专利名称：一种扩增超短产物的聚合酶链式反应方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术，特别是涉及一种聚合酶链式反应的方法及其应用。
背景技术：
聚合酶链式反应是一种高效的扩增特定DNA的方法，在生物医学的各个领域特别是临床诊断上有广泛的应用。聚合酶链式反应有许多参数包括反应液组成成分，反应液体积，反应的变性，退火和延伸温度时间等，其中，PCR反应扩增产物长度也是参数之一。扩增产物长度取决于引物的选择，一旦引物确定扩增产物的长度也就确定了。从历来的研究看引物的设计是PCR的关键，但是对引物的选择上集中在分析引物本身的长度，GC碱基比，3’端互补碱基数，发夹结构强弱等方面，而把扩增产物的长度的选择放在一个很次要，从属的地位。几乎所有的引物设计软件都没有把扩增产物的长度与引物的严谨性联系起来。PCR扩增产物长度通常在150-1000碱基。近年来关于长距离PCR(LD-PCR〕的研究日趋增加，适合扩增长产物的PCR试剂盒也陆续出现，在合适条件下已能扩增出几千至几万碱基长的产物。相对于长产物的扩增研究，对短产物的扩增研究似乎还是一片空白。在PCR发明至今的各种有关教科书和实验指南无一例外地指出扩增产物长度在150碱基以上。被广泛应用的引物设计软件Oligo也把扩增产物150碱基作为预设的引物搜寻范围的下限。这些充分说明现有PCR技术形成了产物长度大于150碱基的常识，尚未有专门针对小于150碱基产物的PCR反应进行研究，并且指明扩增短产物带来的特殊技术效果。本发明突破现有技术常规，经过对短扩增产物的解链温度等方面的计算，分析和试验，发现扩增短产物可以成为一种普遍应用的PCR方法，具有标准PCR方法所不具备的优点，在检测扩增产物污染(carryover)方面有独特的应用价值。
发明内容
所要解决的技术问题本发明所要解决的技术问题是提供一种扩增超短产物的聚合酶链式反应方法及其应用，以突破现有PCR方法中扩增产物长度的常规，克服常规PCR反应不能用于区分扩增产物污染的假阳性的缺陷。
发明构思本发明的原理是鉴于一个双链DNA片段的解链温度主要取决于其长度但又和其硷基组成和排列密切有关。当扩增产物长度小于150硷基特别是小于100碱基时，其平均解链温度随链长度减少而显著降低，因而很容易找到引物其扩增产物的解链温度在68-85℃之间，这种扩增产物能在比68-85℃略高的温度下完成变性步骤。我们以长度3000余硷基的乙型肝炎病毒全顺序为例，用引物设计软件随机测试分析了不同长度扩增产物的解链温度(随机方法是在全顺序的1，201，401，601......位分别取长度为30，40，60......的扩增产物各20个左右进行分析〕结果列于表一，统计数据表明当扩增产物长度为30-100硷基时，其平均解链温度从72℃升至83℃，而最低解链温度都低于76℃。
超短产物PCR方法为鉴别含基因组DNA的样品中是否存在扩增产物污染提供了简单而有效手段。由污染导致的假阳性是临床PCR检验中的大问题，而要判别确认扩增产物污染也较麻烦。应用超短产物PCR方法，如果样品中不存在扩增产物污染，则必须有至少最初的2个常规变性温度的循环，才可能得到目标扩增产物；反之，如果在超短产物PCR全部反应过程中均应用较低变性温度的情况下，也能得到扩增产物，说明样品有滞后污染。所以在正常检测的同时，做一个PCR反应全程采用低变性温度的对照试验便能作出判断。
技术方案本发明基于常规的聚合酶链式反应方法，依次包括如下步骤模板变性；引物退火；DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；以及前述步骤的循环。不同之处在于扩增反应产物长度为24-150碱基，优选在24-100碱基范围内，具有最佳效果的长度范围为40-70碱基。产物DNA小于100碱基，平均解链温度显著下降，更明显取决于碱基长短和组成。
