专利名称：一种碱性果胶酶高产菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产碱性果胶酶的制作方法
技术领域：
一种碱性果胶酶高产菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产碱性果胶酶，属于生物工程技术领域，特别是一株高产碱性果胶酶的芽孢杆菌。
背景技术：
由于棉纤维中存在的天然杂质，传统的棉纺织染整加工需要耗用大量的水和化学物质，不仅消耗资源，而且严重污染环境，已不适应整个社会的发展。解决这一问题的方法就在于发展环境友好型染整工艺，即绿色染整工艺，其中应用生物技术是重要途径之一。
在棉纺织加工过程中，生物技术的应用显得越来越重要。生物酶作为一种生物催化剂，通常从霉菌和细菌等微生物产生。生物酶可使一些难溶解物质从织物上分解脱离并被洗去，从而大大减少对环境有很大影响的化学物质的使用。酶本身的清洁性使得棉纺织加工中使用生物酶后，可更有效地利用各个环节中的有机物，使之分解，减少对环境的排放。
特别是碱性果胶酶在棉纺织预处理上的优良特性，使之越来越受到人们的关注。果胶酶的产生菌很多，但能产碱性果胶酶并具有工业化使用前景的细菌却为数不多。从棉纺织精练用碱性果胶酶方面来看，嗜碱性芽孢杆菌作为生产碱性果胶酶用菌较为理想。虽然国外公司开发的一系列酶在报道中表明在国外的应用情况较好，但由于各产地的棉花品质有较大差别，致使在我们国内的棉纺织加工使用过程中效果不如人意，未得以很好地推广。同时也未见有国内自行开发碱性果胶酶的应用和其产生菌筛选等方面的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种碱性果胶酶高产菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产碱性果胶酶，所制备的碱性果胶酶可用于棉纺织物精练处理。
本发明的技术方案，从桔子表皮中分离得到一株短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)WSH03-09，已于2003年5月21日保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NOM203042。
短小芽孢杆菌CCTCC NOM203042的筛选方法是从腐烂桔子表皮经平板透明圈筛选，并比较对碱性果胶酶活性大小而得到。腐烂桔子表皮粉碎，溶于水，过滤后取滤液稀释，均匀涂布于平板培养基上，并一一对应作上记号。再将1％十六烷基三甲基溴化铵滴于原平板单菌落上，如有透明圈，比较各自透明圈直径与菌落直径之比的大小，选择大者进行发酵培养，通过比较对碱性果胶酶裂解酶活性大小，最终确定菌株。
平板筛选培养基组成(g/l)果胶5～10，蛋白胨5～10，酵母膏5～10，磷酸氢.二钾1～2，硫酸镁1～2，琼脂20；37℃平板培养24小时。
一个标准酶活单位(lu)定义为每分钟使聚半乳糖醛酸裂解产生1μmol不饱和半乳糖醛酸的酶量。采用不饱和半乳糖醛酸在235nm处的特征吸收来确定。
采用短小芽孢杆菌CCTCC NOM203042为出发菌株，经种子培养和液体深层发酵制得碱性果胶酶。
种子培养基(g/l)麸皮40～100，蔗糖25～50，蛋白胨10～20，硝酸钠5～10，硫酸镁1～2，磷酸氢二钾1～10，氯化钾0.1～1，硫酸亚铁0.1，pH7.0；培养条件培养时间为10～20小时，温度30～40℃，摇瓶转速200rpm。
发酵培养基(g/l)麸皮40～100，蔗糖10～20，硝酸钠5～10，硫酸镁1～2，磷酸氢二钾1～10，氯化钾0.1～1，硫酸亚铁0.1，pH7.0；发酵条件发酵时间20～40小时，温度30～40℃，摇瓶转速200rpm。
短小芽孢杆菌CCTCC NOM203042发酵所得碱性果胶酶的应用所制备的碱性果胶酶酶活达到20u/ml，可用于棉纺织品的精练处理。
本发明的有益效果提出了一种碱性果胶酶的高产菌，用该菌株经液体深层发酵可制备碱性果胶酶，酶活达到20u/ml，可用于棉纺织品的精练处理，可有效地改变现有传统的棉纺织品精练处理工艺，改善环境和产品品质。
生物材料样品保藏短小芽孢杆菌，保藏日期2003年5月21日，保藏单位名称及简称中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为NOM203042。
具体实施例方式
从斜面上刮取两环菌种，置于装有25ml种子培养基的250ml三角瓶中进行种子培养。条件为培养时间12小时，温度37℃，摇床转速200rpm。再以10％接种量接入装有25ml发酵培养基的250ml三角瓶中进行发酵培养。条件为培养时间32小时，温度37℃，摇床转速200rpm。即可得到酶活20u/ml的发酵液。
权利要求
1.一种碱性果胶酶高产菌，分类命名为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)WSH03-09，其保藏编号为CCTCC NOM203042。
2.一种短小芽孢杆菌CCTCC NOM203042的筛选方法，其特征是从腐烂桔子表皮经平板透明圈筛选，并比较对碱性果胶酶裂解酶活性大小而得到。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是平板透明圈筛选，平板培养基(g/l)果胶5～10，蛋白胨5～10，酵母膏5～10，磷酸氢二钾1～2，硫酸镁1～2，琼脂20；37℃平板培养24小时。
4.一种碱性果胶酶的制备方法，其特征是采用短小芽孢杆菌CCTCC NOM203042为出发菌株，经种子培养和液体深层发酵制得碱性果胶酶。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是种子培养，种子培养基(g/l)麸皮40～100，蔗糖25～50，蛋白胨10～20，硝酸钠5～10，硫酸镁1～2，磷酸氢二钾1～10，氯化钾0.1～1，硫酸亚铁0.1，pH7.0；培养条件培养时间为10～20小时，温度30～40℃。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是液体深层发酵，发酵培养基(g/l)麸皮40～100，蔗糖10～20，硝酸钠5～10，硫酸镁1～2，磷酸氢二钾1～10，氯化钾0.1～1，硫酸亚铁0.1，pH7.0；发酵条件发酵时间20～40小时，温度30～40℃。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征是所制备的碱性果胶酶酶活达到20u/ml。
8.短小芽孢杆菌CCTCC NOM203042发酵所制备碱性果胶酶的应用，其特征是可用于棉纺织品精练处理。
全文摘要
一种碱性果胶酶高产菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产碱性果胶酶，属于生物工程技术领域。本发明菌种为一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CCTCC NOM203042，是从腐烂桔子表皮上经平板透明圈筛选而得。经液体深层发酵可得碱生果胶酶酶活20u/ml。该碱性果胶酶可用于棉纺织物精练处理。
文档编号C12N9/24GK1480529SQ0313195
公开日2004年3月10日 申请日期2003年6月18日 优先权日2003年6月18日
发明者陈坚, 堵国成, 董云舟, 伦世仪, 陈 坚 申请人:江南大学