专利名称：生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于定量例如血液、血清和血浆等被测试样中的低密度脂蛋白(LDL)中含有的胆固醇的生物传感器。特别是，本发明涉及一步就可以测定前述胆固醇的生物传感器的结构。
背景技术：
近年来，诊断高胆固醇血症时，重视的是LDL中所含的胆固醇的浓度。以往，这种LDL胆固醇的定量方法通过使用超离心法的分级操作进行。但是，该方法需要特殊的装置，而且存在测定所需的时间长的问题。
另外，作为不进行超离心的定量方法，通常的方法是分别求出试样中的总胆固醇、高密度脂蛋白(HDL)胆固醇和甘油三酯的浓度，根据Friedewald式算出LDL胆固醇的浓度。但是，该方法在使用甘油三酯值高的被测试样的场合，在再现性、正确性方面，存在可信性低的问题。
而且，近年来，作为不需要甘油三酯值的低密度脂蛋白中胆固醇的定量方法，提出了如下方法。
第一，例如在非专利文献1中，记载了下述方法，即在α环糊精硫酸、葡聚糖硫酸、镁离子和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚聚醚存在下，通过酶只氧化低密度脂蛋白中的胆固醇，根据色素的发色程度来定量低密度脂蛋白中的胆固醇浓度。
上述非专利文献1记载的方法是通过α环糊精硫酸、葡聚糖硫酸和镁离子，使酶对被测试样中的乳糜微粒中胆固醇和超低密度脂蛋白(VLDL)中胆固醇的反应性减少，而且，通过聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚聚醚，使酶对被测试样中的高密度脂蛋白中胆固醇的反应性减少的方法。
第二，例如在专利文献1中，提出了下述方法，即在两性表面活性剂和具有羧基或者磺酸基的脂族族胺类的存在下，通过酶只氧化低密度脂蛋白中的胆固醇，根据色素的发色程度来定量低密度脂蛋白中的胆固醇浓度。
上述专利文献1记载的方法是在两性表面活性剂存在下，使酶对低密度脂蛋白以外的脂蛋白中所含的胆固醇的反应性减少的方法。
第三，例如在专利文献2中，提出了下述方法，即用聚阳离子处理被测试样，从而通过酶只氧化低密度脂蛋白中的胆固醇，根据色素的发色程度来定量低密度脂蛋白中的胆固醇浓度。
第四，例如在专利文献3记载的方法中，首先，通过多孔性二氧化硅吸附高密度脂蛋白，进一步通过聚阴离子/二价阳离子，形成与乳糜微粒和超低密度脂蛋白不溶性的复合体。将该复合体作为沉淀，从溶液中除去后，通过酶只氧化低密度脂蛋白中的胆固醇，根据色素的发色程度来定量低密度脂蛋白中的胆固醇浓度。
通过上述第一～第四的方法，即使使用甘油三酯值高的被测试样的场合，也可以测定低密度脂蛋白胆固醇的值。
非专利文献1Clinica1 Chemistry，1998年，第44卷，第522页专利文献1特开平10-84997号公报专利文献2美国专利第4185963号说明书专利文献3美国专利第5401466号说明书发明内容但是，对于上述第一～第四的方法，为了再现性和正确性良好地进行测定，均要准备第一试剂水溶液和第二试剂水溶液，在一定时间，要分别正确添加相对于血清试样而确定的量的第一试剂水溶液和第二试剂水溶液，存在操作烦杂的问题。
因此，鉴于如上所述的以往的问题，本发明的目的在于提供一种生物传感器，即使对添加试剂不熟练的患者使用的场合，也不需要分别以各自的时间向被测试样中添加2种以上的试剂，而只需一次供给试样，即可正确且简便地测定LDL胆固醇。特别是，本发明的目的在于提供一种生物传感器，即使使用者不维护，也能够再现性和正确性良好地进行定量。
本发明涉及一种生物传感器，其特征在于，将胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶、对低密度脂蛋白选择性进行酶反应的试剂、过氧化酶和色素源干燥担载在载体上。
前述生物传感器在前述基板上具有载体，前述载体优选是滤纸、玻璃滤器、膜滤器或者纤维素纤维。
另外，在前述生物传感器中，优选通过冷冻干燥、高温干燥、暖风干燥或者自然干燥，将前述胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶、前述试剂、前述过氧化酶和前述色素源担载在前述载体上。
前述试剂优选与前述胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶和前述色素源分离进行担载。
前述生物传感器进一步具有流路，优选在前述流路的上游侧设置前述试剂，在前述流路的下游侧设置前述胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶、前述过氧化酶和前述色素源。
前述试剂优选是表面活性剂。
前述表面活性剂优选是非离子类表面活性剂或者阴离子类表面活性剂。
另外，前述非离子类表面活性剂优选是非离子类聚合物。
前述生物传感器进一步优选含有α环糊精硫酸。而且，前述生物传感器优选含有葡聚糖硫酸。
另外，前述生物传感器优选含有pH缓冲剂。
而且，前述生物传感器优选含有二价的金属盐。前述二价金属盐优选是镁盐、钙盐或者锰盐。
另外，前述生物传感器优选含有脂蛋白脂肪酶。
另外，前述生物传感器优选含有从试样分离特定成分的过滤器。
另外，前述试样通过前述过滤器内的方向优选相对于重力方向是平行、垂直或者倾斜的。
而且，本发明还涉及测试系统，其特征在于具备前述生物传感器和第一光源。
该测试系统优选还具备第二光源。
通过前述第一光源和前述第二光源，均可以进行试样的检测。另外，通过来自前述第二光源的信息，也可以修改来自前述第一光源的信息。
使用本发明的生物传感器，通过一次供给试样，即可再现性和正确性良好地定量LDL中的胆固醇。另外，使用本发明的生物传感器的定量方法无需烦杂的操作，因此适合于医院、临床检查室等专门机构以外的LDL胆固醇测定试剂盒。