扩增产物的长度由引物对决定，本发明用引物设计软件用自动方法搜寻，也可利用引物设计软件显示的各种图谱用人工方法搜寻。引物本身长度范围为11-40碱基，优选范围18-30碱基。
超短扩增产物PCR方法的反应条件见表1。最初的2个循环的变性温度按常规，后续循环的变性温度68-96℃，优选72-80℃。超短扩增产物PCR方法的退火温度范围在40-65℃之间，优选实施温度55-65℃，延伸温度范围为45-72℃，优选实施温度55-65℃。
表1.超短扩增产物PCR反应循环条件
采用超短引物进行所说的聚合酶链式反应，使变性温度可以低于常规的94-95℃。将模板样品分别以94-95℃和68-87℃两种变性温度进行最初2个循环的反应，可显著区分待测DNA样品中的模板是长链DNA还是先前扩增产物带来的片段污染，长链DNA在94-95℃可解链，而68-87℃下无法变性，而污染片段在94-95℃和68-87℃两种变性温度均可扩增出阳性结果。所说的超短产物聚合酶链式反应方法在区分基因组DNA和cDNA的检测中同样有其独特应用，设计超短产物的相应引物，将模板样品分别进行2个PCR(1)以94-95℃变性温度进行最初2个循环，后续循环68-87℃变性；(2)以94-95℃变性温度进行最初1个循环，后续循环68-87℃变性。
由于基因组DNA在94-95℃可解链，而68-87℃下无法变性，故基因组DNA必须至少有2个高温变性循环，才可完整扩增；而用基因专一的反引物进行反转录得到的互补DNA(cDNA)只需1个高温变性循环即可完整扩增。即基因组DNA在反应(1)中呈阳性，反应(2)中呈阴性；cDNA在反应(1)和(2)中均呈阳性。
本发明所采用的模板DNA为cDNA，由人肌肉组织总RNA(Clontech公司)利用cDNA制备试剂盒(Clontech公司AdvantageRT for PCR kit)制备，所用引物为试剂盒提供的Oligo(dT)18，PCR体积10μL，每管加1μL 1μg/1λcDNA。
本发明的PCR反应均采用Clontech公司Advantage 2试剂盒，引物终浓度未指明则为0.5μM。
有益效果本发明的有益效果归纳如下1超短扩增产物PCR方法可将通常PCR反应循环的退火和延伸合为一步。
本发明PCR的扩增产物仅24-100碱基，而引物本身长为12-40碱基，所以实际上只需要延伸12-80碱基左右。因为Taq聚合酶在22，37，55或70℃的延伸速度分别为每秒0.25，1.5，22或60个以上核苷酸，所以在使用本发明的通用退火温度范围40-65内，能在几至几十秒的时间内完成延伸，不必像标准PCR方法那样在退火步骤后将温度提高到70℃左右Taq酶的最适作用温度范围维持一段时间。所以，超短扩增产物PCR方法每一循环只需要变性和退火延伸二步。
2反应快速。
标准PCR的退火和延伸步骤通常共需1分半钟，变性时间通常为30秒种，以使解链温度较高的扩增产物能在94-95℃下充分解链。本发明的超短扩增产物的解链温度极低，而变性温度控制在比解链温度略高，在采用反应液10微升的条件下，本发明的变性时间仅为1秒钟。本发明的变性温度在70-85℃之间，而退火延伸温度50-65℃与标准PCR相同。标准PCR的变性温度在94-95℃之间，所以本发明方法的变性温度与退火温度之差为5-35℃，而标准PCR的此值为30-45℃，以退火温度55℃为例，本发明每一循环的坡道时间比标准PCR可节约25-60％。由于扩增产物较短，完成延伸的时间也可缩短至几秒或仅利用坡道时间来完成。在以下的试验例中，都能在15分钟内完成30个循环的PCR反应，是标准PCR方法所需时间的四分之一以下。
