细胞的活化及扩增的制作方法

专利名称：细胞的活化及扩增的制作方法
背景技术：
发明领域本发明一般涉及刺激并活化细胞的方法，更具体而言，涉及活化并扩增细胞到很高密度以及扩增细胞到很高数量的方法。本发明也涉及细胞组合物，包括高浓度以及扩增到高数量的经活化及扩增的T细胞。
相关技术描述T细胞抗原受体(TCR)是一种多亚基免疫识别受体，和CD3复合物结合，并与抗原提呈细胞(APCs)表面的主要组织相容性复合体(MHC)I类和II类蛋白质提呈的肽相结合。TCR与APC上抗原性肽的结合，在T细胞和APC触点的免疫突触处发生，是T细胞活化中的重要事件。
为维持T细胞活化，T淋巴细胞一般需要第二共刺激信号。共刺激一般为T辅助细胞所必需，以产生足以诱导克隆扩增的细胞因子水平。Bretscher，Immunol.Today 1374，1992；June等人，Immunol.Today15321，1994。活化的抗原提呈细胞(APC)上B7家族配基(CD80(B7.1)或CD86(B7.2))的成员与T细胞上CD28结合时，发生主要共刺激信号。
刺激某些T细胞亚群扩增的方法，有可能产生多种用于免疫治疗的T细胞组合物。通过有效刺激，增加T细胞的反应性和数量，有助于成功的免疫治疗。
现有的扩增人T细胞的各种技术主要有赖于使用辅助细胞和/或外源生长因子，例如白细胞介素-2(IL-2)。IL-2已经与抗CD3抗体结合用于刺激T细胞增殖，主要扩增T细胞的CD8+亚群。据认为，理想的T细胞活化、扩增以及T细胞再输注后的长期存活需要这两种APC信号。由于APC相对短命，对于长期培养系统而言，要求以MHC相合的APC作为辅助细胞是一个重要难题。为此，长期培养系统必须连续不断地由来源获得和补充APC。为治疗辅助细胞受影响的免疫缺陷，必须重复供给辅助细胞，这很困难。此外，治疗病毒性感染时，如果辅助细胞携带病毒，长期培养期间该细胞则可能污染整个T细胞群体。
缺少外源生长因子或辅助细胞时，例如通过使细胞接触附着于固相表面、例如小球上的CD3配基和CD23配基，可以将共刺激信号传递给T细胞群体。参见C.June等人(美国专利5,358,358)；C.June等人WO 99/953823。虽然这些方法能够获得可用于治疗的T细胞群体，但在提高T细胞制品的强壮和容易方面尚不甚理想。
此外，本领域现有方法尚未关注T细胞的短期扩增、或获得更强壮的T细胞群体及其益处。另外，扩增T细胞的应用局限于只有少数病状。理论上，为使体内效率最高，离体或体内产生的活化的T细胞群体应当处于能够最大限度安排针对癌症、感染性疾病或其它病态的免疫应答的状态。本发明提供了产生数量增多的更高度活化、更纯的T细胞的方法，该T细胞具有表面受体及细胞因子生成之特征，较之其它扩增方法显得更为健康、天然。
此外，本发明提供任意靶细胞的细胞群体组合物，包括T细胞群体和产生该群体的参数，也提供其它相关的优点。
发明简述本发明提供了通过细胞表面部分连接来活化及扩增T细胞群体的方法，其包含a)提供其中至少一部分包含T细胞的细胞群体；b)该细胞群体接触一种表面，其中所述表面上附着有一种或多种与至少一部分T细胞的细胞表面部分相连并刺激该T细胞的因子(agent)，并且其中该T细胞在少于约两周后扩增到浓度约6×106-约90×106细胞/ml。在一个实施方案中，该T细胞来源于单一个体，并且该T细胞在少于约两周后从开始细胞数约100-500×106扩增到总计约100-500×109细胞。权利要求1的方法，其中所述T细胞在少于约两周后达到浓度约50×106细胞/ml。在一个实施方案中，该T细胞在约第7-12天达到浓度约40-60×106细胞/ml。在另一实施方案中，该T细胞在约第5-12天中约24小时扩增至少约1.5倍。在另一实施方案中，将该T细胞群体接种到容纳约0.1-约200升体积的培养容器中。在相关实施方案中，该培养容器包含至少一个进口滤器和一个出口滤器。在另一实施方案中，该T细胞群体按起始浓度约0.2×106-5×106细胞/ml进行接种。
在一个实施方案中，本发明的细胞扩增发生于密闭系统中。在一个实施方案中，该密闭系统包含一种含有至少一个进口滤器、一个出口滤器以及一个取样口的容器。在另一实施方案中，培养基通过该密闭系统进行灌注。在某些实施方案中，灌注在约第4-8天按约0.5ml/分钟-约3ml/分钟的速度开始。典型的培养基包括但不限于RPMI1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo20。在另一实施方案中，该培养基包含细胞因子，例如IL-2、IFN-γ、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-12、TGFR和TNF-α、或维生素。在另一实施方案中，该培养基包含表面活化剂、抗体、人血浆蛋白制品(plasmanate)或还原剂(例如N-乙酰半胱氨酸、2-巯基乙醇)。
在另一实施方案中，本发明的密闭系统包含位于可转动平台上的生物反应器培养容器。在某些实施方案中，该转动平台的速度和角度可变。在另一实施方案中，所述平台在约第3天按约5-15转/分钟开始转动。在另一实施方案中，该平台进一步包含可变的加热元件、磁体和气体歧管。在某些实施方案中，该密闭系统进一步包含注射器泵和控制器，用于进出该密闭系统的无菌传递。
在另一实施方案中，本发明方法提供了一种表面，其上附着有与T细胞的第一T细胞表面部分相连的第一因子，相同或第二表面，其上附着有与所述T细胞的第二部分相连的第二因子，其中所述第一与第二因子的连接可诱导该T细胞增殖。在相关实施方案中，该相同或第三表面上附着有与所述T细胞的第三部分相连的第三因子，其中所述第一、第二及第三因子的连接可诱导该T细胞增殖。在某些实施方案中，至少一种因子是抗体或抗体片段。在其它实施方案中，第一因子是抗体或其片段，第二因子是抗体或其片段。在另一实施方案中，第一和第二因子是不同的抗体。在某些实施方案中，第一因子是抗CD3抗体、抗CD2抗体、或抗CD3、抗CD2抗体的抗体片段，第二因子是抗CD28抗体或其抗体片段。在另一实施方案中，第一因子是抗CD3抗体，第二因子是抗CD28抗体。在另外的实施方案中，抗CD3抗体和抗CD28抗体按约1∶1-1∶100的比例存在。在某些实施方案中，第一因子是抗CD3抗体，第二因子是CD28的配基，例如天然配基B7。在另外的实施方案中，第三因子是抗体或其抗体片段。在另一实施方案中，第三因子是抗4-1 BB抗体或其抗体片段。
本发明还提供根据此处所述方法产生的T细胞群体。
本发明一方面提供一种装置，其包含一种含有至少一个出口滤器和一个进口滤器的密闭培养容器；所述密闭培养容器内部含有大量培养基，其中包含密度为约6×106-约90×106细胞/ml的扩增的T细胞。在某些实施方案中，该扩增的T细胞密度约10-50×106细胞/ml。在另外的实施方案中，该装置的培养基进一步包含一种表面，其中所述表面上附着有与T细胞的第一细胞表面部分相连的第一因子，相同或第二表面上附着有与所述T细胞的第二部分相连的第二因子。
本发明一方面提供了组合物，其中包含总计100×109的来源于单一个体的活化及扩增的T细胞。
本发明另一方面提供了通过细胞表面部分连接来扩增细胞群体的方法，其包含提供细胞群体；该细胞群体接触一种表面，其中所述表面上附着有一种或多种与至少一部分细胞的细胞表面部分相连并刺激该细胞的因子，并且其中该细胞在少于约两周后扩增到浓度约6×106-约90×106细胞/ml。在该方法的某些实施方案中，至少一部分所述细胞群体包含B细胞、NK细胞、树突状细胞、干细胞、肝细胞、神经元、间充质细胞、LAK细胞或肺细胞。
本发明另一方面提供通过细胞表面部分连接来扩增T细胞群体的方法，其包含提供其中至少一部分包含T细胞的细胞群体；所述细胞群体接触一种表面，其中所述表面上附着有与T细胞的第一细胞表面部分相连的第一因子，相同或第二种表面上附着有与所述T细胞的第二部分相连的第二因子，其中所述第一与第二因子的连接可诱导该T细胞增殖；与所述表面接触约0-5天的一段时间以后，将所述细胞群体按约0.2×106-5.0×106细胞/ml的浓度接种于密闭系统中，该密闭系统包含一种含有至少一个进口滤器和一个出口滤器的一次性生物反应器袋子；通过所述密闭系统按约1ml/分钟灌注培养基；在转动平台上按5-15转/分钟转动该生物反应器袋子；并且所述T细胞在少于约两周后可扩增到浓度约6×106-约90×106细胞/ml。
本发明还提供T细胞群体，其中所述T细胞正在增殖，并且其中所述群体的浓度约6×106-约90×106细胞/ml。在一个实施方案中，该T细胞群体在少于两周培养后达到总细胞数约100×109-约500×109。
参照以下发明详述及附图，本发明上述及其它方面将更为显而易见。
附图若干方面简述

图1比较了在有(XCELLERATE IITM)或没有(XCELLERATE ITM)磁性富集和刺激下，从约0.5×109T细胞开始，于第8天测定的活化及扩增的T细胞的总数。
图2比较了在有(XCELLERATE IITM)或没有(XCELLERATE ITM)磁性富集和刺激下，于第8天测定的活化及扩增的T细胞的扩增倍数。
图3代表CD154表达的流式细胞术分析，比较了在有(XCELLERATE IITM)或没有(XCELLERATE ITM)磁性富集和刺激以后预先培养8天的T细胞的再刺激。
图4代表培养3天后的CD154表达的流式细胞术分析，比较了有(XCELLERATE IITM)和没有(XCELLERATE ITM)磁性富集和刺激活化的细胞。
图5A-5B描述了利用XCELLERATE ITMPBMC(5A)或经冻融的PBMC(5B)起始XCELLERATE ITM过程的T细胞活化和扩增。
图6A-6B描述一个供体样品(PC071)的T细胞在XCELLERATE Ior IITM过程中活化以后，其CD25表达的时间过程分析。在第8天标记处进行再刺激，以刺激体内活化。图6A描述CD4+细胞的CD25表达，图6B描述CD8+细胞的CD25表达。
图7A-7B描述一个供体样品(PC071)的T细胞在XCELLERATE I或IITM过程中活化以后，其CD154表达的时间过程分析。在第8天标记处进行再刺激，以刺激体内活化。图7A描述CD4+细胞的CD154表达，图7B描述CD8+细胞的CD154表达。
图8A和8B图解说明人外周血T细胞在利用实施例IX所示方法经过抗CD3和抗CD28共固定化小球刺激之后的生长。
图9说明人外周血T细胞经过抗CD3和抗CD28共固定化小球+/-10u/ml重组人IL-2+/-单核细胞去除的刺激之后的生长。所有细胞在Baxter Lifecell培养瓶(300ml)中培养。放大实验是指扩大到BaxterLifecell 3升培养瓶中的300ml培养瓶培养物(无IL-2/单核细胞去除)。
图10说明由前向散射流式细胞术随时间测定的细胞大小的动力学分析。
图11A和11B表示经过抗CD3和抗CD28共固定化小球起始刺激以后，CD25随时间的表达。图11A代表CD4+细胞的CD25表达曲线，图11B代表CD8+细胞的CD25表达曲线。
图12表示在初级和次级刺激之后，由前向散射流式细胞术随时间测定的细胞大小的变化。
图13A和13B表示在初级和次级刺激之后，CD25随时间的表达。图13A代表CD4+细胞的CD25表达曲线，图13B代表CD8+细胞的CD25表达曲线。
图14A和14B是流式细胞术数据图，代表次级刺激之后的CD154表达，其中初级和次级刺激源不同。图14A代表CD4+细胞的CD154表达曲线，图14B代表CD8+细胞的CD154表达曲线。
图15是流式细胞术数据图，代表次级刺激后样品中所有扩增的T细胞的CD137表达。
图16A和16B是流式细胞术数据图，代表次级刺激之后的CD54表达，其中次级刺激源不同。图16A代表CD4+细胞的CD54表达，图16B代表CD8+细胞的CD54表达。
图17A-17D是流式细胞术数据图，代表从B细胞慢性淋巴细胞性白血病患者获得的T细胞经抗CD3和抗CD8偶联小球次级刺激之后，其细胞表型以及CD154和CD137表达。图17A和17B代表利用抗CD3和抗CD8偶联小球刺激后13天(17A)、利用抗CD3和抗CD8偶联小球初级刺激后18天、以及次级刺激后7天(17B)的样品中存在的CD4+和CD8+细胞。图17C和17D是流式细胞术数据图，代表从B细胞慢性淋巴细胞性白血病患者获得的细胞经次级刺激之后，其CD154和CD137表达。
图18A-18C表示正常供体T细胞经初级和次级刺激之后，其IL-2(18A)，干扰素γ(IFN-γ)(18B)以及IL-4(18C)随时间的表达。
图19A-19B表示经抗CD3和抗CD28偶联小球刺激之后，CD62L随时间的表达。
图20描述经抗CD3和抗CD28共固定化小球刺激之后，CD4或CD8细胞的百分比。
图21A-21B表示分别经抗CD3和抗CD28共固定化小球刺激并+/-利用实施例IX方法的再刺激之后，以CD25和CD154表达的平均荧光强度为函数的流式细胞术数据。
图22A-22B表示CD4和CD8亚群(22A)或CD4富集的群体(22B)的细胞在抗CD3和抗CD28共固定化小球刺激之前，其细胞CD154染色对比对照染色(例如背景)的流式细胞术分析。
图23A-23B表示利用抗CD3和抗CD28共固定化小球刺激外周血淋巴细胞之后，其培养基中TNF-α(23A)和IFN-γ(23B)的ELISA分析。
图24A-24B表示利用抗CD3和抗CD28共固定化小球刺激外周血淋巴细胞之后，其培养基中IL-4(24A)和IL-2(24B)的ELISA分析。
图25描述利用抗CD3和抗CD28共固定化小球刺激外周血淋巴细胞后并使用前向散射分析，T细胞的大小增加。
图26A-26L是条形图，代表CD62L表达(平均荧光强度，MFI)(26A)、CD49d(MFI)(26B)、CD25(MFI)(26C)、CD69(MFI)(26D)、CD154(MFI)(26E)、前向光散射(大小)(26F)、存活率(％活通道livegate)(26G)的流式细胞术数据；均经抗CD3和抗CD28共固定化小球刺激并在第8天经其再刺激以后。图26H-26L描述分别于刺激后4和8小时的CD62L、CD69、CD49d、CD154和CD25。
图27描述利用不同CD3∶CD28比例的抗CD3和CD28共固定化小球刺激之后，T细胞随时间的增加倍数。
图28是T细胞在静态系统与Wave Bioreactor中扩增的比较图。
发明详述在描述本发明之前，描述下文将用的某些术语的定义，将有助于其理解。
此处所用术语″生物相容性″，是指主要对活细胞无毒的特性。
此处所用术语″刺激″，是指通过细胞表面部分连接而诱导的初级应答。例如，就受体而言，此种刺激需要受体连接以及随后的信号转导事件。就刺激T细胞而言，此种刺激是指T细胞表面部分连接，在一个实施方案中随后诱导信号转导事件，例如结合TCR/CD3复合物。另外，该刺激事件可以活化细胞，并上调或下调分子的表达或分泌，例如下调TGF-β。因此，细胞表面部分的连接，即使缺少直接的信号转导事件，也可引起细胞骨架结构重组或细胞表面部分联合，其中每种都可以增强、修饰或改变后续的细胞应答。
此处所用术语″活化″，是指经过足以诱导显著的生物化学或形态学改变的细胞表面部分连接以后的细胞状态。就T细胞而言，此种活化是指T细胞已经被充分刺激到诱导细胞增殖的状态。T细胞的活化也可以诱导细胞因子生成、性能调节、或溶细胞效应子功能。就其它细胞而言，此术语意指或上调或下调特定的物理化学过程。
此处所用术语″作用力″，是指施于待刺激细胞的人工或外部作用力，可诱导细胞性浓集以及利用结合细胞表面部分的因子浓集细胞。例如，术语″作用力″包括大于重力(即，除重力之外，而不仅仅是重力)的任何作用力，可诱导细胞浓集和/或细胞表面部分聚集。此种作用力包括跨膜压(例如过滤)、流水冲蚀力、电力、声学作用力、离心力或磁力。理论上，使用的作用力可利用连接细胞表面部分的因子驱使目的靶细胞浓集。在多种环境内，作用力可以是脉冲式，即作用与再作用(例如，磁力可以关和开，脉动结合顺磁微粒的细胞群体)。
此处所用术语″同时″，是指细胞在附着有细胞表面部分结合因子的表面上天然浓集的情况，引起细胞互相之间以及细胞与表面配基(即因子)之间聚集。然而，使用术语″同时″并不排除靶细胞与附着有细胞表面部分结合因子的表面预先结合，因为在浓集表面上同时发生浓集和进一步配基结合。例如，就T细胞活化而言，T细胞可与一种表面接触，例如附着有抗CD3和抗CD28抗体的顺磁小球，随后通过磁场浓集。因此在这点上，虽然细胞和小球预先接触并连接，然而在细胞浓集期间发生了另外的连接。
此处所用术语″靶细胞″，是指意在通过细胞表面部分连接而刺激的任何细胞。
此处所用″抗体″，包括多克隆和单克隆抗体、灵长化类的(例如人源化的)、小鼠的、小鼠-人的、小鼠-灵长类的、以及嵌合的抗体；并可能是完整分子、其片段(诸如scFv、Fv、Fd、Fab、Fab′和F(ab)′2片段)、或完整分子和/或片段的多聚体或聚集体；可能天然存在或通过诸如免疫、合成或遗传工程产生；此处所用″抗体片段″是指来源于抗体或与抗体相关的片段，可与抗原结合，在一些实施方案中，例如通过引入半乳糖残基，可衍生出显示促进清除和吸收的结构特征。其中包括，例如F(ab)、F(ab)′2、scFv、轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)及其组合。
此处所用术语″蛋白质″，包括蛋白质、多肽和肽；可能是完整分子、其片段、或完整分子和/或片段的多聚体或聚集体；可能是天然存在、或通过诸如合成(包括化学的和/或酶促)或遗传工程产生。
此处所用术语″因子″、″配基″、或″结合细胞表面部分的因子″，是指结合指定细胞群体的分子。该因子可以结合任何细胞表面部分，例如靶细胞群体中存在的受体、抗原决定簇、或其它结合位点。该因子可能是蛋白质、肽、抗体及其抗体片段、融合蛋白质、合成分子、有机分子(例如小分子)等。在本说明书中并就T细胞刺激而言，以抗体作为这种因子的原型实例。
此处所用术语″结合细胞表面部分的因子″和″细胞表面部分″，用在配基/抗配基对的范围内。因此，这些分子应被视作表现特异性结合的一套互补/反互补分子，一般亲和力相对较高(亲和常数Ka约106M-1)。
此处所用″共刺激信号″，是指与初级信号、例如TCR/CD3连接组合引起T细胞增殖。
此处所用″配基/抗配基对″，是指表现特异性结合的一套互补/反互补分子，一般亲合力相对较高(亲和常数Ka约106M-1)。典型的配基/抗配基对，酶/抑制剂、半抗原/抗体、植物凝集素/糖类、配基/受体以及生物素/亲和素或链亲和素。在本发明说明书范围内，受体和其它细胞表面部分是抗配基，认为与其作用的因子(例如抗体和抗体片段)是配基。
此处所用″分离″，包括将一个组分从另一组分中基本上纯化出来的任何方法(例如利用过滤或磁性吸引)。
此处所用″静止″，是指其中细胞未活跃增殖的细胞状态。
此处所用″表面″，是指能使因子附着其上的任何表面，包括但不限于金属、玻璃、塑料、共聚物、胶体、脂类、细胞表面等。基本上是能够保持因子在其上结合或附着的任何表面。此处所用表面的原型实例是微粒，例如小球。
