和最初2个循环的变性温度仍为94-98℃。经首次变性和第一循环变性步骤，承载目标扩增产物的原始模板被解开成二条全长的单链，在与引物退火并延伸完成第一循环后得到二对不完整的双链，每一对由一条全长原始模板链和一条半长扩增链组成。在第二循环的变性步骤中二对不完整的双链被解开得到四条单链，与引物退火并延伸完成第二循环后得到四对不完整双链，其中二对与第一循环后产物相同，另二对由半长扩增链和目标扩增链组成。原始模板和第一循环形成的“半扩增产物”的分子量通常很大，它们的解链温度均较高而且难以估算和测试，采用现有的变性温度94-95℃能使绝大多数原始模板和半扩增产物解链。鉴于TaqDNA聚合酶在97.5℃下的半衰期仍有5分钟，为了保证原始模板和“半扩增产物”能很快地充分解链，首次变性温度和最初2个循环的变性温度范围可扩展至94-98℃。当变性温度大于96℃时变性时间可缩短为1-15秒。
第二，最初二个循环之后反应的变性温度采用超低的60-87℃。第一轮目标扩增产物形成后，这些单链DNA将作为模板参与扩增，使产物不断按指数方式累积。原始模板和“半扩增产物”能继续作为模板参与扩增，但随着PCR的进程它们在目标扩增产物累积中的作用已越来越无足轻重。所以，PCR的其余循环的变性温度只需要满足目标扩增产物的解链而不必考虑原始模板和半扩增链的变性，而目标扩增产物的解链温度可以根据其长度，碱基组成和顺序来估测，计算和或由试验测定。
第三，超低变性温度的PCR反应可用于去除非专一产物的原理。人基因组总共约含30亿对碱基，而18个碱基寡核苷酸的排列组合数达700亿(418)，据此推算出现与含18碱基引顺序完全匹配的DNA片段的几率已非常小。但是，即使采用25碱基或更长的引物，非专一扩增产物也常常出现，这是因为虽然样品中几乎不可能存在目标基因之外的任何与正，反引物均完全匹配的DNA片段，但却可能存在若干或许多与正，反引物顺序均有较高匹配的DNA片段，在不十分严谨的退火温度下引物能与甚至有严重错配的DNA片段结合，从而导致非专一产物形成。在最初2个循环中形成的第一轮非专一扩增产物的上游和下游端顺序已分别与引物完全互补，此时，即使提高退火温度也无法阻止非专一产物继续扩增。如果非专一产物的原始模板浓度较高或非专一产物的长度较低等各种原因，非专一产物的扩增效率可能比目标扩增产物还高而在扩增产物中占优势。当变性温度为94-95℃时，几乎所有的非专一产物都能解链完成变性步骤继续循环。如果将变性步骤的温度限定在只比目标扩产物的解链温度略高，则那些解链温度较高的非专一扩增产物就因不能完成解链过程而流产。
第四，当产物长度小于400碱基时，选择到低于87℃变性温度的目标产物是完全可行的方案。PCR扩增产物长度通常范围为150-800碱基，本研究表明在此范围尤其是在150-400碱基长度范围内，DNA的解链温度因其碱基组成成份和排列顺序的不同而有较大的差异，以200碱基长扩增产物为例，在随机选择的22个DNA片段中，最低者解链温度77.2℃，比平均解链温度低8.7℃，比最高者低16.4℃。所以，在此范围内对每一个既定的长度都有机会选择到解链温度较低的目标扩增产物。选择的目标扩增产物解链温度越低，通过控制变性步骤的温度而流产的非专一扩增产物就越多。
第五，当产物长度小150碱基时，变性温度大大降低。在PCR的许多应用中如基因表达分析和病毒感染检测对PCR产物的长度没有任何限制，即可以应用短于150碱基的短扩增产物。当扩增产物长度低于150碱基特别是低于70碱基时，DNA的平均解链温度随长度减短而急剧下降，最高与最低解链温度的差距则随链长降低而增大，所以选择短扩增产物的超低变性温度PCR方法具有更强的潜力和更特出的优点。例如，当扩增产物长度分别小于200，120或70碱基时扩增产物的最低解链温度可分别低于80，75和70℃，可以在分别比80，75或70℃略高的温度下完成变性。
第六，实际应用过程中应将变性温度作为指标之一选择合适的引物。扩增产物的长度和包括解链温度在内的各项特性是由引物对所决定的，以往的研究中从未把扩增产物的解链温度作为选择引物的考量之一，各种引物设计软件都没有把扩增产物的解链温度作为判别引物严谨性的一个指标。但是，即使应用普通的引物设计软件，也就是说在没有考虑扩增产物解链温度对引物严谨性贡献情况下，用引物设计软件自动搜寻到的高严谨性引物中，均出现一定比例的引物，用这种引物所得到的扩增产物的解链温度显著低于该长度扩增产物的平均解链温度，所以低变性温度PCR方法是有价值的，也是普遍可行的。