3.聚合酶用量可大大降低PCR反应聚合酶的最少用量需考虑二点，其一，随着反应循环的进行酶活力缓慢下降，酶的用量通常留有余地。其二，在反应液中的浓度为每100微升5U，以Taq酶的比活力每毫克蛋白20,000U和分子量为98KD可以计算，在PCR反应的前期，酶分子的数量远远超过扩增产物分子数量，当PCR进入后期，在标准PCR条件下，一个酶分子在一段延伸时间内可催化的产物分子数＝酶催化速率(Nt/秒)×催化时间(秒)÷产物长度(Nt)，而同样条件对于超短产物来说，在一段延伸时间内可催化的产物分子数大大提高，对酶浓度的要求大大降低。另外，本发明使PCR反应速度大大提高，整个反应过程缩短，且反应温度显著下降，都使聚合酶用量可有所降低。
4.扩增产物短于150碱基，使得PCR反应在低于80℃乃至低于70℃的条件下进行，故对DNA聚合酶的耐热性要求降低，大大扩展了DNA聚合酶种类的选择范围。
5.酶分子在反应过程中失活量减少，也提高了整个反应过程的稳定性，可使PGR反应循环数超过通常的30-35个循环。
6.专一性提高扩增产物短于150碱基，产物变性温度低，不仅可以通过引物与模板顺序匹配，用退火温度来限制非专一产物，又通过变性温度来阻止非专一产物的正常解链，使其不能达到单链结构而阻止其进一步扩增。
具体实施例方式
实施例1.
验证超短扩增产物片段在设计上的可能性。
利用Oligo引物设计软件以乙型肝炎病毒(HBV)全基因序列为例测试扩增产物长度40-1000碱基的引物对的数量和典型引物对的解链温度特性。
表2显示不同长度扩增产物的解链温度分布的统计结果，数据表明当扩增产物长度在200-1000碱基时，扩增产物的平均解链温度随长度增加而增加，但变化趋势比较平稳；当扩增产物长度小于200碱基时，扩增产物的平均解链温度随长度减小而明显降低，最低解链温度显示同样的趋势。
按表2设计的PCR反应，采用的变性温度在最初2或3个循环为92-96℃，远高于各最高解链温度，在后续循环中以68-89℃变性，也可满足高于最低解链温度要求。证明在设计引物和产物上本发明的方案是可行的。
表2.以乙型肝炎病毒(HBV)全基因顺序为例不同长度扩增产物的解链/变性温度表2.以乙型肝炎病毒(HBV)全基因顺序为例不同长度扩增产物的解链/变性温度
实施例2.
验证超短产物的引物在设计上的可行性。
利用Oligo引物设计软件，以乙型肝炎病毒基因为例，测试分析了可以扩增超短扩增产物的优秀引物对的出现频率，结果表明在30-100碱基的的范围内的任一个长度，都可以搜寻到几十至几百对具有高严谨性的引物，其中，30-80％扩增产物的解链温度小于80℃。表3列述了对乙型肝炎病毒基因的分析结果。
表3在乙型肝炎病毒基因中找到的优秀引物对数
实施例3.
超短产物和引物设计实例。
利用Oligo引物设计软件以人肌动球蛋白基因全基因序列为例设计下列引物。(设计结果见表4)表4.人肌动球蛋白基因序列为例设计超短产物的相应引物
实施例4.
对实施例3所设计的引物对进行超短产物PCR反应。
反应条件为先95℃变性60秒，62℃(对于9A1、9A2、9A5和9A6)或者45℃(对于9A3和9A4)退火并延伸5秒进行2或3个循环；再68-82℃变性5秒，62℃(对于9A1、9A2、9A5和9A6)或者45℃(对于9A3和9A4)退火及延伸5秒，共25个后续循环。结果见表5。
表5.超短产物PCR反应结果
+表示阳性结果；-表示阴性结果；±表示弱阳性结果。
实施例5.