本发明一方面涉及以下惊人发现，即诱导细胞浓集的作用力、细胞表面部分连接以及在转动的密闭系统中培养细胞的组合，导致极大增强这些细胞的活化及扩增。此处所述原型实例使用T细胞。然而，本领域技术人员易于判断，本发明可广泛应用于希望其细胞表面部分连接或聚集、或这种连接可导致后续细胞信号事件(例如受体)的任何细胞类型。本发明可能通过利用包括脂质筏运(lipid rafting)和/或受体极化在内的现象起作用，而不希望受理论束缚。这类现象的相似之处在于，其提示或者通过包含细胞表面部分的脂质筏的聚集而开始/增强信号转导、或者因受体在细胞的一个、甚而几个区域的局部化(即极化)而增强信号转导。因此，这种细胞表面部分的连接不仅导致T细胞意外强烈的细胞活化和增殖，而且可用于放大许多细胞类型的信号转导事件。另外，仍不希望受理论束缚，本发明可能通过为扩增中的细胞提供最佳的通气起作用。因此，细胞表面部分连接与通过转动并灌注培养基通气相结合，导致T细胞意外强烈的细胞活化和扩增，达到出乎意外的高密度和绝对数量。因此，就T细胞而言，本发明提供了很多意料之外的优点，首先其使用“未包被”的微粒，因而不需要单独的去除单核细胞步骤，需要较少的细胞转移及试剂而简化了T细胞扩增，在活化过程中增强了T细胞活化水平，显著降低了获得供细胞治疗所需足量细胞的时间，降低了细胞处理的时间和劳力，降低了生产成本，提高了安排患者处理及输注的灵活性。
在本发明另一方面，利用其上结合或未结合配基/因子的第一种和另一种或更多表面。在该实施方案中，各种表面上可能附着有相同或不同因子，用于结合靶细胞的细胞表面部分。例如，顺磁小球上可能附着有靶细胞上受体的抗体，这种小球可能与包含靶细胞的细胞群体混合。此外，该细胞群体可能混合另一种或更多其上附着有相同或不同细胞表面部分结合因子的小球。经过作用力诱导富集，将小球和细胞集合在小体积中，从而放大信号。在另一实施例中，将其上附着有糖特异性因子或其它非受体细胞表面部分的顺磁小球与包含靶细胞的细胞群体混合。然后利用磁场将附着小球的细胞拉到其上附着有受体连接因子的另一表面。因而信号转导诱导因子处在第二种表面上。在另一实施例中，结合靶细胞的细胞表面部分的因子可能附着到大到足以保留在筛网或滤膜上的微粒，该微粒自身可能附着有配基。
如上所述，本发明提供了通过结合群体中细胞表面上的部分来刺激细胞群体的方法。细胞群体与结合细胞表面部分的因子(例如配基)接触，可以刺激该细胞群体。配基可能处于溶液中，也可能附着在表面上。细胞表面部分(例如受体)的连接，一般诱导特定信号途径。最近的研究提示，为发生信号，必须聚集临界浓度的、包含必要受体的脂质筏。例如，通过将特定细胞表面部分的配基附着到顺磁微粒上，使携带配基的微粒接触细胞，短时间后或同时施加作用力、例如磁场，以帮助连接的部分(例如受体)极化并使细胞在小体积中富集，从而体内或体外促进筏聚集。应用磁作用力富集细胞以及富集具有其上附着连接细胞表面部分的因子的表面的细胞，从而使细胞更好地接触配基，引起加速的、更有效的活化。本发明可能具有许多应用，例如，如果细胞受体的数目较少或功能异常，该方法可能足以在脂质筏中富集该受体，以克服这类缺陷并提供合适的信号活性。这类修正细胞表面部分的例子之一是某些类型的白血病患者，其在利用因子(例如抗CD3和抗CD28抗体)进行细胞表面部分刺激之前，几种正常细胞表面标志、例如CD3/TCR非常低。利用因子(例如抗CD3和抗CD28抗体)刺激这些细胞群体，使这些细胞的细胞表面标志回复到表现正常的水平，因而可以提供更强的免疫治疗产物，用于癌症治疗，回输患者后可提供更强、更快的免疫应答。在本发明其它应用中，可有效富集并活化细胞，包括诱导受体极化，从而使受体信号事件达到最大。这种应用的用途广泛，包括用于针对受体的筛选分析、或通过收集细胞表面的细胞筏诱导活化，例如通过连接肿瘤细胞的Fas或类似分子诱导凋亡。
在该筛选分析的一个例子中，人们可以使用携带G偶联蛋白质受体的细胞，接触可结合其上的因子，这些因子则与可利用作用力诱导富集的表面相结合。因此，由于受体筏运聚集，将放大信号转导事件。这在典型实验中水平极低的信号转导事件的研究中很重要，从而筛选抑制或以某种方式改变该信号转导事件的药物化合物。
细胞群体的刺激本发明方法涉及通过引入可结合细胞部分的配基或因子、诱导细胞事件，从而刺激靶细胞。配基或因子与细胞结合，可能触发依次活化细胞特定表型或生物学改变的信号途径。如此处所述，通过引入可结合细胞部分的配基或因子刺激靶细胞，可能上调或下调引起细胞特定表型或生物学改变的许多细胞过程。细胞活化可能增强正常细胞功能、或在异常细胞中启动正常细胞功能。此处所述方法提供了通过驱使细胞与可结合细胞表面部分的配基或因子一起富集而进行的刺激。通过引入可结合另一种细胞表面部分的另一种因子或配基，可增强细胞刺激、或刺激特定的细胞事件。该方法可用于连接细胞表面部分引发信号事件的任何细胞。本发明另外提供了选择或培养所刺激细胞的方法。所述原型实例是刺激T细胞，但本领域普通技术人员容易理解，本方法可用于其它细胞类型。例如，可以刺激并选择的细胞类型包括成纤维细胞、成神经细胞、肺细胞、造血干细胞和造血祖细胞(CD34+细胞)、间充质干细胞、间充质粗细胞、神经和肝祖细胞和干细胞、树突细胞、溶细胞性T细胞(CD8+细胞)、B细胞、NK细胞、其它白细胞群体、多潜能干细胞、多能干细胞、岛细胞等。因此，本发明还提供本方法得到的细胞群体以及具有不同表型特征的细胞群体，包括具有特定表型特征的T细胞。
如上所述，在本发明范围内可以利用各种细胞类型。例如，可利用诸如B细胞、T细胞、NK细胞、其它血细胞、神经元细胞、肺细胞、腺(内分泌)细胞、骨形成细胞(破骨细胞等)、生殖细胞(例如卵母细胞)、生殖器官内层的上皮细胞等细胞类型。细胞表面部分-配基对可包括(而不仅仅)T细胞抗原受体(TCR)和抗CD3 mAb、TCR和主要组织相容性复合物(MHC)+抗原、TCR和肽-MHC四聚体、TCR和超级抗原(例如葡萄球菌肠毒素B(SEB)、中毒性休克综合症毒素(TSST)等)、B细胞抗原受体(BCR)和抗Ig、BCR和LPS、BCR和特异性抗原(单价或多价)、NK受体和抗NK受体抗体、FAS(CD95)受体和FAS配基、FAS受体和抗FAS抗体、CD54和抗CD54抗体、CD2和抗CD2抗体、CD2和LFA-3(淋巴细胞功能相关抗原3)、细胞因子受体及其各自细胞因子、细胞因子受体和抗细胞因子受体抗体、TNF-R(肿瘤坏死因子-受体)家族成员及其抗体、TNF-R家族成员及其各自配基、粘附/归巢受体及其配基、粘附/归巢受体及其抗体、卵母细胞或受精卵母细胞受体及其配基、卵母细胞或受精卵母细胞受体及其抗体、子宫内膜上的受体及其配基、激素受体及其各自激素、激素受体及其抗体等。
配基与受体结合的本质将导致受体的多聚化、或受体聚集/定位，来上调、下调、加速、改善或改变信号发生或细胞应答，从而带来特别的益处，例如细胞分裂、细胞因子分泌、细胞迁移、增强的细胞-细胞相互作用等。
下文给出的两个例子说明，这种细胞表面部分的多聚化、聚集或受控重定位怎样具有特别益处。
在一个例子中，由抗原和抗原提呈细胞进行的正常T细胞活化，通常引起例如TCR筏富集、细胞骨架重组、″活化″信号的极化和细胞分裂。在缺少″正常″体内T细胞活化的情况下，利用如此处所述的人工方法，特别是通过加速、控制和空间定位TCR和CD28的连接，可以加速、改善、或影响上述功能。益处在于改善体外细胞扩增，得到可输注的更多、更强壮的细胞，用于治疗性应用。特别而言，本发明提供了使T细胞活化及扩增到很高密度(6×106-90×106细胞/ml)、从而产生很高细胞数(从单一个体起始细胞数约0.5×109细胞扩增出多达800×109细胞)的方法。其它益处在于可能改善诸如细胞表面TCR密度低于正常值的缺陷细胞的受体″聚集″。体内应用需要活化特异性T细胞群体、例如位于肿瘤部位的肿瘤特异性T细胞时同样有利。改善受体聚集和定位可提供功能性耐受的T细胞难以获得的活化信号。此外，这种活化可用在抗原特异性T细胞的范围内。在这方面，能够分离来自肿瘤的T细胞、扩增并输给患者。同样，在体内或体外暴露于抗原的T细胞可利用本方法进行扩增。
在另一个例子中，通过FAS途径改善了对细胞死亡的诱导。加速FAS多聚化、″活化″FAS在靶细胞表面上的空间定位、或促进累积的FAS连接(其无法实现)，这种能力可在体内提供了重要益处，特别是对于治疗癌症、自身免疫应答、或移植物抗宿主疾病。例如，肿瘤细胞可能体内表达低水平的FAS，宿主则可能(因抑制细胞因子等)在肿瘤部位表达低水平的FAS-L。因这些水平低，不能产生足够的FAS信号，而使肿瘤存活和生长。克服FAS/FAS配基缺陷的一种可能方法是，利用FAS的单价或多价配基(FAS-L、抗体等)结合顺磁微粒，来靶向肿瘤/肿瘤部位。由于顺磁微粒可结合肿瘤细胞上的FAS，在肿瘤部位(例如黑素瘤、Kaposi氏肉瘤、鳞状细胞颈癌等)处施加强磁场，能够使顺磁微粒空间定位于肿瘤部位，适合于受体活化和/或T细胞活化及扩增。增强FAS聚集，伴随信号极化，可能提供足够信号，即刻在肿瘤细胞中诱导细胞死亡。
在本发明的一个特定的实施方案中，通过同步富集并连接T细胞表面，可以刺激T细胞群体。本发明一方面将CD3和CD28的抗体共固定化在一个表面上。优选的这种固定化表面包括微粒，在某些方面包括小球，例如顺磁小球。本发明另一方面可利用结合TCR/CD3复合物并启动初级刺激信号的任何配基，作为固定化在表面上的初级活化因子。结合CD28并启动CD28信号转导途径、从而共刺激带有CD3配基的细胞并增强T细胞群体活化的任何配基是CD28配基，因而是本发明范围内的共刺激因子。本发明另一方面给T细胞与抗CD3和抗CD28缀合表面的混合物施加作用力，以富集T细胞，从而最大限度使T细胞表面连接。在一个特定的实施方案中，当抗CD3和抗CD28包被的表面是顺磁小球时，施加的富集作用力是磁力，本领域具有使细胞和配基以富集方式集合的其它方法。这性刺激T细胞群体的方法，提供了有效的小球-细胞和/或细胞-细胞的接触，诱导惊人强大的T细胞活化和/或增殖。此外，本发明的方法改变了细胞表面标志的特征，其中，与从患病受试者中首次分离的T细胞相比，活化T细胞表达显示正常表型较多、变异终产物较少的细胞表面标志。
初级信号以下简要阐述引起离体T细胞刺激的生物化学事件。TCR/CD3复合物与抗原提呈细胞上同MHC I类或II类分子共同提呈的抗原相互作用，启动称为抗原特异性T细胞活化的一系列生物化学事件。因此，通过刺激T细胞TCR/CD3复合物或刺激CD2表面蛋白质，能够实现T细胞活化。抗CD3单克隆抗体可用于通过TCR/CD3复合物活化T细胞群体。许多抗人CD3单克隆抗体可以商业获得，例如通过从美国典型培养物中心获得的杂交瘤细胞制备的OKT3，以及单克隆抗体G19-4。同样已知并可以得到刺激形式的抗CD2抗体。使用至少两种不同抗CD2抗体的组合，一般可以实现利用抗CD2抗体通过CD2的刺激。已经描述的抗CD2抗体的刺激组合包括以下T11.3抗体与T11.1或T11.2抗体组合(Meuer等人，Cell 36897-906，1984)，以及9.6抗体(识别与T11.1相同的表位)与9-1抗体的组合(Yang等人，J.Immunol.1371097-1100，1986)。还可以使用结合任何上述抗体相同表位的其它抗体。可以利用标准技术制备和鉴定另外的抗体或抗体组合。
还可以通过其它机制传递初级活化信号给T细胞。例如，可利用的组合包括蛋白激酶C(PKC)活化剂、例如佛波酯(如乙酸肉豆蔻佛波醇)以及钙离子载体(例如可提高细胞质钙浓度的离子霉素)等。使用这种因子绕过TCR/CD3复合物，将刺激信号传递给T细胞。用作初级信号的其它因子可包括天然以及合成的配基。天然配基可能包括提呈或未提呈肽的MHC。其它配基可包括但不限于肽、多肽、生长因子、细胞因子、趋化因子、糖肽、可溶性受体、类固醇、激素、有丝分裂原如植物凝集素、或其它超级抗原、肽-MHC四聚体(Altman等人，Science.1996 Oct 4；274(5284)94-6.)以及可溶性MHC二聚体(DalPorto等人Proc Natl Acad Sci U S A 1993 Jul 15；90)。在本发明范围内，利用富集和刺激可以引起受体高度极化，以至于不需要次级信号诱导T细胞增殖。
在其它实施方案中，利用本发明可以放大或分析任何种类的信号转导事件。例如，利用本发明的富集方法可以刺激和测定G蛋白质偶联受体。
次级信号在T细胞中传递初级活化信号，似乎需要刺激TCR/CD3复合物或CD2分子，但位于T细胞表面上称为辅助或共刺激分子的许多分子，涉及调节由静止T细胞到母细胞转化的转变及后续的增殖和分化。因而除初级活化信号之外，诱导T细胞应答需要次级共刺激信号。据认为这样的一种该共刺激或辅助分子CD28，启动或调节了不同于任何通过TCR复合物刺激的信号转导途径。
因此，在缺少外源生长因子或辅助细胞的情况下，为增强T细胞群体的活化和增殖，T细胞表面上的辅助分子例如CD28，由可结合该辅助分子的配基进行刺激。在一个实施方案中，通过T细胞群体接触其上附着有结合CD3的配基以及结合CD28的配基的一种表面，同时发生辅助分子CD28的刺激及T细胞活化。T细胞的活化(例如利用抗CD3抗体)以及CD28辅助分子的刺激，引起CD4+T细胞选择性增殖。
因此，本领域普通技术人员应当认识到，能够交联CD28分子的任何因子，包括抗CD28抗体或其片段，或CD28的天然配基，均可用于刺激T细胞。可用于本发明范围内的典型抗CD28抗体或其片段包括，单克隆抗体9.3(IgG2a)(Bristol-Myers Squibb，Princeton，NJ)、单克隆抗体KOLT-2(IgG1)、15E8(IgG1)、248.23.2(IgM)以及EX5.3D10(IgG2a)(ATCC HB11373)。典型的天然配基包括B7蛋白质家族，例如B7-1(CD80)和B7-2(CD86)(Freedman等人，J.Immunol.1373260-3267，1987；Freeman等人，J.Immunol.1432714-2722，1989；Freeman等人，J。Exp.Med.174625-631，1991；Freeman等人，Science 262909-911，1993；Azuma等人，Nature36676-79，1993；Freeman等人，J.Exp.Med.1782185-2192，1993)。此外，根据本发明还可以使用天然或通过化学或重组技术合成的天然配基的结合同系物。用作次级信号的其他因子可包括天然及合成的配基。因子可能包括但不限于其它的抗体或其片段、肽、多肽、生长因子、细胞因子、趋化因子、糖肽、可溶性受体、类固醇、激素、有丝分裂原如植物凝集素、或其它超级抗原。
本发明另一实施方案中，通过共刺激其它的T细胞整合膜蛋白质，可能增强T细胞群体的活化。例如，T细胞整合素LFA-1结合其天然配基ICAM-1，可能增强细胞活化。可以用作T细胞共刺激物的另一细胞表面分子是可与T细胞极晚期抗原-4(VLA-4)结合的VCAM-1(CD106)。在本发明范围内，也可能利用活化T细胞上表达的共刺激受体4-1 BB的连接，来放大T细胞介导的免疫。
本领域技术人员应当理解，通过与连接细胞表面部分的因子结合并诱导该部分聚集，可刺激T细胞之外的细胞，依次引起信号途径活化。其它这种细胞表面部分包括但不限于GPI锚定的叶酸受体(CD59)、人IgE受体(FcεRi受体)、BCR、EGF受体、胰岛素受体、ephrin B1受体、神经营养因子、神经胶质细胞源性中性粒细胞因子(GNDF)、刺猬(hedgehog)及其它连接胆固醇的以及棕榈酰化的蛋白质、H-Ras、整合素、内皮一氧化氮合酶(eNOS)、FAS、TNF受体家族成员、GNI锚定蛋白质、双酰化的蛋白质，例如Src家族激酶、异源三聚体G蛋白的α亚基以及细胞骨架蛋白质。
T细胞群体的扩增本发明一方面通过分离T细胞并随之刺激，完成T细胞的离体扩增。本发明的一个实施方案中，可利用单一因子刺激T细胞。在另一实施方案中，利用两种因子刺激T细胞，一种诱导初级信号，另一种是共刺激信号。用于刺激单一信号或刺激初级信号的配基以及刺激第二信号的辅助分子，可用于可溶形式、附着于细胞表面、或固定化在此处所述表面上。附着于表面的配基或因子，充当抗原递呈细胞(APC)的″代用品″。在优选实施方案中，初级和次级因子均共固定化在一种表面上。在一个实施方案中，提供初级活化信号的分子(例如CD3配基)以及共同刺激分子(例如CD28配基)，偶联在相同表面例如微粒上。此外，如前所述，可能在相同或不同的表面上使用一种、两种、或多种刺激分子。
扩增之前，从受试者获得T细胞来源。术语″受试者″意在包括可激发免疫应答的活生物体(例如哺乳动物)。受试者的例子包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。可以从许多来源获得T细胞，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脾组织和肿瘤。在本发明某些实施方案中，可能使用本领域可获得的许多T细胞系。在本发明某些实施方案中，可以使用本领域技术人员已知的许多技术，例如聚蔗糖分离，从采集自受试者的一个单位血液中获得T细胞。在一个优选实施方案中，通过单采血液成分术(apheresis)或白细胞提取法(leukapheresis)获得来自个体循环血液中的细胞。单采血液成分术的产物一般包含淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞及血小板。在一个实施方案中，利用单采血液成分术采集的细胞经洗涤除去血浆部份，并置于适当的缓冲液或培养基中，以供后续加工步骤。在本发明的一个实施方案中，利用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞。在另一实施方案中，洗涤溶液缺少钙，并可能缺少镁，或若非全部也可能缺少许多二价阳离子。再者，令人惊讶的是，在缺少钙的情况下开始的活化步骤导致活化放大。本领域普通技术人员容易理解，可利用本领域已知的方法进行洗涤步骤，例如按照厂家说明书使用半自动化″极限沉降离心(flow-through)″离心机(如Cobe 2991细胞处理机)。洗涤以后，可将细胞重悬于多种生物相容性的缓冲液中，诸如无钙无镁的PBS。或者，可以除去单采血液成分术样品中不合需要的成分，直接将细胞重悬于培养基中。
在另一实施方案中，通过裂解红细胞并通过例如PERCOLLTM梯度离心去除单核细胞，从外周血淋巴细胞中分离T细胞。利用正或负选技术，可以进一步分离特定的T细胞亚群，例如CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，在一个优选实施方案中，通过与抗CD3/抗CD28(即3×28)缀合小球、例如DYNABEADS@M-450 CD3/CD28 T温育足以正选所需T细胞的一段时间，来分离T细胞。在一个实施方案中，该时间约为30分钟。在另一实施方案中，该时间为30分钟-36小时、或更长以及其间的所有整数值。在另一实施方案中，该时间至少为1、2、3、4、5或6小时。在另一优选实施方案中，该时间为10-24小时。在一个优选实施方案中，该温育时间为24小时。为了从白血病患者中分离T细胞，使用更长的温育时间、例如24小时可以提高细胞产量。在与其它细胞类型相比存在较少T细胞的任何情况下分离T细胞，例如从肿瘤组织或无免疫应管个体中分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)时，可能使用较长的温育时间。此外，使用较长温育时间可以提高捕获CD8+T细胞的效率。