第七，当扩增产物长度为400-1000碱基时，仍可选到使扩增产物变性温度低于87℃的引物，且在相应PCR反应中可去除非专一性产物。用同样的方法分测试22个从30-2000碱基长扩增产物的平均解链温度，最低解链温度和最高解链温度，结果表明当扩增产物为30-200碱基时，最低解链温度比最高解链温度低约16-30℃。从不同长度的DNA片段的解链温度分布能清楚地显示，如果扩增产物长度已定为400-1000碱基，很容易选到一些引物对，其扩增产物的解链温度略超过80℃，在相应的变性温度下绝大多数400碱基以上的非专一产物和部分400碱基以下的非专一扩增产物将因其解链温度较高不能完成变性而流产。如果对扩增产物长度没有预设限制，很容易选择到引物使目标扩增产物长度小于200碱基而解链温度比75℃略高，采用相应变性温度能就能使大多数不同长度的非专一扩增产物流产。如果目标扩增产物长度小于70碱基，很容易找到引物使扩增产物的解链温度接近70℃甚至低于70℃，这种情况下非专一扩增产物几乎可完全被排除。当然，在人基因组的几十亿个碱基对中总是存在一些约70碱基长的DNA片段，其解链温度也在70℃左右，但是，可以相象在这些片段里要同时与二个引物均高度匹配的几率是微乎其微的。
第八，由于在短距离内二个引物均能退火的非专一产物几乎不可能，故超低变性温度PCR方法能有效的控制非专一扩增产物形成。PCR每一循环包括变性，退火和延伸三个过程缺一不可。标准PCR方法在94-95℃变性，这对使样品中的原始模板DNA充分解开很有必要，因为无论是基因组DNA还是互补DNA，一般需要在94-95℃才能充分解开。但是，对很多扩增产物没有必要在随后的循环中继续使用94-95℃变性，因为大多数小于1,000碱基的扩增产物往往能在94℃以下的温度完成变性。按标准PCR方法，在最初三个循环形成的扩增产物包括目标扩增产物和非专一扩增产物都能继续在随后的循环中完成变性，退火和延伸，直至反应结束。本发明选用的引物的扩增产物解链温度很低，在随后的低变性温度的几十个循环中能完成变性，但是大部分在最初三个循环中形成的非专一扩增产物，因其解链温度较高而不能在随后的循环中完成变性，这些非专一扩增产物就被流产。选择的目标扩增产物越短或解链温度越低，可实施的变性温度就越低，可通过变性温度来排除的非专一扩增产物就越多，这就为减少临床诊断中因病毒细菌的顺序的多变性而造成的假阴性带来契机。应用超低变性温度时，PCR反应可以在比最高允许退火温度低十几度的情况下完成扩增而无任何非专一扩增产物干扰。
为了说明本发明的原理和方法，我们以长4000余碱基的人CyclinDl基因(基因库编号NM_053056)为例，借助引物设计软件Oligo对DNA解链温度等一些数据进行了分析，每个数据是22个计算值的统计结果(表1)。
表1.不同长度DNA的解链温度
技术方案本发明的超低变性温度聚合酶链式反应方法依次包括如下步骤模板变性；引物退火；DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；按上述三步骤循环进行扩增反应，在不添加任何化学变性剂的前提下，模板变性温度在前2或3个循环为93-98℃，在后续的循环中为60-87℃，优选范围70-82℃。
本发明的超低变性温度聚合酶链式反应方法采用的扩增反应产物长度为40-1000碱基，优选40-400碱基。
所说的超低温变性温度聚合酶链式反应方法在原始模板与产物的变性温度之差为7-28℃的反应条件下，用于有效地排除非专一性扩增产物，优选的原始模板与产物的变性温度之差为10-20℃。
所说的超低温变性温度聚合酶链式反应方法在原始模板与引物有1-5个碱基的错配且产物解链温度为60-87℃情况下，用于有效地排除假阴性结果，特别在原始模板与引物有1-3个碱基的错配的情况下，排除假阴性结果的效果更为理想。反应中采用引物与模板退火的温度范围为32-65℃，优选的温度为46-58℃。
实现本发明的关键之一是应用引物设计软件自动搜寻优秀引物，或者借助引物设计软件所显示的目标基因序列的Tm图谱来初选引物的区域，并用软件分析候选引物特性，然后人为确定。前一种方法适合于设计扩增产物小于100碱基的引物，后一方法适于设计扩增产物大于100碱基的引物。
与标准PCR方法选择引物的通用标准一样，本发明所选引物应具有高的严谨性，即低的3’端碱基互补，低的发夹结构，低的错配结合强度和高的专一结合强度。引物本身长度范围相当宽可在12-50碱基之间。而本发明所选引物的首要特征是扩增产物的解链温度在60-85℃之间，优选72-80℃。