不同变性温度检测扩增产物片段污染中的应用。
采用实施例3中的引物对9A1-9A6进行聚合酶链式反应，模板中加入相应的扩增片段污染10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、10fg、10fg。将模板样品分别在95℃和79℃两种变性温度下15秒，62℃(对于9A1、9A2、9A5和9A6)或者45℃(对于9A3和9A4)退火并延伸5秒共25个循环。
结果显示以95℃变性的反应中，所有引物对无论是否有模板污染均能获得阳性结果，而79℃变性温度下仅带有扩增片段污染的模板获得阳性结果，未加污染片段的长链DNA都呈阴性(表6)。
表6.79℃变性温度下检测扩增产物片段污染
+表示阳性结果；-表示阴性结果；±表示弱阳性结果。
长链DNA在95℃高温变性下可解链，而在79℃下无法变性，而污染片段在95℃和79℃两种变性温度均可扩增出阳性结果，利用本方法方法可显著区分待测DNA样品中的模板是长链DNA还是先前扩增产物带来的片段污染。
实施例6.
在区分基因组DNA和cDNA的检测中的应用。
超短产物聚合酶链式反应方法在区分基因组DNA和cDNA的检测中同样有其独特应用，将实施例3设计的超短产物的相应引物对9A1-9A6针对基因组DNA和cDNA进行PCR，将模板样品分别进行如下2个PCR(1)以95℃变性温度15秒，62℃(对于9A1、9A2、9A5和9A6)或者45℃(对于9A3和9A4)退火并延伸5秒进行最初2个循环；后续循环79℃变性，62℃(对于9A1、9A2、9A5和9A6)或者45℃(对于9A3和9A4)退火并延伸5秒，共25个后续循环；(2)除最初循环为1个外，其余同(1)。
由于基因组DNA在94-95℃可解链，而68-87℃下无法变性，故基因组DNA必须至少有2个高温变性循环，才可完成扩增；而用基因专一的反引物进行反转录得到的互补DNA(cDNA)只需1个高温变性循环即可完成扩增。
实际PCR结果显示基因组DNA在反应(1)中呈阳性，反应(2)中呈阴性；cDNA在反应(1)和(2)中均呈阳性。
权利要求
1.一种超短产物的聚合酶链式反应方法，依次包括如下步骤(1)模板变性；(2)引物退火；(3)DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；(4)按步骤(1)-(3)循环进行扩增反应；其特征在于，扩增反应产物长度为24-150碱基。
2.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于扩增反应产物长度为24-100碱基。
3.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于扩增反应产物长度为40-70碱基。
4.根据权利要求1、2或3中任一项所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于引物长度为11-40碱基。
5.根据权利要求1、2或3中任一项所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于引物长度为18-30碱基。
6.根据权利要求1、2或3中任一项所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于反应最初2或3个循环变性温度为92-96℃。
7.根据权利要求1、2或3中任一项所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于后续反应从第3或第4个循环起，变性温度为68-96℃。
8.根据权利要求1、2或3中任一项所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于后续反应从第3或第4个循环起，变性温度为72-80℃。
9.权利要求1所述的超短产物聚合酶链式反应方法在检测扩增产物污染中的应用，其特征在于模板样品分别以94-95℃和68-87℃两种变性温度进行最初2个循环的反应。
10.权利要求1所述的超短产物聚合酶链式反应方法在区分基因组DNA和cDNA的检测中的应用，其特征在于将模板样品分别进行2个PCR(1)以94-95℃变性温度进行最初2个循环，后续循环68-87℃变性；(2)以94-95℃变性温度进行最初1个循环，后续循环68-87℃变性。
全文摘要
本发明涉及一种聚合酶链式反应的方法及其应用。提供了一种扩增超短产物的反应方法，获得的PCR产物长度为24到150碱基，大大低于常规的150－1000碱基，发现该方法同样可以成为一种普遍应用的PCR，在检测扩增片段污染中可以应用该方法排除产物污染带来的假阳性问题，并且，通过对照模板DNA在最初2个循环中以94－95℃和68－87℃两种变性温度进行反应的结果，可以明确地区分基因组DNA和cDNA。
文档编号C12P19/34GK1508258SQ0215518
公开日2004年6月30日 申请日期2002年12月18日 优先权日2002年12月18日
发明者徐定邦, 朱德芬, 陆德如, 徐文慧 申请人:徐定邦, 徐文慧