利用针对负选细胞特有表面标志的抗体组合，可以通过负选富集T细胞群体。优选的方法是使用针对负选细胞上细胞表面标志的单克隆抗体组合，通过负向的磁性免疫粘连或流式细胞术进行细胞分选和/或选择。例如，为了通过负选富集CD4+细胞，单克隆抗体组合一般包括CD14、CD20、CD11 b、CD16、HLA-DR及CD8的抗体。
为通过正或负选分离所需细胞群体，细胞及表面(例如微粒，如小球)的浓度可以不同。在某些实施方案中，可能希望显著降低小球与细胞混合在一起的体积(即，提高细胞浓度)，以确保细胞与小球最大限度接触。例如，在一个实施方案中，使用浓度为2×109细胞/ml。在一个实施方案中，使用浓度为1×109细胞/ml。在另一实施方案中，使用高于100×106细胞/ml。在另一实施方案中，使用细胞浓度为10、15、20、25、30、35、40、45或50×106细胞/ml。在另一实施方案中，使用细胞浓度为75、80、85、90、95或100×106细胞/ml。在另一实施方案中，使用125或150×106细胞/ml。使用高浓度可以导致增加细胞产量、细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度可以更有效捕获目的靶抗原表达较弱的细胞(例如CD28阴性T细胞)、或来自于存在许多肿瘤细胞的样品(即白血患者血液、肿瘤组织等)中的细胞。这类细胞群体可能具有治疗性价值而希望获得。例如，使用高浓度细胞可以更有效选择通常CD28表达较弱的CD8+T细胞。
在相关实施方案中，可能希望使用较低浓度细胞。通过大大稀释T细胞与表面(例如微粒，如小球)的混合物，可以使微粒与细胞之间的相互作用降到最低。这样选择出表达大量可结合微粒的所需抗原的细胞。例如，CD4+T细胞表达高水平的CD28，在稀释浓度下较CD8+T细胞更有效被捕获。在一个实施方案中，使用的细胞浓度为5×106/ml。在其它实施方案这，使用浓度可以为约1×105/ml-1×106/ml以及其中的任何整数值。
如果要求或必需，在离体扩增之前，通过多种方法，包括抗CD14包被的小球或柱子、或利用这些细胞的吞噬细胞活性促进去除，可以从血液制剂中去除单核细胞群体(即CD14+细胞)。因此，在一个实施方案中，本发明使用大小足以被吞噬细胞性单核细胞吞入的顺磁微粒。在某些实施方案中，该顺磁微粒是可以商品化获得的小球，例如DynalAS制备的商品名为DynabeadsTM的小球。这方面典型的DynabeadsTM是M-280、M-450和M-500。一方面，利用“无关”蛋白质(例如血清蛋白质或抗体)包被顺磁微粒，去除其它非特异性细胞。无关蛋白质和抗体包括非特异性靶向待扩增T细胞的蛋白质和抗体或其片段。在某些实施方案中，无关小球包括利用绵羊抗小鼠抗体、山羊抗小鼠抗体以及人血清白蛋白包被的小球。
简言之，将从全血或单采血液成分术的外周血中分离的PBMC与可以去除单核细胞的任意数量的(小球∶细胞比约20∶1)一种或多种偶联无关或非抗体的顺磁微粒在22-37℃预温育30分钟-2小时，然后磁力去除附着或吞入顺磁微粒的细胞，进行这种单核细胞的去除。使用本领域现有的标准方法可以进行这种分离。例如，可能使用任何磁力分离方法，包括各种可以商品化获得的方法(例如DYNAL磁性微粒浓缩器(DYNAL MPC))。利用本领域普通技术人员已知的多种方法，包括流式细胞术分析CD14阳性细胞，在所述去除前后进行监测，确保所需要的去除。
用于刺激的T细胞也可在洗涤步骤之后冷冻，而不需要单核细胞去除步骤。希望不受理论束缚，冷冻及随后的融化步骤去除了细胞群体中的粒细胞以及一定程度上的单核细胞，从而提供了更为均一的产物。经过洗涤步骤去除血浆和血小板以后，将细胞悬浮于冷冻液中。许多冷冻液和参数为本领域已知并可于此处使用，一种方法包括使用包含20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS或其它合适的细胞冷冻培养基，然后按每分钟1°的速率将细胞冷冻到-80℃，保存在液氮储存罐的气相中。可使用其它受控冷冻方法以及立即在-20°或液氮中非受控冷冻的方法。
可以如此处所述刺激细胞群体，例如通过接触固定化在表面上的抗CD3抗体或抗CD2抗体、或接触蛋白激酶C活化剂(如苔藓抑素(bryostatin))连同钙离子载体。为共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用可结合辅助分子的配基。例如，可以在适合刺激T细胞增殖的条件下使CD4+细胞群体接触抗CD3抗体和抗CD28抗体。类似地，为刺激CD8+T细胞的增殖，可以如本领域公知的其它方法一样(Berg等人，Transplant Proc.30(8)3975-3977，1998；Haanen等人，J.Exp.med.190(9)1319-1328，1999；Garland等人，J.Immunol Meth.227(1-2)53-63，1999)，使用抗CD3抗体和抗CD28抗体B-T3、XR-CD28(Diaclone，Besancon，France)。
可利用不同方案提供T细胞的初级刺激信号和共刺激信号。例如，提供每种信号的因子可处于溶液中或偶联到表面上。偶联到表面时，因子可能偶联相同表面(即″顺式″形式)或不同表面(即″反式″形式)。或者，可能一种因子偶联到表面，另一种因子处于溶液中。在一个实施方案中，提供共刺激信号的因子结合细胞表面，提供初级活化信号的因子则处于溶液中或偶联到表面。在某些实施方案中，两种因子均处于溶液中。在另一实施方案中，因子可能处于可溶性形式，然后交联到表面上，例如表达Fc受体的细胞、或抗体、或将会结合该因子的其它结合因子。在优选的实施方案中，将两种因子均固定化在小球上，或相同的小球，即″顺式″，或不同的小球，即″反式″。例如，提供初级活化信号的因子是抗CD3抗体，提供共刺激信号的因子是抗CD28抗体；将这两种因子按相等的分子数量共固定化在相同的小球上。在一个实施方案中，使用1∶1比例的每种抗体结合小球，以供CD4+T细胞扩增和T细胞生长。在本发明的某些方面中，使用一定比例的抗CD3∶CD28抗体结合小球，以至观察到与使用1∶1比例观察到的扩增相比，提高了T细胞扩增。在一个特定实施方案中，观察到比使用1∶1比例观察到的扩增提高约.5-3倍。在一个实施方案中，结合小球的CD3∶CD28抗体的比例为100∶1-1∶100及其间的所有整数值。在本发明的一个方面中，结合微粒的抗CD28抗体多于抗CD3抗体，即CD3∶CD28的比例小于1。在本发明的某些实施方案中，结合微粒的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比例大于2∶1。在一个特定实施方案中，使用结合微粒的CD3∶CD28抗体的比例为1∶100。在另一实施方案中，使用结合微粒的CD3∶CD28抗体的比例为1∶75。在另一实施方案中，使用结合微粒的CD3∶CD28抗体的比例为1∶50的比例。在另一实施方案中，使用结合微粒的CD3∶CD28抗体的比例为1∶30。在一个优选实施方案中，使用结合微粒的CD3∶CD28抗体的比例为1∶10。在另一实施方案中，使用结合微粒的CD3∶CD28抗体的比例为1∶3。在另一实施方案中，使用结合微粒的CD3∶CD28抗体的比例为3∶1的比例。
可能使用微粒与细胞的比例为1∶500-500∶1及其间的任何整数值，来刺激T细胞或其它靶细胞。本领域普通技术人员容易理解，微粒与细胞的比例可能依赖相对于靶细胞的微粒大小。例如，较小的小球只能结合几个细胞，大球则能结合许多。在某些实施方案中，细胞与微粒的比例为1∶100-100∶1及其间的任何整数值，而在另外的实施方案中，包含1∶9-9∶1及其间任何整数值的比例，也可以用来刺激T细胞。导致T细胞刺激的抗CD3和抗CD28偶联的微粒与T细胞的比例，可如上所述变化，但某些优选数值包括至少1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1-6∶1，优选的比例为至少每个T细胞1∶1微粒。在一个实施方案中，微粒与细胞的比例使用1∶1或更低。在另一实施方案中，微粒与细胞的比例可随刺激天数而变化。例如，在一个实施方案中，第一天微粒与细胞的比例为1∶1-10∶1，其后每天或每隔一天将额外的微粒加入细胞中，多达10天，最终的比例为1∶1-1∶10(根据加入当天的细胞计数)。在一个特定实施方案中，刺激第一天微粒与细胞的比例为1∶1，在刺激的第3天和第5天调整为1∶5。在另一实施方案中，每天或每隔一天加入微粒，第1天最终比例为1∶1，在刺激的第3天和第5天为1∶5。在另一实施方案中，刺激第一天微粒与细胞的比例为2∶1，在刺激的第3天和第5天调整为1∶10。在另一实施方案中，每天或每隔一天加入微粒，第1天最终比例为1∶1，在刺激的第3天和第5天为1∶10。本领域技术人员应当理解，很多其它比例可能适合本发明使用。特别而言，比例将随微粒大小以及细胞大小和类型而变化。
使用某些方法，通过在约12-14天的时间后，将T细胞与刺激物分开，可能有利于在最初的活化和刺激后维持T细胞群体的长期刺激。例如，利用诸如库尔特计数器(Coulter Counter)检查T细胞大小或测量其体积，定期(例如每天)监测T细胞增殖速率。在这方面，静止T细胞的平均直径约6.8微米，经过最初的活化和刺激后，在存在刺激配基的情况下，到第4天T细胞平均直径会增加到超过12微米，约第6天开始下降。T细胞平均直径降到约8微米时，可重新活化和再刺激T细胞，以诱导T细胞进一步增殖。或者，通过分析在活化的T细胞上诱导出现的细胞表面分子，诸如CD154、CD54、CD25、CD137、CD134，来监测T细胞增殖速率和T细胞再刺激时间。
在一个实施方案中，利用共固定化于小球(3×28小球)的抗CD3和抗CD28抗体进行T细胞刺激，持续足以使细胞回复静止状态(低或不增殖)的一段时间(最初刺激后约8-14天)。然后从细胞中去除刺激信号，洗涤细胞，回输给患者。如实施例所证明，刺激末期的细胞具有应答抗原以及表现记忆样表型的能力，证明通过本发明方法变成″超诱导性″。因此，经过外源性或由输注后抗原体内再刺激，活化的T细胞表现为以独特表型特性为特征的强烈应答，例如持续CD154表达、增加细胞因子生成等。
本发明另外的实施方案中，细胞(例如T细胞)与因子包被的小球结合，随后分离小球和细胞，再培养该细胞。在另一实施方案中，培养前不分离因子包被的小球和细胞，而是共同培养。在另一实施方案中，首先通过施加作用力富集小球和细胞，引起细胞表面部分连接，从而诱导细胞刺激。
例如，若T细胞是靶细胞群体，通过使附着有抗CD3和抗CD28的顺磁小球(3×28小球)接触T细胞，可连接细胞表面部分。在一个实施方案中，细胞(例如104-109T细胞)和小球(例如1∶1比例的DYNABEADSM-450 CD3/CD28 T顺磁小球)在缓冲液中结合，优选PBS(无二价阳离子，例如钙和镁)。本领域普通技术人员仍然容易理解，可能使用任何细胞浓度。例如，样品中靶细胞可能非常少、仅占样品的0.01％，或全部样品(即100％)包含目的靶细胞。因此，任何细胞数量均在本发明范围之内。在某些实施方案中，可能希望显著降低微粒与细胞混合在一起的体积(即，提高细胞浓度)，以确保细胞与微粒最大限度接触。例如，在一个实施方案中，使用浓度约2×109细胞/ml。在另一实施方案中，使用高于100×106细胞/ml。在另一实施方案中，使用细胞浓度为10、15、20、25、30、35、40、45或50×106细胞/ml。在另一实施方案中，使用细胞浓度为75、80、85、90、95或100×106细胞/ml。在另一实施方案中，使用浓度为125或150×106细胞/ml。使用高浓度可以导致增加细胞产量、细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度可以更有效捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞，例如CD28阴性T细胞。这类细胞群体可能具有治疗性价值而希望获得。例如，使用高浓度细胞可以更有效选择CD28表达通常较弱的CD8+T细胞。
在一个相关实施方案中，可能希望使用较低浓度的细胞。通过大大稀释T细胞和微粒的混合物，可使微粒与细胞之间的相互作用降到最小。这样选择出表达大量可结合微粒的所需抗原的细胞。例如，CD4+T细胞表达高水平的CD28，在稀释浓度下较CD8+T细胞更有效被捕获和刺激。在一个实施方案中，使用的细胞浓度约5×106/ml。在其它实施方案中，使用浓度可以为约1×105-1×106/ml以及其中的任何整数值。
悬浮细胞的缓冲液可以是适合特定细胞类型的任何一种。使用某些细胞类型时，缓冲液可能包含为维持处理期间细胞完整性所必需的其它组分，例如1-5％血清。在另一实施方案中，细胞和小球可以在细胞培养基中结合。例如，通过转动、振荡或任何混合方法，使细胞和小球混合1分钟-几个小时的时间。然后利用作用力，例如置于磁场中，富集小球和细胞的容器。例如通过蠕动泵泵送，去除培养基以及未结合的细胞，洗涤附着于小球上的细胞，然后重悬于适于细胞培养的培养基中。
本发明的一个实施方案中，混合物可能培养几个小时(约3小时)至约14天、或其间以小时计的任何整数值。在另一实施方案中，混合物可能培养21天。在本发明的一个实施方案中，小球和T细胞共同培养约8天。在另一实施方案中，小球和T细胞共同培养2-3天。也可能需要几轮刺激，使T细胞的培养时间为60天或更长。适于T细胞培养的条件包括合适的培养基(例如极限必需培养基(MinimalEssential Media)或RPMI培养基1640或X-vivo 15(BioWhittaker))，其中可能包含为增殖和存活所需因子，包括血清(例如胎牛或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-12、TGFβ和TNF-α、或本领域技术人员已知的用于细胞生长的其它添加剂。细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活化剂、人血浆蛋白制剂(plasmanate)以及还原剂，例如N-乙酰半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20，添加氨基酸和维生素，无血清或添加适量血清(或血浆)或特定激素组合和/或用于T细胞生长和扩增的足量细胞因子。抗生素(例如青霉素和链霉素)仅包含于实验用培养基中，在将要输给受试者的细胞培养物中不存在。靶细胞在支持生长所必需的条件、例如合适的温度(例如37℃)和环境(例如加5％CO2的空气)下培养。
使用磁场作为富集作用力时，在细胞培养之前施加于细胞的磁场强度可能是磁性表面上200-12,000高斯。磁铁的形状和大小可适应混合或细胞培养瓶的大小和形状，或者适应促进或提高细胞-细胞接触以及细胞富集的任何其它参数。通过在磁铁与细胞混合物内含的顺磁小球之间放置用作缓冲或隔离的物质，可以扩散磁力。通常认为，强磁力为至少表面上7500高斯，而认为弱磁力为表面上2000-2500高斯。通过磁铁施加给顺磁小球的近似磁力，视顺磁小球的体积以及按照下式的磁场强度而定Fmag＝(ν)(ψ)(B)(dB/dx)其中Fmag等于磁力，v等于顺磁小球的体积，ψ等于顺磁小球的磁性敏感度(由制造商提供数值)，B等于磁场强度，而(dB/dx)等于场强梯度。本领域技术人员应当理解，可以获取或测定等式右手边的因素，以计算施加的磁力。
利用本发明方法刺激的细胞，通过信号转导的诱导、细胞表面标志的表达和/或增殖显示被活化。其中一种适合T细胞的标志是CD154，这是重要的免疫调节分子。CD154的表达及其有利于放大免疫应答。CD154与在许多B细胞、树突细胞、单核细胞以及一些内皮细胞上表达的CD40分子相互作用。因此，突然意外地增强CD154表达很可能产生更多有效的T细胞组合物。如此处所述刺激CD3+细胞，在刺激后第1、2、3或4天可提供某些细胞表面标志(例如CD154)的表达水平提高1.1-20倍的T细胞。(参见实施例V、表2和图4)。富集和刺激之后的T细胞上的另一细胞表面标志CD25的表达，也高于培养之前的细胞、或利用其它方法刺激的细胞。(参见表2)。
本领域技术人员应当理解，可以通过细胞表面部分连接而刺激的任何靶细胞，所述细胞表面部分均可能结合包被因子的表面，例如小球。此外，可以在培养前、培养期间任意时间点、或培养结束时，将包被因子的表面(例如小球)与细胞分离。另外，可以在培养前将连接靶细胞的包被因子的表面与未结合细胞分离，或者其它细胞也可能留在培养物中。在一个实施方案中，培养之前不分离包被因子的小球和靶细胞，而是共同培养。在另一实施方案中，首先通过施加作用力富集小球和靶细胞，导致靶细胞表面部分连接，从而诱导刺激及后续活化。
本发明也包括增强靶细胞富集的其它方法，例如与包被有初级和次级刺激分子的表面相结合的T细胞组分。除施加磁力外，可以施加其它大于重力的作用力，例如但不限于离心力、跨膜压和水力。也可利用过滤进行富集。
本领域技术人员容易理解，通过利用其它作用力进行富集，可以加强包被因子的小球与待刺激细胞间的接触。因此，用于富集具有细胞表面部分结合配基的细胞的任何方法都可以，只要这种富集能够以大于重力或扩散的方式集合细胞和因子。
应当理解，在各种实施方案中，因子包被的表面可能是微粒，例如与细胞混合并在磁场中富集于小体积中的小球，从而将全部微粒以及结合微粒的细胞带到确定的集中区域。某些实施方案中，包被因子的表面可在接触靶细胞的30秒-4小时之内，受作用力而聚集。在其它实施方案中，该时间可能是1分钟-2小时、或介于其间的所有整数。给与附着有至少一种细胞表面配基的表面混合的、携带受体细胞的细胞群体施加作用力，可诱导细胞受体极化，聚集细胞表面分子。这种诱导细胞表面极化的方法，可能通过聚集包含脂质筏的细胞表面分子来增强细胞内信号。这种聚集可以诱导引起细胞事件下调或抑制的信号途径。或者，细胞表面分子的聚集可引起细胞事件的上调或活化。
细胞事件包括，例如诱导或抑制特定途径(包括凋亡途径)的受体介导的信号转导，或诱导蛋白质磷酸化，或刺激或抑制生长信号。在一个实施方案中，细胞可能是淋巴细胞、特别是T细胞，细胞表面配基可能是附着于表面(例如微粒)的抗CD3抗体。该微粒可能是顺磁小球，施加的作用力是磁力。施加磁力给淋巴细胞与抗CD3包被表面的顺磁小球的混合物，可能引起T细胞CD3受体比无外力的情况下更快速地极化。这种刺激T细胞的方法促进T细胞免疫应答途径迅速活化及细胞增殖。
在另一实施方案中，可以改变或定制(tailor)接触包被刺激因子(例如抗CD3/抗-CD28(即3×28))小球的时间，以获得所需T细胞表型。或者，可以在刺激之前使用多种选择技术选择所需的T细胞群体。由于辅助T细胞(TH)细胞的扩增能够改善或恢复全面的免疫应答，人们可能希望较多的TH群体，一般为CD4+而非CD8+细胞毒性或调节性T细胞。许多特异性免疫应答是由CD8+抗原特异性T细胞介导的，可以直接溶解或杀死靶细胞，而多数免疫应答需要表达重要免疫调节分子(例如GM-CSF、CD40L和IL-2)的CD4+T细胞的帮助。若优选CD4介导的帮助，诸如此处所述保持或提高CD4∶CD8比率的方法极其有益。提高CD4+T细胞数目可以提高引入患者的由细胞表达的CD40L数量，有可能提高靶细胞的可见度(改善APC功能)。提高输注的表达GM-CSF或IL-2(均主要由CD4+T细胞表达)细胞的数目，可以观察到类似效果。或者，在需要较少的CD4帮助而希望增加CD8+T细胞数量的情况下，还可以利用此处所述XCELLERATE方法，例如在刺激和/或培养之前预先选择CD8+细胞。在优选提高IFN-γ水平或提高靶细胞的细胞溶解作用时，可能存在这种情况。