本发明降低变性温度的方法与添加化学变性剂方法在原理上各异但应用上能兼容，在需要的情况下添加低浓度化学变性剂可以使变性温度范围在本发明基础上进一步下降，同时又保持本发明的优点。
本发明的PCR反应的各种参数与标准PCR基本相同。循环数通常为20一45。PCR反应最初2或3个循环的变性温度为94-95℃，经过这个常规变性温度循环，最初的目标扩增产物已形成。本发明的区别在于在随后的约20-45个循环中将变性温度降为60-87℃，具体实施温度取决于目标扩增产物的解链温度。变性步骤温度应比此温度略高，变性温度越接近解链温度，PCR反应的专一性越好。
本发明所采用的模板DNA为cDNA，由人肌肉组织总RNA(Clontech公司)利用cDNA制备试剂盒(Clontech公司Advantage RTfor PCR kit)制备，所用引物为试剂盒提供的Oligo(dT)18，PCR体积10μL，每管加1μL 1μg/1λRNA。
本发明的PCR反应均采用Clontech公司Advantage 2试剂盒，引物终浓度为0.5μM。
有益效果超低变性温度聚合酶链式反应方法不仅使传统PCR方法的简单，快速，专一和灵敏等几项特性都得到改进和发挥，而且拓展了PCR方法的功能和应用。
超低变性温度PCR方法的另一特出优点是使PCR反应的时间大大缩短。第一，本发明的变性温度为60一87℃，优选72-82℃，而退火温度范围与标准PCR相同，以退火温度55℃变性温度75℃为例，每一循环的温差为20℃。与原来的温差40℃(95减45)相比，坡道时间可节约一半。第二，本发明的变性温度控制在比目标扩增产物解链温度略高，在采用小反应体积传热过程迅速的前提下，变性时间只需要一秒，比通常的15秒至1分钟省了几十倍。第三，超低变性温度PCR方法的扩增产物大多较短，可以在坡道和一秒钟的延伸时间内完成扩增，与通常的延伸一分钟相比也节约了几十倍。本发明的实施例都能在15分内完包括30个循环的PCR，而标准PCR方法通常需一至一个半小时。
除了最初三个循环超低温度PCR分方法的其他循环的变性温度低于87℃，显然，Taq聚合酶的活力在反应前后活力保持稳定，有利于进一步进行套嵌PCR。也有利于整个反应的稳定性。
应用方面，对PCR反应过程的机制分析和我们的实际试验表明，超低变性温度PCR方法具有极大的优越性。本方法能通过控制退火温度和控制变性温度双重机制有效地阻止或完全消除非专一扩增产物的形成，而非专一产物形成在标准PCR方法中随处可见，往往是令PCR科学研究和临床分析人员深感头痛的问题。下面的试验实例表明超低变性温度方法能有效地控制非专一产物的形成，在这些例子中，即使采用非常低的退火温度，即在放宽退火温度控制的情况下也不形成任何非专一扩增产物。
具体实施例方式
实施例1.
超低温变性PCR引物设计的可行性。
我们用引物设计软件Oligo以乙型肝炎病毒基因、人肌动球蛋白基因和人甘油醛3-磷酸-脱氢酶基因为例，测试能扩增产100碱基以下短产物的目标引物的出现频率，结果表明对每一个测试基因的每一个长度，都可以搜寻到几十至几百对具有高严谨性的优秀引物，而且其中30-80％的引物的扩增产物的解链温度小于80℃，表2列述对人肌动蛋白球基因测试的结果。
表2在人肌动蛋白球基因中找到的优秀引物对数
表2说明超低变性温度PCR方法能普遍用于小于100碱基产物的扩增。对于100-150碱基的产物也部分适用，其平均解链温度在83℃-87℃，最高与最低解链温度之差在10度以上，提示找到一些引物其扩增产物的解链温度在80℃以下是普遍可行的。
实施例2.
超低温变性PCR引物设计实例。
利用Oligo引物设计软件以人肌动球蛋白基因全基因序列为例设计下列引物。(设计结果见表3)表3.人肌动球蛋白基因序列为例设计超低温变性PCR的引物
实施例3.
对实施例2所设计的引物对进行超低温变性PCR反应。
反应条件为先95℃变性60秒，62℃(对于9A1、9A2、9A5和9A6)或者45℃(对于9A3和9A4)退火并延伸5秒进行2或3个循环；再68-82℃变性5秒，62℃(9A1、9A2、9A5和9A6)或者45℃(9A3和9A4)退火及延伸5秒，共25个后续循环。结果见表4。
表4.超低温变性PCR反应结果
+表示阳性结果；-表示阴性结果；±表示弱阳性结果。
实施例4.
超低温变性PCR在排除非专一性产物中的应用。
用引物设计软件Oligo设计的正常长度HBV引物，任选2对如下(5′-3′)9A8 5′CCT CAT CAT CCT GCT GCT ATG CC 产物解链温度85.5℃9A8 3′GGG GAA AGC CCT ACG AAC CAC TG 产物长度315
9A9 5′TCA AGG TAT GTT GCC CGT TTG TC产物解链温度84.1℃9A9 3′CGA ACC ACT GAA CAA ATG GCA 产物长度251将上述9A8和9A9与9A1-9A6同样以如下条件反应先95℃变性60秒，45℃退火15秒，62℃延伸15秒进行2或3个循环；再85℃变性5秒，45℃退火15秒，62℃延伸15秒，共25个后续循环。
结果显示低温退火条件下，常规变性温度的9A8和9A9反应均有大量的非专一产物而无315bp和251bp正常产物；相反，在9A1-9A6仍能获得预期长度的正常产物。
实施例5.
超低温变性PCR在排除假阴性中的应用。
采用引物分析软件Oligo对预先设计的人肌动球蛋白基因引物对(表5)作性能分析(表6)，以及实际PCR反应试验(表7)均表明当引物与目标模板顺序最多有5个错配时仍能专一地扩增目标产物，即用一个引物可以应对各种不同的，含多个顺序突变的变种。
表5.人肌动球蛋白基因序列上设计的带有错配的引物对
表6.引物分析软件Oligo对人肌动球蛋白基因引物对的性能分析
表7.人肌动球蛋白引物对在不同退火延伸温度下的超低变性温度(72℃)PCR反应试验结果
反应条件先95℃变性15秒，46-66℃或32-46℃退火及延伸15秒，共3个循环；再72℃变性15秒，46-66℃或32-46℃退火及延伸15秒，共25个循环。
结论(1)完全匹配引物可在65℃左右高温下退火完成扩增；(2)一个引物完全匹配而另一引物有1-4个错配，与模板专一结合强度在192-248点，仍能在约54-58℃下退火完成扩增；(3)一个引物完全匹配而另一个引物有5个错配，与模板专一结合强度为165点时，还能在36℃左右退火完成扩增；(4)当一对引物都有1-5个错配，也都能完成扩增，最高允许退退火温度比一个引物完全匹配时略低；(5)在上述低温度退火下，仍均只形成目标扩增产物。
权利要求
1.一种超低变性温度的聚合酶链式反应方法，依次包括如下步骤(1)模板变性；(2)引物退火；(3)DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；(4)按步骤(1)-(3)循环进行扩增反应；其特征在于，模板变性温度在前2或3个循环为93-98℃，在后续的循环中为60-87℃。
2.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于后续的循环中模板变性温度为70-82℃。
3.根据权利要求1或2所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于扩增反应产物长度为40-1000碱基。
4.根据权利要求1或2所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于扩增反应产物长度为40-400碱基。
5.权利要求1所述的超低变性温度聚合酶链式反应方法在排除非专一性扩增产物中的应用，其特征在于原始模板与产物的解链温度之差为7-28℃。
6.根据权利要求5所述的聚合酶链式反应方法在排除非专一性扩增产物中的应用，其特征在于原始模板与产物的解链温度之差为10-20℃。
7.权利要求1所述的超低变性温度聚合酶链式反应方法在排除假阴性结果中的应用，其特征在于原始模板与引物有1-5个碱基的错配且产物解链温度为60-87℃。
8.根据权利要求7所述的聚合酶链式反应方法在排除假阴性结果中的应用，其特征在于原始模板与引物有1-3个碱基的错配。
9.根据权利要求7所述的聚合酶链式反应方法在排除假阴性结果中的应用，其特征在于引物与模板退火的温度为32-65℃。
10.根据权利要求7或8所述的聚合酶链式反应方法在排除假阴性结果中的应用，其特征在于引物与模板退火的温度为46-58℃。
全文摘要
本发明涉及一种聚合酶链式反应的方法及其应用。提供了一种在超低变性温度下进行PCR反应的方法，采用的模板变性温度在前2或3个循环为93－98℃，在后续的循环中为60－87℃，大大低于常规的94－96℃的变性温度，实验发现该方法不但同样可以成为一种普遍应用的PCR，而且利用超低温下模板的选择性变性来控制反应的专一性，使本发明在排除非专一性扩增产物和排除假阴性结果中有着独特的作用，具有广泛的应用前景。
文档编号C12P19/34GK1508257SQ0215518
公开日2004年6月30日 申请日期2002年12月18日 优先权日2002年12月18日
发明者徐定邦, 朱德芬, 林先贵, 徐文慧 申请人:徐定邦, 徐文慧