为实现不同T细胞群体的分离，接触微粒的时间可以改变。例如，在一个优选实施方案中，通过与3×28小球、例如DYNABEADS M-450温育足以正选所需T细胞的一段时间，来分离T细胞。在一个实施方案中，该时间期限约为30分钟。在另一实施方案中，该时间期限至少为1、2、3、4、5或6小时。在另一优选实施方案中，该时间期限为10-24小时或更长。在一个优选实施方案中，该温育时间期限为24小时。为了从癌症患者中分离T细胞，使用较长的温育时间、例如24小时可以提高细胞产量。
为实现不同T细胞群体的分离，与富集作用力的接触时间可能变化或脉动。例如该作用力是磁力时，可能改变与磁铁或者磁场强度的接触和/或改变扩增时间，以获得特定的目的表型。各种表型标志的表达随时间改变；因此，可选择特定的时间点，以获得特异性T细胞群体。因此，根据待刺激的细胞类型，刺激和/或扩增的时间可能是10周或更少、8周或更少、4周或更少、2周或更少、10天或更少、或8天或更少(4周或更少包括从4周降到1天(24小时)的所有时间或这些数值之间的任意值)。在一些实施方案中，可能希望利用例如有限稀释或细胞分选来克隆T细胞，其中可能需要较长的刺激时间。在一些实施方案中，刺激和扩增可能进行6天或更少、4天或更少、2天或更少，而在其它实施方案中，少到24小时或更少、优选4-6小时或更少(此范围包括其间任意整数值)。T细胞刺激进行的时间较短时，可能未显著增加T细胞群体的数量，但是该群体会提供更强、更健康的活化T细胞，它们可以继续在体内增殖，并更非常类似于天然的效应物T细胞池。在对蛋白质抗原的抗体应答中，获得T细胞辅助经常是限制因素，因此能够选择性扩增或选择性给受试者输注CD4+丰富的T细胞群体极其有利。这种富集群体的更多益处显而易见，识别B淋巴细胞提呈抗原的活化辅助T细胞可传递物理接触和细胞因子生成两种类型的刺激信号，导致B细胞增殖和分化。
已接触不同刺激时间的T细胞可能显示不同特征。例如，典型的血液或单采血液成分术的外周血单核细胞产物具有的辅助T细胞群体(TH，CD4+)多于细胞毒性或抑制性T细胞群体(Tc，CD8+)。通过刺激CD3和CD28受体来离体扩增T细胞，产生的T细胞群体在约第8-9天前主要由TH细胞组成，在约第8-9天以后，该T细胞群体包含的Tc细胞群体逐渐增多。因此，根据治疗目的，利用主要包含TH细胞的T细胞群体输注受试者可能有益处。类似地，如果已经分离了抗原特异性Tc细胞亚群，将该亚群扩增到更大程度可能有益处。
另外，除CD4和CD8标志以外，其它表型标志变化显著，但大部分可在细胞扩增过程中增殖(reproducibly)。因此，这种增殖性使得能够为特定目的而定制活化的T细胞产物。
在这类例子中，增殖随时间改变的重要表型标志为高亲合力的IL-2受体(CD25)、CD40配基(CD154)和CD45RO(通过优先结合TCR而可能提高TCR对抗原结合敏感性的分子)。本领域普通技术人员容易理解，这类分子因种种原因而重要。例如，CD25构成了使T细胞迅速分裂的自分泌环路的重要部分。已经表明CD154在下列方面具有关键作用刺激提呈抗原的树突细胞成熟中；活化B细胞而产生抗体；调节TH细胞增殖；增强Tc细胞分化；调节TH细胞和抗原提呈细胞的细胞因子分泌；以及刺激共刺激配基、包括CD80、CD86和CD154的表达。
细胞因子生成高峰位于离体扩增过程的前几天。因此，由于已知细胞因子对于介导T细胞活化和功能以及免疫应答调节很重要，在开发接触其它抗原激发时能够重新活化的治疗性T细胞产物中，这类细胞因子可能非常重要。在这方面重要的细胞因子，包括但不局限于IL-2、IL-4、TNF-α和IFN-γ。因此，在扩增的前几天获得T细胞群体并将这些细胞输注给受试者，可能在体内发生T细胞另外的活化和扩增，从而产生治疗益处。
除前述细胞因子和标志以外，已知对于介导T细胞活化和免疫应答调节很重要的粘附分子表达，也变化显著并可在离体扩增过程中增殖。例如，CD62L对于T细胞归巢到淋巴组织以及运送到炎症部位很重要。在某些疾病和伤害的情况下，在这些部位存在活化的T细胞可能不利。由于活化以后较早发生CD62L的下调，T细胞扩增时间较短。相反，较长时间培养会产生具有高水平CD62L的T细胞群体，因而更有能力在其它优选条件下，将活化的T细胞靶向到这些部位。表达随时间变化的另一多肽例子CD49d是一种粘附分子，它涉及将淋巴细胞从血液运送到炎症部位的组织间隙。CD49d配基结合CD49d，也使T细胞通过结合VCAM-1或纤连蛋白配基而接受活化和增殖的共刺激信号。粘附分子CD54的表达，涉及T细胞-APC和T细胞-T细胞的相互作用以及到归巢炎症部位，也在扩增过程中发生改变。因此，可以在符合目的标志特性的选定时间内刺激T细胞，然后收集并输注。从而能够定制T细胞群体，以表达据信可为待治疗适应症提供最高疗效的标志。
在各种实施方案中，本领域普通技术人员理解，从细胞中去除刺激信号有赖于所用表面的类型。例如，如果使用顺磁小球，那么磁性分离是可行选项。顺磁小球厂家说明书(例如DYNAL Inc.，Oslo，Norway)详述了分离技术。此外，如果该表面是大到足以与细胞分开的小球，则可以利用过滤。此外，可以商品化获得多种输血滤器，包括20微米和80微米输血滤器(Baxter)。因此，只要小球大过滤器的筛孔大小，这种过滤的效率很高。在一个相关实施方案中，小球可透过滤器，但细胞保留，因而使其分离。在一个特定实施方案中，所用的生物相容性表面在接触期间于培养中分解(即，可生物分解)。
本领域普通技术人员容易理解，此处所述的细胞刺激方法可以在多种环境(即容器)中进行。例如，这类容器可能是培养瓶、培养袋、或能够容纳细胞的任何容器，优选无菌环境。在本发明的一个实施方案种，还使用了生物反应器。例如，目前几个厂家制造了可用于细胞生长的装置，可与本发明方法联合使用。例如参见Celdyne Corp.，Houston，TX；Unisyn Technologies，Hopkinton，MA；Synthecon，Inc.Houston，TX；Aastrom Biosciences，Inc.Ann Arbor，MI；WaveBiotech LLC，Bedminster，NJ。此外，包括这种生物反应器的专利包括美国专利6096,532；5,985,653；5,888,807；5,I90,878，此处引入以供参考。
在一个实施方案中，可能将本发明用于同时刺激并富集细胞的磁铁引入生物反应器装置(例如″The Wave″(Wave Biotech LLC，Bedminster，NJ))的基础转动平台上。磁铁或可磁化元件也可能附在标准生物反应罐中，例如圆柱型应用单元。内建的磁性元件也许能够在细胞培养过程中的不同点按需开关。放置整合的磁铁或可磁化元件，以使其发出的磁场穿过培养罐。在某些实施方案中，将磁铁或可磁化元件并入壁内，或置于培养罐体中。在另一实施方案中，可以在培养期间所需时间点将细胞磁性富集和/或活化、磁性分离或隔离，而无需将细胞转移到不同的培养物或磁性分离单元。使用这种内建的磁性元件可以方便培养、刺激和富集以及分离过程，使得能够扩增和定制特定功能的细胞群体，用于在基于细胞或基因的治疗中免疫治疗性输注给患者。此外，该装置为特异性产生细胞内和分泌到细胞外的分子提供了改进的方法。
上述整合的磁性或可磁化装置可用于从培养物中去除磁性微粒或使其保留在培养罐中，同时去除培养基中存在的所需细胞和/或所需分子。或者，通过与此处所述已包被可结合目的细胞和/或分子的特定分子的磁性微粒相互作用，可能将细胞和/或目的分子特别保留在培养袋或其它合适的培养容器中。内建的磁性或可磁化装置通过磁性固定/富集带有特定微粒的细胞，并使培养基和/或其它溶液流过袋子，能够在细胞培养袋中洗涤细胞群体并更换培养基。该装置通过提供完全整合的系统而有效排除了对单独的磁性分离装置的需要，从而降低了处理时间以及管道连接的手工操作，减少了处理中所用容器的数量，通过所需管道和容器连接数降低了污染的可能性。该整合的磁性或可磁化装置培养系统也降低了培养处理和配制中所需体积。
如前所述，本发明一方面涉及以下惊人发现，即联合诱导细胞富集的作用力、细胞表面部分连接以及在转动的密闭系统中培养细胞，导致这些细胞的活化及扩增极大增强。因此，在一个实施方案中，使用带有基础转动平台的、能够改变转动速率和各种不同转动角度的生物反应器，例如″The Wave″(Wave Biotech LLC，Bedminster，NJ)。熟练技术人员应当认识到，可以适当运动以优化细胞扩增的任何平台均在本发明范围之内。在某些实施方案中，本发明刺激并扩增的方法提供了在培养过程中按1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20转/分钟转动培养容器。
在某些实施方案中，生物反应容器的容量为约0.1-200升培养基。熟练技术人员容易认识到，用于培养的体积将随起始细胞数和所需最终细胞数而变化。在特定实施方案中，按起始浓度约0.2×106-约5×106细胞/ml及其间任意浓度接种本发明的细胞、例如T细胞。在一个特定实施方案中，细胞可能最初在静止的环境中培养，在1、2、3、4、5、6、7、8或更多天培养之后，转入位于转动平台上的生物反应器中。在一个相关实施方案中，完整的刺激、活化及扩增过程在如上所述包含转动平台以及整合磁铁的生物反应器中发生。用作说明的生物反应器包括但不限于′The Wave″。
在一个特定的实施方案中，本发明的细胞刺激方法在可以按不同速率(例如约0.1-3ml/分钟)灌注培养基的密闭系统、例如生物反应器中进行。因此，在某些实施方案中，这种密闭系统的容器包含一个出口滤器、一个进口滤器以及用于进出该密闭系统进行无菌转移的取样口。在其它实施方案中，该密闭系统的容器包含注射器泵和控制器，用于进出该密闭系统的无菌传递。另外的实施方案提供了通过连续监测生物反应容器的重量来控制培养基输入和输出的结构，例如一个负载单元。在一个实施方案中，该系统包含一个气体歧管。在另一实施方案中，本发明的生物反应器包含一个CO2气体混合器，可供应空气和CO2的混合物给生物反应容器并保持容器处于正压。在另一实施方案中，本发明的生物反应器包含一个可变的加热元件。
在一个实施方案中，在第2、3、4、5或6天开始，使培养基按约0.5-5.0升/天进入容器中，直至达到所需的终体积。在一个优选的实施方案中，在第4天开始，培养基按2升/天进入容器中，直至体积达到10升。一旦达到所需体积，便可以开始培养基灌流。在某些实施方案中，在培养约第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天，开始透过系统的培养基灌流。在一个实施方案中，当体积约为0.1-200升培养基时开始灌流。在一个特定的实施方案中，当终体积为4、5、6、7、8、9、10或20升时开始灌流。
在本发明另一实施方案中，细胞、例如T细胞在密闭、静止的系统中培养多达5天，然后转移到包含转动元件、能使培养容器以可变速率转动的密闭系统中。
在某些方面，本发明的方法提供了在少于约两周扩增细胞、例如T细胞到浓度约6×106-约90×106细胞/ml。特别而言，此处方法提供了扩增T细胞到浓度约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80或85×106细胞/ml以及其中所有浓度。在某些实施方案中，细胞到培养约第5、6、7、8、9、10、11或12天达到所需浓度、例如上文所列任何浓度。在一个实施方案中，从约第4-12天的培养中，T细胞约24小时扩增至少约1.5倍。在一个实施方案中，细胞、例如T细胞在少于约两周，从起始细胞数约100×106扩增到总计约500×109细胞。在另一实施方案中，T细胞在少于约两周，从起始细胞数约500×106扩增到总计约500×109细胞。在相关实施方案中，细胞在少于约两周，从起始细胞数约100-500×106扩增到总计约200、300或400×109细胞。
在本发明另外的实施方案中，此处所述细胞活化和扩增方法以及使用这些方法产生的条件培养基可以用于产生外来体(exosomes)。在细胞中，可以通过内含体膜出芽到区室内腔形成囊泡；此过程导致多泡体(multivesicular bodies(MVBs))形成。MVB与质膜融合导致分泌小的内部囊泡，称为外来体。该条件培养基可用来培养其它T细胞、或培养其它类型细胞。
虽然用于此处所述方法中的抗体很容易从公共来源、例如ATCC获得，但是可以通过标准技术生产T细胞辅助分子和CD3复合物的抗体。用于本发明方法中的抗体的产生方法为本领域所熟知，于此处进一步详述。
表面上的配基固定化如上文指出，本发明方法优选使用与表面结合的配基。该表面可以是能够使配基结合其上或整合其中的任何表面，并且是生物相容性的，即，对将要刺激的靶细胞基本无毒。生物相容性表面可能可生物降解、或不可生物降解。表面可能是天然、或合成的，合成的表面可能是聚合物。表面可能包含胶原、纯化的蛋白质、纯化的肽、多糖、氨基多糖或细胞外基质成分。多糖可能包括例如纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、透明质酸或藻酸盐。
其它聚合物可能包括聚酯类、聚醚类、聚酐类、聚烷基丙烯腈、聚丙烯酰胺、聚邻酯、聚磷腈、聚乙酸乙烯酯、嵌段共聚物、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)或聚氨基甲酸乙酯。聚合物可能是乳酸或共聚物。共聚物可能包含乳酸和羟乙酸(PLGA)。不可生物降解的表面可能包括，例如聚(二甲基硅氧烷)和聚(乙烯-乙酸乙烯酯)等聚合物。生物相容性表面包括例如玻璃(如生物玻璃)、胶原、金属、羟基磷灰石、铝酸盐、生物陶瓷材料、透明质酸聚合物、藻酸盐、丙烯酸酯聚合物、乳酸聚合物、羟乙酸聚合物、乳酸/羟乙酸聚合物、纯化的蛋白质、纯化的肽或细胞外基质成分。其它组成表面的聚合物可能包括玻璃、二氧化硅、硅、羟基磷灰石、水凝胶、胶原、丙烯醛、聚丙烯酰胺、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龙或许多塑料或合成的有机聚合物等。表面可能包含生物学结构，例如脂质体或细胞。表面可能是脂质、盘子、袋子、小丸、纤维、筛孔或微粒形式。微粒可能包括胶体粒子、微球体、纳米微粒、小球等。在各种实施方案中，使用可商品化获得的表面，例如小球或其它微粒(例如Miltenyi微粒，Miltenyi Biotec，Germany；琼脂糖小球，Pharmacia Fine Chemicals，Sweden；DYNABEADSTM，Dynal Inc.，New York；PURABEADSTM，Prometic Biosciences)。
使用小球时，其可能是实现靶细胞刺激的任意大小的小球。在一个实施方案中，小球优选大小约5nm-500μm。因此，小球大小的选择取决于该小球将要进行的特定应用。例如，如果小球用于去除单核细胞，则选择较小尺寸以便于单核细胞摄取(例如直径2.8μm和4.5或可能吞入的任何大小，例如纳米大小)；然而，在需要利用过滤来分离小球时，一般使用的小球尺寸不低于50μm。此外，使用顺磁小球时，小球的尺寸一般为约2.8-500μm、更优选约2.8-50μm。最后，人们可能选择使用小到约10-5nm的超级顺磁纳米微粒。因此，从上述讨论显而易见，实际上可能使用任何的微粒大小。
利用本领域已知及现有的多种方法，可能将因子附着、或偶联、或整合到表面。因子可能是天然配基、蛋白质配基、或合成配基。可能是共价或非共价、静电或疏水性的附着，并可能利用多种附着方法进行，包括例如化学、机械、酶促、静电或使配基能够刺激细胞的其它方法。例如，针对配基的抗体首先附着于表面，或者亲和素或链亲和素附着于结合生物素化配基的表面。针对配基的抗体可能通过抗独特型抗体附着表面。另一个例子包括利用蛋白A或蛋白G，或者其它非特异性抗体结合分子，附着结合抗体的表面。或者，配基可能通过化学方法附着表面，例如利用可商品化获得的交联剂(Pierce，Rockford，IL)或其它方法交联到表面。在某些实施方案中，配基共价结合到表面。此外，在一个实施方案中，按照厂家说明书，将可商品化获得的带有环氧表面反应性基团的甲苯磺酰基活化的DYNABEADSTM或DYNABEADSTM与目的多肽配基温育。简言之，这种条件一般包括在pH4-pH9.5磷酸盐缓冲液中、于4-37℃温度下温育。
一方面，因子例如某些配基可能是单一来源或多来源，可能是抗体或其片段，另一方面，在利用T细胞时，共刺激配基是B7分子(例如B7-1、B7-2)。这些配基通过任何上述不同的附着方法与表面偶联。偶联到表面的B7分子可能分离自表达共刺激分子的细胞、或使用可产生和分离如此处所述共刺激分子的标准重组DNA技术及表达系统得到。还可以使用在偶联细胞表面时保持触发T细胞共刺激信号能力的B7分子的片段、突变体、或变体。此外，本领域普通技术人员应当认识到，用于活化和诱导T细胞亚群增殖的任何配基，也可固定化在小球、或培养容器表面、或任何表面。另外，当优选方法是将配基共价连接到表面时，也可能利用次级单克隆抗体吸附或捕获。若该表面是小球的表面，利用流式细胞术分析可能轻易测定附着在表面的特定配基的数量，或者如果表面是例如组织培养皿、筛孔、纤维、袋子，则通过酶联免疫吸附分析(ELISA)测定。
在特定实施方案中，B7分子的刺激形式、或抗CD28抗体或其片段附着在与刺激TCR/CD3复合物的因子、例如抗CD3抗体相同的固相表面上。在另一实施方案中，4-1 BB分子的刺激形式、或抗4-1 BB抗体或其片段附着在与刺激TCR/CD3复合物的因子、例如抗CD3抗体相同的固相表面上。除抗CD3抗体之外，可能使用与模拟抗原信号的受体结合的其它抗体。例如，小球或其它表面可以联合包被抗CD2抗体和B7分子、特别是抗CD3抗体和抗CD28抗体。在另一实施方案中，表面可能包被有三种或更多因子，例如此处所述任何因子的组合，如抗CD3抗体、抗CD28抗体和抗4-1 BB抗体。
在与表面偶联时，因子可能偶联同一表面(即″顺式″形式)、或不同表面(即″反式″形式)。或者，可能一种因子偶联表面，而另一种因子处在溶液中。在一个实施方案中，提供共刺激信号的因子结合细胞表面，提供初级活化信号的因子则处在溶液中或与表面偶联。在一个优选实施方案中，两种因子固定化在小球上，或相同小球，即″顺式″，或不同小球，即″反式″。例如，提供初级活化信号的因子是抗CD3抗体，提供共刺激信号的因子是抗CD28抗体；两种因子均以相等分子数共固定化在相同的小球上。在一个实施方案中，使用每种抗体按1∶1比例结合小球，进行CD4+T细胞的扩增和T细胞生长。在本发明的某些方面，使用一定比例的抗CD3∶CD28抗体结合小球，以至观察到与使用1∶1比例观察到的扩增相比，提高了T细胞扩增。在一个特定实施方案中，观察到比使用1∶1比例观察到的扩增提高约.5-3倍。在一个实施方案中，结合小球的CD3∶CD28抗体的比例为100∶1-1∶100及其间的所有整数值。在本发明的一个方面，结合微粒的抗CD28抗体多于抗CD3抗体，即CD3∶CD28的比例小于1。在本发明的某些实施方案中，结合微粒的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比例大于2∶1。在一个特定实施方案中，使用结合微粒的CD3∶CD28抗体的比例为1∶100。在另一实施方案中，使用结合微粒的CD3∶CD28抗体的比例为1∶75。在另一实施方案中，使用结合微粒的CD3∶CD28抗体的比例为1∶50。在另一实施方案中，使用结合微粒的CD3∶CD28抗体的比例为1∶30。在一个优选实施方案中，使用结合微粒的CD3∶CD28抗体的比例为1∶10。在另一实施方案中，使用结合微粒的CD3∶CD28抗体的比例为1∶3。在另一实施方案中，使用结合微粒的CD3∶CD28抗体的比例为3∶1。
在本发明某些方面，将三种或更多因子偶联到表面。在某些实施方案中，因子可能偶联同一表面(即″顺式″形式)、或不同表面(即″反式″形式)。或者，可能一种或多种因子偶联表面，而另一种或多种因子处在溶液中。
因子本发明涉及的因子包括蛋白质配基、天然配基以及合成配基。可以结合细胞表面部分并在某些条件下引起连接和聚集、导致信号发生的因子，包括但不限于植物凝集素(例如PHA、扁豆植物凝集素(lentillectins)、伴刀豆凝集素A)、抗体、抗体片段、肽、多肽、糖肽、受体、B细胞受体和T细胞受体配基、细胞外基质成分、类固醇、激素(例如生长激素、皮质甾类、前列腺素、四碘化甲腺原氨酸)、细菌成分(例如脂多糖)、有丝分裂原、抗原、超抗原及其衍生物、生长因子、细胞因子、病毒蛋白质(例如HIV gp-120)、粘附分子(例如L-选择素、LFA-3、CD54、LFA-1)、趋化因子和小分子。因子可能分离自天然来源，例如细胞、血液产品和组织，或分离自体外传代的细胞，或重组、或通过本领域人员已知的其它方法制备。
在本发明一方面，当需要刺激T细胞时，可用的因子包括能够结合CD3/TCR复合物、CD2和/或CD28并分别起始活化或增殖的配基。因此，术语配基包括用于细胞表面蛋白质″天然″配基的蛋白质(例如用于CD28的B7分子)以及人工配基(例如针对细胞表面蛋白质的抗体)。可按照常规方法、例如杂交瘤方法以及重组DNA和蛋白质表达技术生产这些抗体及其片段。可用的抗体和片段可能来源于任何物种(包括人)、或可能利用来自一种以上物种的序列形成嵌合蛋白质。
可能利用本领域公知的方法产生特异性针对配基的抗体、多克隆抗血清或单克隆抗体。抗体也可能制备成具有所需特性设计的遗传工程免疫球蛋白(Ig)或Ig片段。例如，用于说明而非限制，抗体可能包括重组IgG，它是具有来自第一哺乳动物物种的至少一个可变(V)区结构域以及来自另一不同的哺乳动物物种的至少一个恒定区结构域的嵌合性融合蛋白质。最常见的是，嵌合抗体具有小鼠可变区序列以及人的恒定区序列。通过将来源于小鼠抗体的、具有抗原结合特异性的互补决定区(CDRs)移植入人源V区构架区域以及人源恒定区，可″人源化″这种小鼠/人嵌合免疫球蛋白。通过蛋白水解消化、或任选通过蛋白水解消化后温和还原二硫键并烷基化、或通过重组遗传工程技术，可产生这些分子的片段。
如果抗体特异性地结合配基，其亲合常数Ka大于或等于约104M-1、优选大于或等于约105M-1、更优选大于或等于约106M-1、更加优选大于或等于约107M-1，则定义为具有″免疫特异性″。使用例如Scatchard等人所述(Ann.N.Y.Acad.Sci.USA 51660，1949)常规技术或通过表面等离子共振(surface plasmon resonance)(BlAcore，Biosensor，Piscataway，NJ)例如参见Wolff等人Cancer Res.，532560-2565，1993)，容易测定结合配偶体或抗体的亲和力。
一般利用任何本领域普通技术人员已知的多种技术制备抗体(例如参见Harlow等人，AntibodiesA Laboratory Manual，1988，ColdSpring Harbor Laboratory)。在这样一种技术中，利用配基作为抗原免疫动物，产生多克隆抗血清。合适的动物包括兔、绵羊、山羊、猪、牛，并可能包括较小的哺乳动物物种，例如小鼠、大鼠和仓鼠。
免疫原可能包含表达配基的细胞、纯化或部分纯化的配基多肽或其变体或其片段、或配基肽。配基肽可能通过蛋白酶剪切产生、或化学合成。可能按照本领域技术人员已知的方法，通过分析配基的一级、二级或三级结构，以便确定更有可能在宿主动物中产生抗原性应答的氨基酸序列，选择用于免疫的肽(参见，例如Novotny，Mol.Immunol.28201-207，1991；Berzoksky，Science 229932-40，1985)。
制备免疫原可能包括，配基多肽或其变体或片段、或肽共价偶联另一种免疫原性蛋白质，例如匙孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白。此外，可将肽、多肽或细胞在佐剂中乳化(参见Harlow等人，AntibodiesALaboratory Manual，1988 Cold Spring Harber Laboratory)。一般而言，动物在第一次注射以后，根据动物物种的优选方案，接受一次或多次加强免疫。通过动物定期取血、分离血清并在免疫测定(例如Ouchterlony分析)中分析血清，评定特异性抗体的滴度，来监测免疫应答。一旦确定了抗体滴度，动物可能定期取血，以积累多克隆抗血清。然后例如通过使用蛋白质A、或使用偶联合适固相支持物的配基多肽或肽的亲合层析，从该抗血清中纯化可特异性结合配基多肽或肽的多克隆抗体。
例如使用Kohler和Milstein(Nature，256495-497，1975；Eur.J.Immunol.6511-519，1976)及其改进的技术，可制备特异性结合配基多肽或其片段或变体的单克隆抗体。可能得到永生真核细胞系，杂交瘤，可产生对配基多肽或其变体或片段具有所需特异性的抗体。利用上述制备的配基免疫原免疫动物，例如大鼠、仓鼠或优选小鼠。从免疫动物获得淋巴样细胞，最通常是脾细胞，通过融合药物致敏的骨髓瘤细胞的融合配偶体、优选与所免疫动物同源的配偶体而永生化。利用膜融合促进剂、例如聚乙二醇或非离子型活性剂使脾细胞和骨髓瘤细胞结合几分钟，然后低密度接种于支持杂交瘤细胞、而不支持骨髓瘤细胞生长的选择性培养基中。优选的选择性培养基是HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脱氧核苷)。经过足够时间，通常约1-2周，观察细胞集落。分离单个集落，并检验细胞产生的抗体对配基多肽或其变体或其片段的结合活性。优选可产生对配基抗原具有高亲合力和特异性抗体的杂交瘤。本发明包括可生产特异性结合配基多肽或其变体或其片段的单克隆抗体的杂交瘤。
可从杂交瘤培养上清中分离单克隆抗体。另一种产生小鼠单克隆抗体的方法是将杂交瘤细胞注射到同系小鼠的腹膜腔中。小鼠产生包含该单克隆抗体的腹水液。利用常规方法，例如层析、凝胶过滤、沉淀或萃取，从抗体中去除污染物。
可利用多种技术产生人单克隆抗体。方法包括但不限于，EpsteinBarr病毒(EBV)转化人外周血细胞(参见美国专利4,464,456)、体外免疫人B细胞(参见例如Boerner等人，J.Immunol.14786-95，1991)、融合来自携带人免疫球蛋白基因的免疫转基因小鼠的脾细胞以及融合来自携带由酵母人工染色体(YAC)插入的免疫球蛋白基因的免疫转基因小鼠的脾细胞(参见例如美国专利5,877,397；Bruggemann等人，Curr.Opin.Biotechnol.8455-58，1997；Jakobovits等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.764525-35，1995)或分离自人免疫球蛋白V区噬菌体文库。
可产生用于本发明的嵌合抗体和人源化抗体。嵌合抗体具有来源于第一种哺乳动物物种的至少一个恒定区结构域以及来源于另一种不同哺乳动物物种的至少一个可变区结构域(参见例如Morrisen等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA，816851-55，1984)。最一般而言，通过将编码来源于非人单克隆抗体的至少一个可变区结构域的多核苷酸序列，例如来源于小鼠、大鼠或仓鼠单克隆抗体的可变区，克隆入包含编码至少一个人恒定区序列的载体中，构建嵌合抗体。(参见例如Shin等人，Methods Enzymol.178459-76，1989；Walls等人，Nucleic AcidsRes.212921-29，1993)。人恒定区的选择取决于特定抗体所需的效应子作用。本领域已知的产生嵌合抗体的另一方法是同源重组(美国专利5,482,856)。优选将载体转染真核细胞，以稳定表达嵌合抗体。
非人/人嵌合抗体可经进一步遗传工程改造为″人源化″抗体。这种抗体具有来源于非人哺乳动物物种免疫球蛋白的多个CDRs、至少一个人可变构架区以及至少一个人免疫球蛋白恒定区。与非人单克隆抗体或嵌合抗体比较，人源化可能产生结合亲合力降低的抗体。因此，本领域技术人员使用一种或多种策略设计人源化抗体。
在某些实施方案中，优选使用抗体的抗原结合片段。这种片段包括分别利用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶进行蛋白水解消化而制备的Fab片段或F(ab′)2片段。通过亲合层析，例如利用固定化的蛋白质A、或固定化的配基多肽或其变体或片段，使抗原结合分段与Fc片段分离。产生Fab片段的另一方法包括温和还原F(ab′)2片段，然后烷基化(参见例如Weir，Handbook of Experimental Immunology，1986，BlackwellScientific，Boston)。
任何上述Ig分子的非人、人、或人源化的重链和轻链可变区均可以构建为单链Fv(sFv)片段(单链抗体)。参见例如Bird等人，Science242423-426，1988；Huston等人，Proc.Nat1.Acad.Sci.USA 855879-5883，1988。通过符合读框的连接sFv的编码多核苷酸序列和多种效应子蛋白质的编码多核苷酸序列，可产生多功能融合蛋白质。这些方法为本领域已知并公开于例如EP-B1-0318554、美国专利5,132,405、美国专利5,091,513和美国专利5,476,786。
选择特异性结合配基多肽或其变体或片段的抗体的另一方法是通过噬菌体展示(参见例如Winter等人，Annul.Rev.Immunol.12；433-55，1994；Burton等人，Adv.Immunol.57191-280，1994)。可在噬菌体载体中建立人或小鼠免疫球蛋白可变区基因组合文库，能够进行筛选，以选择特异性结合配基多肽或其变体或片段的Ig片段(Fab、Fv、sFv或其多聚体)(参见例如美国专利5,223,409；Huse等人，Science2461275-81，1989；Kang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 884363-66，1991；Hoogenboom等人，J.Molec.Biol.227381-388，1992；Schlebusch等人，Hybridoma 1647-52，1997及其中引用的参考文献)。
细胞群体如上所述，本发明适用性广，适用于具有希望连接的细胞表面部分的任何细胞类型。在这方面，利用本发明方法可以增强许多细胞信号事件。这种方法可以治疗性用于离体环境，以活化和刺激输入患者中的细胞，或用于体内，以诱导靶细胞群体的细胞信号事件。然而，仍如上文所述，此处提供的原型实施例涉及T细胞，但决不受其限制。
就T细胞而言，此处所述各种扩增方法产生的T细胞群体可能取决于所用条件而具有多种特定表型特性。这种表型特性包括增强CD25、CD154、IFN-γ和GM-CSF的表达，并改变CD137、CD134、CD62L和CD49d的表达。区别控制这些部分表达的能力非常重要。例如，通过接触抗原提呈细胞(例如树突细胞、单核细胞甚至白血病B细胞或淋巴瘤)上表达的CD40分子，CD154在“定制T细胞”上高水平的表面表达将会增强抗原提呈和免疫功能。目前许多公司利用这种策略，通过抗体或重组CD40L连接CD40。此处所述方法允许以更生理学的方式(例如通过T细胞)传递相同的信号。通过定制的T细胞活化(XCELLERATE)方法增加IFN-γ分泌的能力，可有助于促进TH1型免疫应答产生，这对抗肿瘤和抗病毒应答很重要。与CD154类似，增加GM-CSF表达可用来增强APC功能，特别是通过对促进APC祖细胞成熟为更具功能的APC、例如树突细胞的作用。改变CD137和CD134的表达，可以影响T细胞对凋亡信号的抗性或敏感性。控制粘附/归巢受体、例如CD62L和/或CD49d的表达，可确定输入的T细胞归巢到淋巴器官、感染部位或肿瘤部位的能力。
本发明另一方面提供了已经在扩增之前去除CD8+或CD4+细胞的T细胞群体或组合物。在一个实施方案中，利用针对CD8+标志的抗体去除CD8+细胞。本领域普通技术人员应当轻易能够确定去除CD8+或CD4+细胞样品、或反之富集CD4+或CD8+细胞含量的各种具体方法。就富集CD4+细胞而言，本发明一方面集中在刺激已去除Tc(CD8+)细胞的T细胞群体后，鉴定极强的CD154表达特征。如上文指出，CD154是重要的免疫调节分子，其表达极其有利于放大免疫应答。因此，提高CD154表达很可能产生更有效的T细胞组合物。
本发明另一方面提供了已经在扩增之前去除或富集表达各种标志的细胞群体的T细胞群体或组合物，这些标志例如CD62L、CD45RA或CD45RO、细胞因子(例如IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10)、细胞因子受体(例如CD25)、穿孔素(perforin)、粘附分子(例如VLA-1、VLA-2、VLA-4、LPAM-1、LFA-1)和/或归巢分子(例如L-选择蛋白)。在一个实施方案中，利用抗体或针对该标志的其它配基/结合因子去除或正向选择表达其中任何标志的细胞。本领域普通技术人员应当轻易能够确定去除或正向选择表达所需标志的细胞样品的各种特定方法。
可以利用多种方法，包括本领域技术人员已知的标准流式细胞术方法和ELISA方法，来监测本发明T细胞群体的表型特性。
使用方法除上述方法之外，利用此处所述方法刺激和/或活化的细胞可能用在各种范围内。就T细胞原型实例而言，此处所述方法可用于选择性扩增CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+或CD45RO+T细胞群体，用于治疗感染性疾病、癌症以及免疫治疗。结果产生了表型独特的T细胞群体，就抗原反应性而言，它是多克隆的，但就CD4+或CD8+而言，却基本上是均一的。另外，该方法可以扩增T细胞群体，其数量足以重建个体的全部CD4+或CD8+T细胞群体(个体的淋巴细胞群体约3-5×1011)。产生的T细胞群体还可以经遗传转导用于免疫治疗，或可用于感染性因子的体外分析方法中。例如，可以从罹患癌症的个体获得肿瘤浸润的淋巴细胞群体，并刺激T细胞增殖到足够数量。得到的T细胞群体可经遗传转导而表达肿瘤坏死因子(TNF)或其它蛋白质(例如多种细胞因子、凋亡抑制剂(例如Bcl-2)、保护细胞防止HIV感染的基因(例如RevMlO或intrakines等)、靶向分子、粘附和/或归巢分子以及多种抗体或其片段(例如Scfv))，并给予个体。
本发明CD4+T细胞群体的一项特定用途是治疗个体的HIV感染。长期感染HIV最终导致CD4+T淋巴细胞数显著下降。这种下降依次引起深度免疫缺陷状态，使患者对一批致命性机会感染(opportunistic infection)敏感。补充CD4+T细胞数量到正常水平，可期望显著恢复免疫功能。因此，此处所述方法提供了选择性扩增CD4+T细胞到数量足以在HIV感染患者中重建该群体的方法。长期刺激期间还可能需要避免感染T细胞，或可能希望使T细胞对HIV感染永葆抗性。有许多技术可以使T细胞抗HIV感染、或使其在感染个体的T细胞恢复之前不能产生病毒。例如，CD4+T细胞可以在扩增之前与一种或多种抗逆转录病毒性因子培养，以抑制HIV复制或病毒产生(例如针对逆转录酶和/或其它病毒性结构成分的药物，参见例如Chow等人Nature 361650-653，1993)。
几种方法可用于遗传转导T细胞，以产生抑制HIV感染或复制的分子。例如，在各个实施方案中，T细胞可经遗传转导产生转显性(transdominant)抑制剂、″分子诱饵″、反义分子、iutrakines或毒素。这类方法进一步详述于美国专利申请08/253,751、08/253,964和PCT公布号WO 95/33823，在此全文引入以供参考。
刺激和扩增抗原特异性T细胞的方法可用于希望通过给予受试者T细胞而上调免疫应答(例如诱导应答或增强现有应答)的治疗情况下。例如，该方法可用于增强针对肿瘤相关抗原的T细胞应答。受试者的肿瘤细胞一般表达肿瘤相关抗原，而不能刺激T细胞的共刺激信号(例如，因其缺少共刺激分子的表达)。因此，肿瘤细胞可以体外接触受试者T细胞以及按照本发明方法扩增的抗原特异性T细胞，并将T细胞返回给受试者。
因此，在一个实施方案中，可以治疗恶性肿瘤、例如非何杰金氏淋巴瘤(NHL)和B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)。利用扩增T细胞的最初研究已经在NHL中进行了试验(参见Liebowitz等人Curr.Opin.Onc.10533-541，1998)，而本发明的T细胞群体提供了独特的表型特征，通过提高移植物移入(可能通过刺激CD28信号而提供)和反应性，可以显著增强免疫治疗的成功性。然而，B-CLL患者具有特别的困难，包括外周血中T细胞数量相对较低、白血病细胞的负荷较高，伴有普遍的T细胞免疫抑制。本发明的T细胞群体可提供显著改善的治疗该疾病的效率，特别是联合干细胞移植治疗时。因此，利用抗CD3x抗CD28共固定化的小球提高T细胞功能和抗CLL T细胞活性应有益处。
例如，如果已经引证B-CLL患者T细胞的CD40配基CD154的表达缺陷是该疾病主要的免疫学缺陷，本发明的T细胞群体重输注后可提供持续高水平的CD154表达，有助于其治疗。研究人员报道，CLL患者T细胞表达CD154的能力有缺陷，白血病B细胞表达CD80和CD86的能力亦然。CLL白血病B细胞无法足够表达CD28的配基，可能导致不能完全活化肿瘤反应性T细胞，因而可能代表了T细胞表观耐受状态的机理。通过可溶性抗CD40抗体或通过CD154转导的白血病B细胞研究CLL B细胞上CD40，似乎校正了CD80和CD86的表达缺陷，并上调了MHC的表面表达。Kato等人，J.Clin.Invest.1011133-1141，1998；Ranheim和Kipps，J.Exp.Med.177925-935，1993。以这种方式处理的细胞能够刺激特异性T细胞的抗肿瘤应答。
由于本发明T细胞群体表面上的CD154表达增强，这些T细胞可望与自体B-CLL细胞相互作用，从而通过提高MHC、CD80和CD86的表达而提高肿瘤的免疫原性。这将依次引起强烈的抗肿瘤应答。此外，本领域普通技术人员容易理解，利用本发明离体扩增的T细胞治疗患者，可以与传统的癌症疗法例如化学治疗相结合。在这方面，例如可能利用药物如氟达拉滨(fludarabine)或坎帕斯(campath)(BerlexLaboratories，Montville，NJ，USA)治疗患者、随后输注本发明的T细胞群体，或两者同时使用。
或者，如此处所述刺激并扩增T细胞，以诱导或增强对致病因子例如病毒(如人类免疫缺陷性病毒)、细菌、寄生虫和真菌的反应性。
本发明另外提供从T细胞混合群体中选择性扩增特定T细胞亚群的方法。特别而言，本发明提供特异性富集的、具有更高比例CD4+和CD8+双阳性T细胞的T细胞群体。
本发明另一实施方案提供了从CD4+T细胞群体中选择性扩增TH1群体的方法。在该方法中，利用抗CD28抗体例如单克隆抗体9.3共刺激CD4+T细胞，诱导分泌TH1特异性的细胞因子，包括IFN-γ，导致TH1细胞超过TH2细胞而富集。
此处观察到活化T细胞的表型特性在扩增过程中随时间而变化，并已证明T细胞在几小时之内活化(lezzi等人，Immunity 889-95，1998)。因此，结合此处描述方法，能短期内扩增T细胞群体的定制亚群。在一个实施方案中，该技术可用于受试者床边、门诊患者形式、或受试者家中，类似于肾透析的使用。例如，其中T细胞接触活化信号(例如抗CD3和抗CD28抗体等)进行温育并立即以连续流方式、或在几小时的扩增期之后返回给患者的一种方法或装置。一方面，这种扩增技术可使用具有过滤器元件的分离室(isolated chamber)，从而使3×28小球或类似包被的微粒与连续流动的血液/富集的细胞相混合。在另一实施方案中，装置内的固相表面可能包被、或直接(包括共价)、或间接(例如链亲和素/生物素等)缀合抗体或其它组分，以刺激T细胞活化和扩增。例如可以利用从患者通过包含两种或多种固定化抗体(例如抗CD3和抗CD28)或其它组分的血液/细胞收集装置和/或一次性装置、以便在细胞返回受试者之前刺激T细胞活化所需的受体(固定化于塑料表面或可分离的微粒上)的连续流路。这种系统可包括带有一次性无菌装置的白细胞提取器，接泊(docked to)现有的、或改进的厂家一次性装置(例如，固定化/包含抗体/活化组分的表面平台位于单采血液成分期间收集外周血单核细胞的袋子/容器内)。此外，该固相表面/表面平台可能是插在该装置的一个腔内、或物理上存在于一个一次性元件内的移动插件的一部分。在上述关于连续流动方面的另一个实施方案中，该系统可能包含使用血液收集装置内的小室或与到达患者的流路相连的温育小室，使细胞在室温或生理温度下接触活化组分。
在另一实施例中，血液直接从患者引入一个独立的一次性装置，该装置包含两种或多种固定化抗体(例如抗CD3和抗CD28)或其它组分，以便细胞在给予受试者之前刺激T细胞活化所需的受体(例如固定化在塑料表面或者可分离的微粒上)。在一个实施方案中，该一次性装置可能包含带有合适管道接头、适合于结合/接泊注射器和无菌接泊装置的容器(例如，一个塑料袋或瓶子)。该装置将包含用于固定化T细胞活化组分(例如抗CD3和抗CD28抗体)的固相表面；这些可能是容器自身或插件的表面，一般是平面、蚀刻平面、不规则表面、多孔盘、纤维、临床上可接受的/安全的含铁液体、小球等)。另外，使用独立装置时，受试者可以保持与该装置相连，或该装置可与患者分开。此外，该装置可以在室温下使用、或利用便携温箱在生理温度下温育。
由于采集和加工血液及血液制品的装置和方法广为人知，本领域技术人员应当轻易认识到，鉴于此处提供的教导，可轻易设计满足上述需要的多种装置、或改造现有装置。因此，尽管这些装置和方法并不受此处所述特定实施方案限制，但应包括能够维持无菌、维持血液处于补体活化下降的液体形式并且可在给与受试者之前固定化、或从血液或血液制品中分离T细胞活化所需组分(例如抗CD3和抗CD28抗体或其配基)的任何装置或方法。此外，正如本领域普通技术人员可以轻易理解到，此处所述装置和方法可以用于许多血液制品。例如，该方法和装置可用于在融化后、给予受试者之前，快速活化深低温保藏的全血、外周血单核细胞、其它深低温保藏的血液来源细胞或深低温保藏的T细胞系中的T细胞。在另一实施例中，该方法和装置可用于在给予受试者之前，加强预先离体扩增的T细胞产物或T细胞系的活性，从而提供高度活化的T细胞产物。最后容易理解，上述方法和装置可能用于自体、或受试者和供体同时进行的异体细胞疗法。
本发明的方法也可能应用于疫苗，以增强抗原反应性并增强体内作用。此外，如果本发明扩增的T细胞在体内半衰期相对较长，这些细胞能够通过携带所需目的核酸序列并有可能归巢到癌症、疾病或感染部位而用作基因治疗的理想载体。因此，本发明扩增的细胞可能与疫苗、一种或多种细胞因子、一种或多种治疗性抗体等一起传递给患者。实际上，任何得益于更强T细胞群体的疗法，都在此处所述使用方法的范围之内。
药物组合物可能单独、或连同稀释剂和/或其它组分(例如IL-2或其它细胞因子或细胞群体)作为药物组合物给予靶细胞群体，例如本发明的T细胞群体。简言之，本发明的药物组合物可能包含此处所述靶细胞群体连同一种或多种药学或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这种组合物可能包含缓冲液，例如中性盐缓冲液、磷酸盐缓冲液等；糖类，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；助剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。本发明的组合物优选配制为适于静脉内给药。
可能以适于所治疗(或预防)疾病的方式给予本发明的药物组合物。尽管可能通过临床试验确定合适剂量，但将由患者状态以及患者疾病的类型和严重性诸如此类的因素确定给予的数量和频率。
本文引用的所有参考文献在此全文引入以供参考。此外，此处所用的全部数值范围明确包括该范围内的全部整数值，并根据特定用途包括该范围内选择的特定数值。另外，提供以下实施例以供说明、而非限制。
实施例实施例IT细胞刺激在此处所述的某些实验中，使用称为XCELLERATE ITM的方法。简言之，在该方法中，从外周血单核细胞(PBMC)单采血液成分产物中制备XCELLERATEDTMT细胞。从临床患者收集单采血液成分术的PBMC之后，经洗涤，然后与″未包被″的DYNABEADSM-450Epoxy(环氧树脂)T温育。在此期间，巨噬细胞例如单核细胞摄取小球。温育之后，通过MaxSep磁力分离器处理细胞和小球，以便去除小球和附着于小球的任何单核细胞/巨噬细胞。在去除单核细胞步骤之后，取出包含总计5×108CD3+T细胞的体积，置于1.5×109DYNABEADSM-450 CD3/CD28 T，起始XCELLERATETM过程(小球与T细胞约3∶1)。然后将细胞和DYNABEADSM-450 CD3/CD28 T的混合物在37℃、5％CO2下温育约8天，以产生用于首次输注的XCELLERATED T细胞。深低温保藏剩余的去除单核细胞的PBMC，直至另一次或更进一步的细胞产物扩增(约21天后)，届时融化、洗涤这些细胞然后取出包含总计5×108CD3+T细胞的体积，置于1.5×109DYNABEADSM-450 CD3/CD28 T，起始用于另一次输注的XCELLERATETM过程。在37℃、5％CO2下温育～8天期间，CD3+T细胞活化并扩增。所用抗CD3 mAb为BC3(XR-CD3；FredHutchinson Cancer Research Center，Seattle，WA)，抗CD28 mAb(B-T3，XR-CD28)得自Diaclone，Besancon，France。
称为XCELLERATE IITM的改进方法使用带有一些修改的上述方法，其中不使用单独的去除单核细胞步骤，在某些方法中，细胞于最初接触小球之前冷冻并进一步进行富集和刺激。(参见图5A和5B)。此方法的一种方案是，通过单采血液成分术从供体或患者的循环血中获得T细胞。单采血液成分术产物的组分一般包括淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核细胞(白细胞)、红细胞和血小板。典型的单采血液成分术产物包含1-2×1010有核细胞。利用无钙、无镁的磷酸盐缓冲液洗涤细胞，以去除血浆蛋白质和血小板。通过离心细胞并去除上清液，然后代之以PBS，进行洗涤步骤。使用半自动化″极限沉降″离心机(COBE 2991 System，Baxter)完成该过程。将细胞保持在处理细胞时的密闭系统中。
通过去除未结合细胞、包括单核细胞，(富集活化的细胞)，然后继续刺激，来进一步处理细胞。或者，洗过的细胞可以冷冻、保存并以后处理，此处证明这提高了增殖强度并去除了粒细胞。在一个例子中，为冷冻细胞，将35ml细胞悬液置于含有35ml冷冻液的250mlCryocyte冷冻袋中。35ml细胞悬液一般包含位于PBS中的3×109-5.0×109细胞。加入等体积冷冻液(20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS)。细胞终浓度为50×106细胞/ml。Cryocyte袋可能包含30-70ml的体积，细胞浓度为10-200×106细胞/ml。一旦Cryocyte袋充满细胞和冷冻液，将袋子置于可控速率冷却器中，细胞按1℃/分钟冷冻到-80℃。然后将冷冻的细胞置于液氮贮存系统，直至需要。
从液氮贮存系统移出细胞，37℃融化。然后在COBE 2991系统中用无钙、无镁的PBS洗涤融化的细胞，以去除DMSO。洗过的细胞然后通过80微米筛孔滤器。
将大约0.5×109CD3+细胞的融化细胞置于包含100ml无钙、无镁PBS的1L Lifecell塑料袋中。PBS包含1％-5％人血清。也将1.5×1093×28小球(DYNABEADSM-450 CD3/CD28 T)置于含有细胞的袋子中(3∶1 DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T∶CD3+T-cells)。小球和细胞在室温下混合，以～1转/分(颠倒转动)约30分钟。将包含小球和细胞的袋子置于MaxSep磁力分离器(Nexell Therapeutics，Irvine，CAb)。在袋子和MaxSep之间放置塑料垫片(约6mm厚)。(为提高磁场强度，可移去垫片)。小球及附着于小球的任何细胞保留在磁铁上，PBS和未结合细胞则泵走。
利用细胞培养基(1升包含X-Vivo 15，BioWhittaker；连同50ml加热灭活的混合人血清、20ml 1M Hepes、10ml 200mM L-谷氨酰胺、有或没有约100,000 I.U.IL-2)，将3×28小球和结合到小球的富集的细胞漂洗到3L Lifecell培养袋中。将3×28小球和正选细胞转移到Lifecell袋中以后，加入培养基直至袋中含有1000ml。将含有细胞的袋子置于温箱(37℃和5％CO2)，使细胞扩增。
在第3天和第5天按1比4分开细胞。培养3天和8天以后收集细胞，测定T细胞活化和增殖。在培养第3天，通过测定细胞大小、细胞表面标志表达水平、特别是CD25和CD154的表达，评价T细胞的活化。在第8天，使细胞在重力作用下流过MaxSep磁铁(约150ml/分钟)，以去除磁性微粒，使用上述COBE装置洗涤并富集细胞，重悬于适于静脉内给药的平衡电解质溶液例如Plasma-LyteA(Baxter-Healthcare)中。
如说明书所述，XCELLERATE ITM涉及类似以上的条件，只是没有进行刺激和富集并在刺激之前去除单核细胞。
进行了XCELLERATE ITM和IITM两种方法，并于培养8天后测定T细胞增殖。在细胞培养之前富集CD3+细胞时，扩增T细胞的产量较高。(参见表1)。另外，该细胞群体具有90％以上的CD3+细胞。
表1.第8天扩增的T细胞产量
在此方面进行了进一步实验，描述了扩增细胞的总数以及9批不经CD3+富集而刺激的细胞和5批经CD3+富集而刺激的细胞的扩增倍数。(参见图1和2)。
通过在培养之前施加磁力富集细胞，有效地提高了CD3+细胞的纯度并提高了CD154的水平。(表2、图3和4描述了CD154的水平)。此外，比较T细胞群体接触不同强度磁铁时的T细胞增殖，表明接触更强的磁铁导致CD3+细胞产量更多。(表2.)表2.比较利用弱和强磁铁富集之后的T细胞增殖和细胞表面标志
表2.(续)
进行另外5次实验，比较XCELLERATE ITM和XCELLERATEIITM方法。根据该两种方法活化并培养扩增的细胞，其培养第3和8天的细胞活化标志(细胞大小、CD25表达以及CD154表达)如下表3和图6-7所示。
表3第3天的细胞活化标志
表3中的所有培养均利用冷冻/融化的细胞开始。
表3和图6-7的数据表明，XCELLERATE IITM方法产生的细胞，其第3天的细胞大小和CD25表达活化标志平均起来类似，但一般较高并在刺激以后持续较高。然而，XCELLERATE IITM方法的T细胞第3天的CD154活化标志比XCELLERATE ITM方法的T细胞高出很多。另外，如上文所示，XCELLERATE IITM方法产生的CD25和CD154水平，每个供体始终高于其它方法。
XCELLERATE IITM方法第3天的CD154表达确实高出XCELLERATE ITM很多。该观察提示，XCELLERATE IITM方法中的T细胞的活化状态高于XCELLERATE ITM方法。可以预计，体内给药时会转变为更有效的产物。
还测定了5个患者样品培养第3天的CD3+细胞纯度、CD4细胞/CD8细胞比率以及细胞存活率。经XCELLERATE ITM方法和XCELLERATE IITM方法使用的细胞的表型及存活率如下表4所示，由流式细胞术或台盼蓝染色测定。
表4
*＝在XCELLERATE I方法去除单核细胞以后、或XCELLERATE II方法磁性富集以后，第0天的CD3+T细胞纯度ψ＝在XCELLERATE I方法去除单核细胞以后、或XCELLERATE II方法磁性富集以后，第0天的CD4+∶CD8+T细胞比率实施例IICD3+T细胞富集、单核细胞去除以及粒细胞去除的效率为了此项研究，经过Xcyte治疗开发实验室的接纳，新进PBMC单采血液成分术产物经过洗涤、分离以及1.对于XCELLERATE I方法，进行单核细胞去除步骤，并且将去除CD14+单核细胞的PBMC深低温冷冻，保存于LN2制冷器的气相中(如实施例I所述)。在XCELLERATE I方法开始当天，将去除CD14+单核细胞的PBMC融化，如实施例I所述，利用DYNABEADS M-450CD3/CD28 T起始XCELLERATE方法。在这些起始步骤中，N＝5供体的CD3+T细胞富集、CD14+单核细胞去除以及粒细胞去除的平均细胞组成和平均效率如表5.1所示，每一单个供体的数据列于表5.2。
2.对于XCELLERATE II方法，PBMC单采血液成分术产物细胞深低温冷冻并保藏于LN2制冷器的气相中。在XCELLERATE II方法开始当天，将深低温保藏的PBMC单采血液成分产物细胞融化，磁性富集CD3+T细胞，如实施例I所述，利用DYNABEADS M-450CD3/CD28 T起始XCELLERATE II方法。在这些起始步骤中，N＝5供体的CD3+T细胞富集、CD14+单核细胞去除以及粒细胞去除的平均细胞组成和平均效率如表5.1所示，每一单个供体的数据列于表5.2。
如表5.1和5.2所示，在XCELLERATE II方法中，冷冻/融化PBMC单采血液成分术产物，然后直接从融化的PBMC血浆分离置换产物中磁性富集CD3+T细胞，导致CD14+单核细胞和粒细胞的有效去除(表5.1和表5.2)。XCELLERATE II方法去除CD14+单核细胞和粒细胞的效率与XCELLERATE I方法一样好，好处在于利用另外的″未包被″DYNABEADS M-450 T试剂，免去了对单独去除步骤的需要，始终导致较高的CD4/CD8比率。
表5.1在XCELLERATE I和XCELLERATE II方法的起始步骤中，CD3+T细胞富集、CD14+单核细胞去除以及粒细胞去除的平均效率(N＝5)
细胞组成由流式细胞术按照标准方法测定。
表5.2在XCELLERATE I和XCELLERATE II方法的起始步骤中，CD3+T细胞富集、CD14+单核细胞去除以及粒细胞去除效率的比较
细胞组成由流式细胞术按照标准方法测定。
通过免去CD14+单核细胞去除步骤和相关试剂而简化并合理化该方法之外，XCELLERATE IITM方法的磁性富集步骤也在T细胞活化起始时提供了较高纯度的CD3+T细胞以及较高比率的CD3+CD4+∶CD3+CD8+T细胞(表5.1和表5.2)。
也比较了XCELLERATE ITM方法和XCELLERATE IITM方法在第8天收集前，其活化的CD3+T细胞的产量、纯度、存活率及组成。
如表5.3所示，XCELLERATE IITM方法在第8天收集之前的CD3+T细胞平均产量、纯度和存活率，一般比XCELLERATE ITM方法提高。
表5.3XCELLERATE I方法和XCELLERATE II方法在第8天收集前，其活化的CD3+T细胞的产量、纯度、存活率及组成
*＝CD3+CD4+∶CD3+CD8+T细胞比率同样如表5.3所示，XCELLERATE IITM方法自始至终维持较高的CD3+CD4+∶CD3+CD8+T细胞比率。这可能由于磁性富集步骤中优先富集CD3+CD4+细胞(表5.1和5.2)。
″新进″是指新鲜、洗涤的新进单采血液成分术的细胞。表5.2中所列XCELLERATE ITM方法的起始细胞是经过洗涤、单核细胞去除和/或冷冻/融化的单采血液成分术的细胞。表5.2中所列XCELLERATE IITM方法的起始细胞是经过洗涤和冷冻/融化的单采血液成分术的细胞。
*＝CD3+CD4+∶CD3+CD8+T细胞比率表5.3表明，XCELLERATE IITM方法产生的细胞产物比XCELLERATE ITM方法的细胞产物更纯(就％CD3+细胞而言)。也就是说，XCELLERATE IITM方法的细胞产物的平均(±标准差)CD3+细胞纯度为96％±1％，而XCELLERATE ITM方法的细胞的平均纯度为93％±2％。
同样如表5.3所示，XCELLERATE IITM方法保持较高的CD4/CD8细胞比率。新进细胞的平均CD4/CD8细胞比率为2.2，XCELLERATE IITM方法产物细胞的CD4/CD8比率为1.8，而XCELLERATE ITM方法的CD4/CD8比率为1.2。
表5.3所示数据还表明，XCELLERATE IITM方法产生平均存活率为98％的产物细胞，而XCELLERATE ITM方法产生平均存活率为97％的产物细胞。
实施例III单核细胞去除使用多种″无关″(即，非抗体包被或非靶抗体包被)的Dynal小球，通过磁性去除，从T细胞制备物中除去单核细胞(CD14+巨噬细胞)。将聚蔗糖分离后的全血或单采血液成分术的外周血按小球与细胞大致2∶1的比例与Dynal绵羊抗小鼠M-450小球、或Dynal人血清白蛋白包被的小球(M-450)、或Dynal Epoxy(M-450)小球预温育，进行去除。细胞和小球于22-37℃温育1-2小时，然后磁性去除那些附着到小球或吞噬小球的细胞。将剩余细胞与未处理细胞并排培养。利用流式细胞术表征细胞于去除前后的细胞表型。
实施例IV流式细胞术设定使用Becton Dickinson FACSCALIBUR细胞仪采集和提供的全部数据。有经验的操作者可以使用任何能够进行3色分析的流式细胞仪获得一致性数据。例如，FACSCAN、Vantage Cell Sorter或其它BD产品应能收集类似数据。还有Coulter产品，例如Coulter Epic Sorter也可。
可以使用下文给出的仪器设定作为仪器形态的通用指南，以便收集这些研究中的数据。这些设定用于此处提供的实施例；然而，这些设定可以并应该由有经验的仪器操作者修改，以适当地调整补偿及检测器电压。同样，使用带有不同荧光标签的不同检测抗体，要求对任何特定仪器进行个别调整，以便给出最佳信号分离(电压)以及其它通道″串流″(bleeding-over)最小(例如补偿)。非常熟练应用补偿对照、同型对照并对T细胞生物学具有总体了解的熟练流式操作者，应当能够重现下文提交的任何数据。
另外应当注意到，许多设定、特别是电压设定可能依仪器激光效率而改变。例如，老旧的激光器产生信号可能需要比新激光器更高的电压。然而，不论利用高或低电压获得的数据均应该反映相似的生物学模式。
FACSCALIBURTM(Becton Dickinson)所用设定检测器/放大
参数检测器电压放大/增益 模式P1 FSC EOO 1.30 LinP2 SSC 370 1.00 LinP3 FL1 610 1.00 LogP4 FL2 550 1.00 LogP5 FL3 520 1.00 Log尽管电压参数通常是常数，但为了获得最大的信号分离，可能稍向上或向下调整P3、P4和P5，同时维持阴性对照信号值位于或接近对数形式信号强度的第一个十位(decade)之内(0-10)。
阈值一级参数FSC(前向散射)数值52二级参数无补偿FL1-4.0％FL2FL2-21.4％FL1FL2-2.6％FL3FL3-15.2％FL2所提供的设定近似于收集以下递交的大部分数据所用的设定，但该设定可能改变，并应该得到关于刺激的T细胞的大致相同数据。上述电压一般可接受的补偿范围如下所示FL1-FL20.4-4％FL2-FL118-27％FL2-FL32-8％FL3-FL210-16％必须由有经验的流式细胞仪操作者确定特定的补偿或电压数值，以达到以下目标1)电压使阳性和阴性信号(例如，表面抗原标志阴性与低水平表面抗原与高水平表面抗原)之间的信号分离最大。
2)补偿利用补偿对照使通道间干扰(串流)最小。
电压设定改变时，补偿设定也改变。
实施例V细胞增殖及存活率分析利用标准的台盼蓝染色并使用血细胞计数器计数细胞，测定细胞增殖和存活率。参见图5A-5B。
实施例VI活化标志分析CD154在活化的T细胞上以瞬时方式表达，已经表明它是T细胞通过APCs上CD40相互作用的要素。阻断这两种受体的相互作用可以有效改变甚至关闭免疫应答。从第3、5和8天的细胞培养物中取出通过利用3×28顺磁小球富集而刺激的T细胞等分试样，分析CD154的表达水平。其CD154的表达水平与去除单核细胞但未同3×28顺磁小球温育的T细胞(即，在培养起始时未磁性富集T细胞)相比较。通过利用抗CD3和抗CD28小球磁性富集而刺激的T细胞，在培养第三天的CD154表达水平比培养开始时未受类似刺激的细胞增加三倍，表明其显著活化。(参见图4和7)。以类似方式测定CD25水平，显示较高度活化的趋势(图6)。
一般通过多个时间点监测标志表达。在这方面，利用抗人CD4(Immunotech，Fullerton，CA)、FITC偶联的抗人CD11a(Pharmingen)、FITC偶联的抗人CD26(Pharmingen)、FITC偶联的抗人CD49d(Coulter)、FITC偶联的抗人CD54(Pharmingen和Becton Dickinson)、FITC偶联的抗人CD95(Pharmingen)、FITC偶联的抗人CD134(Pharmingen)、FITC偶联的抗人CD25 Ab(BectonDickinson，Fullerton，CA)、FITC偶联的抗人CD69 Ab(BectonDickinson)、FITC或PE偶联的抗人CD154 Ab(Becton Dickinson)或FITC或PE偶联的IgGl同型对照Ab标记细胞。在30μl终体积中，利用每种抗体2μl于4℃标记2×105细胞20分钟，洗涤并重悬于1％多聚甲醛(Sigma，St.Louis，MO)。
可能利用多种方法比较细胞表面标记分子的表达水平，因而其绝对值可能不同。但是，比较两个数值时，可能很容易算出相对倍数值。例如，利用流式细胞术方法，可以相对准确地测定不同″活化″方法产生的T细胞上的CD154表达水平。使用诸如Becton Dickinson的抗CD154-PE缀合物(目录#340477)等试剂，可以染色处于静止或活化状态的T细胞，并利用为有经验的流式细胞仪操作者熟知的方法测量该(或其它)标志的表达水平。此处描述了供CD4+和CD8+T细胞上CD154表达提高的方法。如此处所述在培养起始时同时刺激并富集T细胞，能够使表达水平提高到超过标准3×28活化所获数值，通过利用流式细胞术(BD FACSCalibur以及上述抗体)测定平均荧光强度(MFI)，其水平增加约20％至超过100％。例如，未刺激的CD4+T细胞应该是CD154阴性，因而产生的MFI数值为1-10。经过XCELLERATE ITM活化，在活化后第3天，CD4+T细胞上CD154的MFI值可能为20-40，而XCELLERATE IITM方法可能产生的CD154MFI值为60-200。就T细胞表达的CD154分子的数量而言，这些虽不是绝对值，但足以确定表达提高的相对水平。因此可以证明，XCELLERATE IITM方法与XCELLERATE ITM方法相比，活化后1-4天，CD154水平增加约1.1-20倍。
实施例VII细胞因子分析如上所述制备细胞。按照厂家说明书(Biosource International，Sunnyvale，CA)，对刺激不同时间的细胞的上清进行IL-2、IL-4、IFN-γ或TNF-α ELISA。
在另一分析中，使用流式细胞术通过CD4 T细胞的胞内染色测定IL-2。为胞内标记IL-2或IFN-γ，细胞在分析之前首先与1μml莫能菌素(Monensin(Calbiochem))温育4小时。随后如上所述染色细胞表面蛋白质，使用Becton Dickinson胞内染色试剂盒固定并透化处理，用PE偶联的抗人IL-2 Ab和FITC偶联的抗人IFN-γ或相应的对照Ab如厂家所述标记细胞。在Becton Dickinson FACSCalibur流式细胞仪上，利用Cellquest软件按照厂家说明(Becton Dickinson)进行数据获取和流式细胞术分析。
使用XCELLERATE IITM方法第3天的IFN-γ浓度比XCELLERATE ITM高约2、3、4、有时5倍(数据略)。另外，直至刺激后第5天，TNF-α水平也显著高于XCELLERATE ITM(高1.5-3倍)(数据略)。
实施例VIII再刺激后的表型性细胞分析从结束当天的培养物中取出约5×106细胞，以供再刺激分析。在几个例子中，结束日期是培养第8天。将细胞置于处在六孔板的一个孔中的5mL上述含血清、含或不含IL-2的X-vivo 15培养基中。在含细胞的孔中加入约5×106Dynabeads M-450 CD3/CD28 T小球，将细胞和小球置于37℃、5％CO2的温箱。两天后取出样品，测试存活率并利用FACS进行分析，以测定细胞大小和细胞标志和/或细胞因子表达水平，例如CD25表达水平、CD154表达水平。表6显示五位患者的样品经过XCELLERATE ITM和XCELLERATE IITM方法的如下结果。
表6使用XCELLERATE ITM和XCELLERATE IITM方法产生的XCELLERATED T细胞的再刺激分析结果
实施例IX另一种细胞收集及培养方法XCELLERATETM从人血液中分离的细胞在X-vivo培养基(Biowhittaker Inc.，Walkersville，MD)中生长，并根据用途添加或不添加20U/ml IL-2(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)、添加5％人血清(Biowhittaker)、2mM谷氨酰胺(Life Technologies，Rockville，MD)和20mM HEPES(Life Technology)。Jurkat E6-1细胞(ATCC，Manassas，VA)在添加10％FBS(Biowhittaker)、2mM谷氨酰胺(LifeTechnologies)、2mM青霉素(Life Technologies)和2mM链霉素(LifeTechnologies)的RPMI 1640(Life Technologies)中生长。
获得健康人自愿者供体的血沉棕黄层(buffy coats)(AmericanRed Cross，Portland，OR)。按照厂家说明书，利用淋巴细胞分离液(ICN Pharmaceuticals，Costa Mesa，CA)获得外周血单核细胞(PBMC)。
通过在培养瓶(Costar，Pittsburgh，PA)中与未包被的Dynabeads(Dynal，Oslo，Norway)、108细胞/ml、2小球/细胞、37℃温育2小时，从PBMC部分获得外周血淋巴细胞(PBL)。单核细胞和巨噬细胞因粘附到培养瓶而去除。或者，按照厂家说明书(Dynal)，通过吞噬顺磁小球、再利用磁性细胞分离去除这些细胞而去除它们。通过与10μg/ml的抗CD8(克隆G10-1)、CD20(克隆IF5)、CD14(克隆F13)和CD16(Coulter)单克隆抗体、108细胞/ml、4℃温育20分钟，从PBL部分中纯化CD4+细胞。细胞洗涤后经绵羊抗小鼠Ig偶联的Dynabeads(106细胞/ml、6小球/细胞、4℃ 20分钟)处理，然后通过磁性细胞分离去除两次。利用流式细胞术测量的CD4+细胞纯度通常为91-95％。
通过使PBMC首先在108细胞/ml、37℃下粘附培养瓶(Costar)2小时(无Dynabeads)而得到树突细胞。彻底洗涤后，将粘附细胞在包含500U/ml GM-CSF(Boehringer Mannheim)和12.5U/ml IL-4(Boehringer Mannheim)的培养基中培养7天。得到的细胞群体粘附力较弱并表达树突细胞特征性的表面标志(例如表达HLA-DR、CD86、CD83、CD11c并缺少CD4的表达)。(所有抗体得自Becton Dickinson，San Jose，CA)。
在组织培养皿和/或组织培养瓶(Baxter袋)或其它普通培养容器内的包括RPMI、X-Vivo 15或某些其它T细胞培养基的培养基中培养的包含T细胞的人外周血淋巴细胞，可为其它技术所利用。即使不为T细胞活化和生长所需，也在培养基中加入谷氨酰胺和HEPES。在培养基中加入胎牛血清(10％终浓度)、人A/B血清(5％)或自体人血清(5％)。在不很影响T细胞生物学或培养产量的情况下，可能改变血清的百分比。某些情况下在培养物中加入重组人IL-2。某些情况下利用下文所述磁性去除方法，去除吞噬性CD14+细胞及其它吞噬细胞。按3∶1的小球∶细胞比例加入表面上共固定化抗CD3和抗CD28的小球(3×28小球)。某些情况下按1∶1的小球∶细胞比例加入3×28小球。在其它情况下，于前5天培养中顺序加入3×28小球，最终比例第1天为1∶1，第3和5天为1∶5。将培养物保持在37℃、5％CO2。在14天期间的若干时间点取出细胞，以确定细胞密度(细胞数)、细胞大小，并通过各种表面抗原的流式细胞术分析来测定细胞表面表型。还从培养物中收集上清，测定细胞因子的分泌概况，包括但不限于IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α。随着活化细胞的生长和分裂，将培养物维持在0.2-2×106CD3+T细胞/ml。当T细胞密度大致超过1.5×106/ml时，分分培养物并加入新鲜培养基，使细胞密度为0.2-1.4×106/ml。起始刺激后约2小时-14天，当显示活化的T细胞进入比较静止阶段时(例如CD25水平降低、前向散射测定的细胞大小下降、细胞分裂速率下降)，将细胞输入给受试者或利用下列刺激物之一进行再刺激1)无刺激物2)2μg/ml植物凝集素(PHA)3)1∶1小球/细胞比例的(3×28)小球再次随时间分析细胞表型和活化/功能状态。再次收集上清，进行分泌的细胞因子分析。
利用3种不同方法刺激细胞1)按照厂家说明书(Dynal)共价偶联抗CD3(OKT-3)和抗CD28(9.3)抗体的Dynabeads(M-450)(3×28beads)，3小球/cell，2)离子霉素(Calbiochem，La Jolla，CA)(100ng/ml)和乙酸肉豆蔻酰佛波醇(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)(Calbiochem)(10ng/ml)，3)同种异体的树突细胞(25,000树突细胞/200,000 CD4细胞)。所有细胞按106细胞/ml浓度进行刺激。在96孔平底培养板中一式四份进行增殖分析。按106细胞/ml、在200μl终体积中刺激细胞。在第3天(刺激方法1和2)或第6天(刺激方法3)利用MTT分析(MTT测定试剂盒，Chemicon International Inc.，Temecula，CA)测量增殖，结果以四份的平均值表示。利用3×28小球、离子霉素/PMA或同种异体的树突细胞刺激PBL培养物或纯化的CD4+细胞培养物。
如图8A-8B所证明，利用PHA、通过绵羊抗小鼠(SAM)附着其上的3×28小球(小球上共固定化抗CD3和抗CD28)、抗体共价附着其上的3×28小球、或单个或双重固定化在平板上的抗体刺激以后，细胞数量(Coulter计数器)显著增加。图9还表明，利用共价固定化抗CD3和抗CD28的小球+/-去除单核细胞以及+/-20U IL-2刺激以后，细胞数量增加。
实施例X通过磁性去除进行的单核细胞去除。
使用各种″无关″(即，非抗体包被或非靶抗体包被)的Dynal小球，通过磁性去除，从T细胞制备物中除去单核细胞(CD14+巨噬细胞)。将ficoll分离的全血或单采血液成分术的外周血，按小球与细胞比例大致2∶1，与Dynal绵羊抗鼠M-450小球、或Dynal人血清白蛋白包被的小球(M-450)、或Dynal Epoxy(M-450)小球在22-37℃预温育1-2小时，然后磁性去除那些附着到小球或吞噬小球的细胞，从而进行去除。将剩余细胞与未处理细胞并排培养。利用流式细胞术表征细胞于去除前后的细胞表型。图9证明，缺少单核细胞时细胞增殖增强。
实施例XI活化前后动力学时间过程研究在多种条件下培养分离自全血、或单采血液成分术的外周血中的人T细胞，进行一系列实验。这些条件包括1)无刺激2)利用2μg/ml植物凝集素(PHA)刺激。
3)按3∶1或1∶1的小球与T细胞比例，利用3×28 Dynabeads(其上缀合抗CD3和抗C28的小球)刺激。
4)在有或没有外加的10U/ml(5ng/ml)重组人IL-2的情况下刺激或培养。
5)在单核细胞(CD14+巨噬细胞)存在下培养、或使用各种″无关的″Dynabeads通过磁性缺失去除前述细胞后培养。如实施例II所示进行去除。
利用流式细胞术分析下列细胞表面标志以确定细胞表型和活化状态CD2、CD3、CD4、CD8、CD14、CD19、CD20、CD25、CD45RA、CD45RO、CD54、CD62L、CDw137(41BB)、CD154。还通过流式细胞术前向散射分布图的测定来检查细胞大小。
使用诸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD14、CD19、CD20、CD45RA和CD45RO等标志测定T、B和单核细胞系及亚群，使用前向散射、CD25、CD62L、CD54、CD137、CD154测定细胞的活化状态和功能特性。
如实施例IX所述制备包含T细胞的人外周血淋巴细胞。随时间分析细胞表型和活化/功能状态。收集上清，分析分泌的细胞因子。图8和9表明，利用3×28 beads+/-10u/ml重组人IL-2以及+/-去除单核细胞活化后的人T细胞的一般生长特征。所有细胞均培养于BaxterLifecell培养瓶(300ml)中。标记″放大实验″的图是指300ml培养瓶培养物(无IL-2/去除单核细胞)放大到Baxter Lifecell 3L培养瓶。该图表明人T细胞在各种条件下扩增了约2-4个对数。
图10显示利用随时间的前向散射流式细胞术分布而确定的细胞大小的动力学分析。发现T细胞在活化之后不久增大，随后减小，以致第14天显示的前向散射分布较小，表明处于更静止的状态。
图11显示在3×28小球刺激之后，IL-2受体(CD25)随时间的表达。CD4+和CD8+T细胞均显示受体水平早期升高。到第14天，大部分T细胞的CD25表达水平大大降低，表明处于更静止的状态。
当3×28刺激的T细胞变得更为静止时(CD25低、前向散射低)，如下所述对其进行再刺激1)无刺激2)PHA 2ug/ml3)按1小球/CD3+T细胞进行3×28(Xcellerate)小球刺激然后进行细胞大小(前向散射)、表面表型、活化标志表达和细胞因子分泌的动力学分析。图12显示初级和次级刺激后的前向散射(细胞大小)动力学。图13显示初级和次级刺激后的CD25(IL-2受体)表达动力学。图16显示次级刺激后的CD4+T细胞(A)和CD8+T细胞(B)上CD54(I-CAM)的表达，其中初级刺激是PHA或3×28小球，再刺激是无、PHA或3×28小球。还使用所述CD4和CD8阳性细胞之间的标志来确定其在3×28抗体小球活化期间的相对比例(图19和22)。
实施例XII
共刺激T细胞的细胞因子表达模式分析已经广泛研究了多种细胞因子有关T细胞维持、扩增和分化的作用，其中包括IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4。值得注意的是，IL-2已经表明支持T细胞的维持和扩增。已经应用IFN-γ促进T细胞分化为TH1型免疫应答者，应用IL-4促进T细胞到TH2型应答。按实施例IX方法刺激T细胞，分析通过PHA或3×28小球活化的人初级T细胞的细胞因子释放水平，包括初级刺激应答和次级刺激应答的动力学研究。图18A-C和图23-24所示数据证明了3×28小球刺激的独特特征。在起始刺激后第2天和第4天之间(第1天未测定)，观察到IL-2和IFN-γ的水平都非常高。发现3×28小球刺激的T细胞分泌IL-2的绝对水平比PHA刺激的细胞提高了几乎5倍。还观察到3×28刺激的T细胞的IFN-γ水平比PHA刺激的T细胞提高了大约7倍。至于IL-4，初级刺激后提高不显著。有趣并可能具有重大意义之处在于，细胞经初级刺激变得静止(不再分裂或分泌上述3种细胞因子)以后，利用3×28小球、PHA对其再刺激，或者不刺激。通过3×28小球接受最初活化/扩增信号的T细胞分泌的IFN-γ水平甚至高于初级刺激后观察到的水平。相反，最初利用PHA刺激的细胞分泌的IFN-γ水平比3×28观察到的水平低很多。还观察到IL-4水平的类似差异。
这些数据提示，在3×28小球介导的活化/扩增以后获得的细胞，功能上不同于其它扩增方法、例如PHA获得的细胞。所得细胞似乎具有改变的细胞因子分泌应答，可促进很高水平的TH1和TH2细胞因子，并可能倾向于TH1型特征(IFN-γ)。在培养中分泌如此高水平的细胞因子具有许多作用，包括促使T细胞进入有利于抗肿瘤和抗病毒应答的TH1分化途径；还改变所得T细胞的基本功能(例如降低活化阈值以及抑制细胞程序性死亡途径)。
实施例XIII共刺激T细胞的CD54表达分析图16显示次级刺激后的CD4+T细胞(A)和CD8+T细胞(B)上CD54(I-CAM)的表达，其中初级刺激是PHA或3×28小球，再刺激是无、PHA或3×28小球。
实施例XIV短期活化标志分析如实施例IX所述，在T细胞刺激后不同时间监测标志的表达。在这方面，利用抗人CD4(Immunotech，Fullerton，CA)、FITC偶联的抗人CD11a(Pharmingen)、FITC偶联的抗人CD26(Pharmingen)、FITC偶联的抗人CD49d(Coulter)、FITC偶联的抗人CD54(Pharmingen和Becton Dickinson)、FITC偶联的抗人CD95(Pharmingen)、FITC偶联的抗人CD134(Pharmingen)、FITC偶联的抗人CD25 Ab(Becton Dickinson，Fullerton，CA)、FITC偶联的抗人CD69 Ab(Becton Dickinson)、FITC或PE偶联的抗人CD154 Ab(Becton Dickinson)、或FITC或PE偶联的IgG1同型对照Ab标记细胞。在30μl终体积中，利用每种抗体2μl于4℃标记2×105细胞20分钟，洗涤并重悬于1％多聚甲醛(Sigma，St.Louis，MO)。参见图21-22以及26A-26L，这些图形表明，随着活化时间以及在CD4+和CD8+细胞之间出现显著差异。
实施例XV使用不同CD3∶CD28比例的T细胞扩增使用3×28 DYNABEADSM-450上不同浓度的CD3∶CD28比例评价T细胞扩增。此处所述实验使用实施例I所述称为XCELLERATEIITM的方法。如图27所示，利用小球上1∶10的CD3∶CD28比例培养8天后意外观察到扩增约68倍。利用小球上1∶3的CD3∶CD28比例培养8天后观察到T细胞扩增35倍。1∶1的比例则观察到约24倍扩增。
实施例XVI使用不同的小球∶细胞比例进行正向选择继之以顺次加入不同量的小球来进行的T细胞扩增该实施例描述了对EXCELLERATE IITM方法(参见实施例I)的修改，以确定在前10天刺激中用于正向选择以及优化T细胞扩增的最有效的小球∶T细胞比例。
在第一个实验中，对前10天中利用1∶1的3×28小球∶细胞比例正向选择并经顺次加入的不同比例的3×28小球刺激的细胞进行比较。按3∶1和1∶1的小球∶T细胞比例，利用3×28 DYNABEADSM-450正向选择细胞。对于3∶1的比例，分离20×106细胞(假定50-60％T细胞)并重悬于1ml PBS+5％人血清中。加入30×106洗过的小球，总体积2ml。对于1∶1的比例，则在10×106总细胞中加入10×106洗过的小球。将细胞在T-25培养瓶中培养并在第3天计数并分到5ml体积的六孔板中。第5天将全部细胞分为1.25×106细胞/孔。第3、4及6-9天将全部细胞分为2.5×106细胞/孔。然后在按1∶1的小球∶细胞比例正向选择的细胞中顺次加入3×28小球。如表7概述，按最终比例0.2∶1在第3、4和5天顺次加入小球，其第10天的细胞产量最高。
表7顺次加入不同3×28小球后的第10天细胞产量
在第二个实验中，正向选择时间由0.5-1.0小时变化，小球∶细胞比例由3∶1-1∶1变化。如表8概述，利用1∶1的小球∶细胞比例选择60分钟并在第3和5天顺次加入0.2∶1比例的小球，获得最高的第10天细胞产量。然而应该注意到，利用3∶1的小球∶细胞比例选择30分钟产生了最高的正向选择产量。
表8不同正向选择比例、时间及3×28小球顺次加入后的第10天细胞产量
实施例XVII使用XCELLERATE II和WAVE生物反应器的T细胞扩增该实施例描述了使用XCELLERATE IIb方法、然后将细胞接种到WAVE生物反应器中进行的T细胞扩增。
Xcellerate方法第0天-在基本如实施例I所述的第1天，从保藏冷却器中移出所需数目的深低温保藏的CryocteTM容器，融化、洗涤并过滤。
第0天-按3∶1 Dynabeads M-450 CD3/CD28 T∶CD3+T细胞的比例，将包含约0.5×109CD3+细胞的细胞与Dynabeads M-450CD3/CD28 T混合，旋转培养。培养之后将CD3+T细胞磁性富集并同时活化。然后在Lifecell细胞培养袋中，将CD3+T细胞重悬于完全培养基。然后将包含细胞和小球的袋子置于患者专用温箱(37℃、5％CO2)。
第3天或附近-将CD3+细胞培养-扩增～3天，然后将单袋的内容物分到4只新的Lifecell袋子中。然后将这4只袋子返回到患者专用温箱(37℃、5％CO2)。
第5天或附近-将CD3+细胞再培养-扩增～2天，然后将培养袋的内容物接种到包含10L培养基体积的20L Wave生物反应器中。然后在37℃、5％CO2、15摇/分钟波动、1ml/分钟灌流下培养细胞。
每天测定细胞计数，与使用静态Xcellerate II方法刺激并扩增的细胞作比较。如图28所示，在Wave生物反应器中培养细胞时，其扩增显著提高。此外，在Wave生物反应器中细胞密度高达50×106细胞/ml，相比之下，在静态Xcellerate II方法中观察到的最大细胞密度为5×106。使用Wave生物反应器，从开始细胞计数约0.5×109细胞培养12天，总细胞计数达到约800×109。
因此，Wave生物反应器为扩增方法提供了意外的、引人注目的改善。此外，使用Wave生物反应器达到了前所未见的细胞密度和细胞绝对终产量。
实施例XVIII使用WAVE生物反应器进行T细胞扩增的替换方法发展了另外的使用Wave生物反应器或类似的生物反应器系统进行T细胞刺激/活化和扩增的策略，以实现高细胞密度和高细胞终产量。
在一个策略中，融化并洗涤细胞，如Xcellerate II方法所述开始正向选择。将正向选择的细胞转到Rocker平台上的2升Wave袋中。通过出口管向袋中引入完全培养基，使体积提高到1升。然后将袋子在不摇动的Wave平台上于37℃、5％CO2下温育。第3天开始轻摇(5-10摇/分钟)。第4-5天将内容物转入20升Wave袋中，体积提高到4升。输液系统开始每日提高袋子体积2升。第7-8天开始约0.5-3ml/分钟的灌流，出口泵设置为保持袋子体积10升。第9-12天收集细胞断开输液系统，通过出口泵移出5升上清。将角磁铁贴到输出管道。使扩增的细胞产物从20升袋子中流出，进入转运罐。处理并深低温保藏去小球的扩增细胞产物。
在另一策略中，融化并洗涤细胞，如Xcellerate II方法所述开始正向选择，但细胞和小球浓缩两次。将正向选择的细胞转到摇动平台上的20升Wave袋中。通过出口管向袋中引入完全培养基，使体积提高到2升。然后将袋子在不摇动的Wave平台上于37℃、5％CO2下温育。第3天开始轻摇(5-10摇/分钟)，体积提高到6升。第4天将输液系统设置为每日提高袋子体积2升。第6天开始约0.5-3ml/分钟的灌流，出口泵设置为保持袋子体积10升。第9-12天收集细胞断开输液系统，通过出口泵移出5升上清。将角磁铁贴到输出管道。使扩增的细胞产物从20升袋子中流出，进入转运罐。处理并深低温保藏去小球的扩增细胞产物。
本说明书所涉及和/或申请资料单所列的所有上述美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请以及非专利出版物，包括但不限于2001年9月20日提交的美国专利申请09/960,264；它是2001年2月26日提交的美国申请09/794,230的部分继续申请；它要求2000年2月24日提交的临时申请60/184,788以及2000年11月17日提交的临时申请60/249,902的权益，在此全文引入以供参考。
从上文可以理解，尽管此处为说明起见而描述了本发明的特定实施方案，但可能不偏离本发明实质和范围而对其进行各种修改。因此，除所附权利要求之外，本发明不受限制。以上引用的所有参考文献、专利、专利申请等，此处全文引入。另外，此处所述所有数值范围明确包括该范围内的全部整数值。
权利要求
1.通过细胞表面部分连接来活化及扩增T细胞群的方法，其包含a.提供其中至少一部分包含T细胞的细胞群体；b.将该细胞群体接触一种表面，其中所述表面上附着有一种或多种与至少一部分T细胞的细胞表面部分相连并刺激该T细胞的因子，并且其中该T细胞在少于约两周扩增到浓度约6×106-约90×106细胞/ml。
2.权利要求1的方法，其中所述T细胞来源于单一个体，并且其中所述T细胞在少于约两周从开始细胞数约100×106扩增到总计约100×109细胞。
3.权利要求1的方法，其中所述T细胞来源于单一个体，并且其中所述T细胞在少于约两周从开始细胞数约100×106扩增到总计约200×109细胞。
4.权利要求1的方法，其中所述T细胞来源于单一个体，并且其中所述T细胞在少于约两周从开始细胞数约100×106扩增到总计约300×109细胞。
5.权利要求1的方法，其中所述T细胞来源于单一个体，并且其中所述T细胞在少于约两周从开始细胞数约100×106扩增到总计约400×109细胞。
6.权利要求1的方法，其中所述T细胞来源于单一个体，并且其中所述T细胞在少于约两周从开始细胞数约100×106扩增到总计约500×109细胞。
7.权利要求1的方法，其中所述T细胞来源于单一个体，并且其中所述T细胞在少于约两周从开始细胞数约500×106扩增到总计约100×109细胞。
8.权利要求1的方法，其中所述T细胞来源于单一个体，并且其中所述T细胞在少于约两周从开始细胞数约500×106扩增到总计约200×109细胞。
9.权利要求1的方法，其中所述T细胞来源于单一个体，并且其中所述T细胞在少于约两周从开始细胞数约500×106扩增到总计约300×109细胞。
10.权利要求1的方法，其中所述T细胞来源于单一个体，并且其中所述T细胞在少于约两周从开始细胞数约500×106扩增到总计约400×109细胞。
11.权利要求1的方法，其中所述T细胞来源于单一个体，并且其中所述T细胞在少于约两周从开始细胞数约500×106扩增到总计约500×109细胞。
12.权利要求1的方法，其中所述T细胞在少于约两周达到浓度约50×106细胞/ml。
13.权利要求1的方法，其中所述T细胞到约第12天达到浓度约60×106细胞/ml。
14.权利要求1的方法，其中所述T细胞到约第7天达到浓度约60×106细胞/ml。
15.权利要求1的方法，其中所述T细胞到约第9天达到浓度约60×106细胞/ml。
16.权利要求1的方法，其中所述T细胞到约第12天达到浓度约70×106细胞/ml。
17.权利要求1的方法，其中所述T细胞到约第7天达到浓度约70×106细胞/ml。
18.权利要求1的方法，其中所述T细胞到约第9天达到浓度约70×106细胞/ml。
19.权利要求1的方法，其中所述T细胞到约第12天达到浓度约80×106细胞/ml。
20.权利要求1的方法，其中所述T细胞到约第7天达到浓度约80×106细胞/ml。
21.权利要求1的方法，其中所述T细胞到约第9天达到浓度约80×106细胞/ml。
22.权利要求1的方法，其中所述T细胞到约第12天达到浓度约40×106细胞/ml。
23.权利要求1的方法，其中所述T细胞到约第7天达到浓度约40×106细胞/ml。
24.权利要求1的方法，其中所述T细胞到约第9天达到浓度约40×106细胞/ml。
25.权利要求1的方法，其中所述T细胞在约第5至第12天中约24小时扩增至少约1.5倍。
26.权利要求1的方法，其中将所述T细胞群体接种到容纳约0.1-约200升体积的培养容器中。
27.权利要求26的方法，其中所述培养容器至少包含一个进口滤器和一个出口滤器。
28.权利要求26的方法，其中所述T细胞群体按起始浓度约0.2×106-约5×106细胞/ml接种。
29.权利要求1的方法，其中所述扩增在密闭系统中发生。
30.权利要求29的方法，其中所述密闭系统包含至少含有一个进口滤器、一个出口滤器以及一个取样口的容器。
31.权利要求29的方法，其中培养基通过所述密闭系统进行灌注。
32.权利要求31的方法，其中所述灌注在约第4天按约0.5ml/分钟-约3.0ml/分钟的速度开始。
33.权利要求31的方法，其中所述灌注在约第6天按约0.5ml/分钟-约3.0ml/分钟的速度开始。
34.权利要求31的方法，其中所述灌注在约第8天按约0.5ml/分钟-约3.0ml/分钟的速度开始。
35.权利要求31的方法，其中所述培养基选自RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20。
36.权利要求31的方法，其中所述培养基包含细胞因子或维生素。
37.权利要求36的方法，其中所述细胞因子选自IL-2、IFN-γ、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-12、TGFβ和TNF-α。
38.权利要求31的方法，其中所述培养基包含表面活化剂。
39.权利要求31的方法，其中所述培养基包含抗体。
40.权利要求31的方法，其中所述培养基包含人血浆蛋白制剂。
41.权利要求31的方法，其中所述培养基包含还原剂。
42.权利要求41的方法，其中所述还原剂包含N-乙酰半胱氨酸。
43.权利要求41的方法，其中所述还原剂包含2-巯基乙醇。
44.权利要求29的方法，其中所述密闭系统包含位于能够转动的平台上的生物反应器培养容器。
45.权利要求44的方法，其中所述转动平台的速度和角度可变。
46.权利要求45的方法，其中所述平台在约第3天按约5-10转/分钟开始转动。
47.权利要求45的方法，其中所述平台在约第3天按约11-15转/分钟开始转动。
48.权利要求45的方法，其中所述平台进一步包含可变的加热元件。
49.权利要求45的方法，其中所述平台进一步包含磁体。
50.权利要求45的方法，其中所述密闭系统进一步包含气体歧管。
51.权利要求45的方法，其中所述密闭系统进一步包含注射泵和控制器，用于进出该密闭系统的无菌传递。
52.权利要求1的方法，其中所述表面上附着有与T细胞的第一T细胞表面部分相连的第一因子，相同或第二表面上附着有与所述T细胞的第二部分相连的第二因子，其中所述第一与第二因子的连接可诱导该T细胞增殖。
53.权利要求52的方法，其中所述相同或第三表面上附着有与所述T细胞的第三部分相连的第三因子，其中所述第一、第二及第三因子的连接可诱导该T细胞增殖。
54.权利要求52的方法，至少一种因子是抗体或抗体片段。
55.权利要求52的方法，其中第一因子是抗体或其片段，第二因子是抗体或其片段。
56.权利要求52的方法，其中第一和第二因子是不同的抗体。
57.权利要求52的方法，其中第一因子是抗CD3抗体、抗CD2抗体、或抗CD3或抗CD2抗体的抗体片段。
58.权利要求52的方法，其中第二因子是抗CD28抗体或其抗体片段。
59.权利要求52的方法，其中第一种因子是抗CD3抗体，第二因子是抗CD28抗体。
60.权利要求59的方法，其中抗CD3抗体和抗CD28抗体按约1∶1-约1∶100的比例存在。
61.权利要求52的方法，其中第一因子是抗CD3抗体，第二因子是CD28的配基。
62.权利要求61的方法，其中所述配基是CD28的天然配基。
63.权利要求62的方法，其中所述天然配基是B7。
64.权利要求53的方法，至少一种因子是抗体或抗体片段。
65.权利要求53的方法，其中第一因子是抗体或其片段，第二因子是抗体或其片段。
66.权利要求53的方法，其中第一和第二因子是不同的抗体。
67.权利要求53的方法，其中第一因子是抗CD3抗体、抗CD2抗体、或抗CD3或抗CD2抗体的抗体片段。
68.权利要求53的方法，其中第二因子是抗CD28抗体或其抗体片段。
69.权利要求53的方法，其中第一因子是抗CD3抗体，第二因子是抗CD28抗体。
70.权利要求69的方法，其中第三因子是抗体或其抗体片段。
71.权利要求70的方法，其中所述第三因子是抗4-1 BB抗体或其抗体片段。
72.根据权利要求1的方法产生的T细胞群体。
73.一种装置，其包含a.至少包含一个出口滤器和一个进口滤器的密闭培养容器；b.所述密闭培养容器内部含有一定体积的培养基，其中包含密度为约6×106-约90×106细胞/ml的扩增的T细胞。
74.权利要求73的装置，其中所述扩增的T细胞密度为10×106细胞/ml。
75.权利要求73的装置，其中所述扩增的T细胞密度为20×106细胞/ml。
76.权利要求73的装置，其中所述扩增的T细胞密度为30×106细胞/ml。
77.权利要求73的装置，其中所述扩增的T细胞密度为40×106细胞/ml。
78.权利要求73的装置，其中所述扩增的T细胞密度为50×106细胞/ml。
79.权利要求73的装置，其中所述培养基进一步包含一种表面，其中所述表面上附着有与T细胞的第一细胞表面部分相连的第一因子，相同或第二表面上附着有与所述T细胞的第二部分相连的第二因子。
80.包含来自单一个体总计100×109活化和扩增的T细胞的组合物。
81.通过细胞表面部分连接来扩增细胞群的方法，其包含a.提供细胞群体；b.将所述细胞群体接触一种表面，其中所述表面上附着有一种或多种与至少一部分细胞的细胞表面部分相连并刺激所述细胞的因子，并且其中所述细胞在少于约两周扩增到浓度约6×106-约90×106细胞/ml。
82.权利要求81的方法，其中至少一部分所述细胞群体包含B细胞。
83.权利要求81的方法，其中至少一部分所述细胞群体包含NK细胞。
84.权利要求81的方法，其中至少一部分所述细胞群体包含树突细胞。
85.权利要求81的方法，其中至少一部分所述细胞群体包含干细胞。
86.权利要求81的方法，其中至少一部分所述细胞群体包含肝细胞。
87.权利要求81的方法，其中至少一部分所述细胞群体包含肺细胞。
88.权利要求81的方法，其中至少一部分所述细胞群体包含神经元。
89.权利要求81的方法，其中至少一部分所述细胞群体包含间充质细胞。
90.通过细胞表面部分连接来扩增T细胞群的方法，其包含a.提供其中至少一部分包含T细胞的细胞群体；b.将所述细胞群体接触一种表面，其中所述表面上附着有与T细胞的第一细胞表面部分相连的第一因子，相同或第二表面上附着有与所述T细胞的第二部分相连的第二因子，其中所述第一与第二因子的连接可诱导该T细胞增殖。c.与所述表面接触约0-5天的一段时间以后，将所述细胞群体按约0.2×106-5.0×106细胞/ml的浓度接种于密闭系统中，该密闭系统包含至少含有一个进口滤器和一个出口滤器的一次性生物反应器袋子。d.通过所述密闭系统按约1ml/分钟灌注培养基。e.在转动平台上按约5-15转/分钟转动该生物反应器袋子；并且所述T细胞在少于约两周可扩增到浓度约6×106-约90×106细胞/ml。
91.T细胞群体，其中所述T细胞正在增殖，并且其中所述群体的浓度约6×106-约90×106细胞/ml。
92.权利要求91的细胞群体，其中所述T细胞群体经少于两周的培养可达到总细胞数约100×109-约500×109。
全文摘要
本发明一般涉及活化及扩增细胞的方法，更具体而言，涉及活化和/或刺激细胞使其最大限度扩增以获得极高密度的新方法。在各种实施方案中，细胞在短时间内被活化及扩增到很高密度。在某些实施方案中，细胞在短时间内被活化及扩增到很高细胞数。本发明进一步提供了利用此处方法活化并扩增的细胞组合物。
文档编号C12N5/0789GK1556854SQ02818373
公开日2004年12月22日 申请日期2002年9月4日 优先权日2001年9月20日
发明者R·贝伦森, R 贝伦森, C·劳, 喂 , M·博奈哈迪, 赘, N·桑德, 哈德威克, S·克雷格, 曜, A·R·哈德威克, 嗣茁, D·卡拉玛兹, 钱那, D·麦克米伦, H·S·钱那 申请人:埃克斯西特治疗公司