即，使用本发明的生物传感器，即使对添加试剂不熟练的患者使用的场合，也不需要分别以各自的时间向被测试样中添加2种以上的试剂，只需一次供给被测试样，即可正确且简便地测定LDL胆固醇。
而且，在本发明的生物传感器中，干燥试剂，特别是充分除去含有胆固醇氧化酶和过氧化酶等酶的试剂层的水分，具有保存时也不劣化的优点，具有不需要维护的优点。
图1是本发明第一种实施方式的干式测试条的分解透视图。
图2是本发明第二种实施方式的干式测试条的分解透视图。
图3是本发明第三种实施方式的干式测试条的分解透视图。
图4是本发明第四种实施方式的干式测试条的分解透视图。
图5是本发明第五种实施方式的干式测试条的分解透视图。
图6是使用含有本发明干式测试条的测试系统进行测定的流程图。
其中，1、11、51基板2、12、32、52透明片材3、13、33、43、53、63试剂干燥体4、14、24、34、54隔板5、15、25盖6、16空气孔7、17、37、47、57、67过滤器8、18试样供给部9、19、29、59孔60筛网70容器具体实施方式
为了达到如上所述的目的，本发明提供包括干式测试条的生物传感器，其特征在于，含有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶、对LDL选择性进行酶反应的试剂、过氧化物酶和色素源，它们均担载在基材上。
前述生物传感器进一步具有载体，优选将前述胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶、前述试剂、前述过氧化酶和前述色素源干燥担载在前述载体上或者前述载体内。
前述载体优选选自滤纸、玻璃滤器、膜滤器、纤维素纤维。另外，为了干燥担载试剂而使用的载体也可以起分离血球的作用。再者，也可以进一步设置筛网。该载体保持在基板上。
在此，说明本发明的生物传感器的LDL胆固醇的测定原理。将含有例如低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)和超低密度脂蛋白(VLDL)的试样导入本发明的生物传感器中时，通过对LDL选择性进行酶反应的试剂，只有LDL被可溶化。之后，LDL中的胆固醇与胆固醇酯酶反应，生成胆固醇，该胆固醇与胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶反应，生成胆甾烯酮和过氧化氢(H2O2)。
接着，该过氧化氢在过氧化酶的存在下，与例如4-氨基安替比林和HDAOS等反应，生成醌色素。然后，通过测定该醌色素的极大吸收(583nm)，可以定量前述试样中的LDL胆固醇。
作为前述色素源，可以举出4-氨基安替比林、苯酚、3-羟基-2，4，6-三碘苯甲酸、[3-二(4-氯苯基)甲基-4-二甲基氨基苯基]胺(BCMA)等。
还可以进一步添加トリンダ-试剂，即N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰基乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-间-甲苯胺(TOOS)。在トリンダ-试剂中，在难于受到试样中其它成分影响方面，优选HDAOS。另外，作为化学发光的发色源，也可以使用鲁米诺或者异鲁米诺等。
另外，作为保持前述载体的基板的材料，只要是具有某种程度的刚性即可，没有特别的限制。可以举出聚乙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚酰胺或者饱和聚酯等热塑性树脂、或者尿素树脂、蜜胺树脂、酚树脂、环氧树脂或者不饱和聚酯树脂等热固性树脂等。
干燥担载的方法可以是以往的方法，例如冷冻干燥、高温干燥、暖风干燥或者自然干燥。从试剂的保存稳定性优良的理由来看，优选冷冻干燥，从干燥时间短的理由来看，优选高温干燥或者暖风干燥。
对前述LDL选择性进行酶反应的试剂优选与前述胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶、前述过氧化酶和前述色素源分离设置。这是因为在保管干式测试条中，前述试剂对前述胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶没有影响。
而且，在本发明的生物传感器中，优选例如在前述基板上设置流路，在前述流路的上游侧配置对前述LDL选择性进行酶反应的试剂，在前述流路的下游侧设置前述胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶、前述过氧化酶或者前述色素源。这是因为对于血液或者血浆等试样，使前述试剂充分发挥作用后，进行胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的酶反应，从而可以对LDL发挥更高的选择性。
对LDL选择性进行酶反应的试剂优选是表面活性剂。前述表面活性剂优选是非离子类表面活性剂或者阴离子类表面活性剂。另外，非离子类表面活性剂优选是非离子类聚合物。
另外，作为非离子类表面活性剂，优选聚氧乙烯烷基醚或者聚氧乙烯烷基芳基醚等，作为非离子类聚合物，优选聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。
再者，作为阴离子类表面活性剂，优选十二烷基硫酸钠等。
而且，本发明的生物传感器优选包含α环糊精硫酸。此时，和对LDL选择性进行酶反应的试剂一样，可以包含在玻璃滤器等载体中。另外，除α环糊精硫酸之外，也可以使用α环糊精、β环糊精、γ环糊精、α环糊精硫酸、β环糊精硫酸、二甲基-β-环糊精、三甲基-β-环糊精等环糊精衍生物。而且也可以添加葡聚糖硫酸。
而且，为了更有效地促进对LDL选择性进行酶反应的试剂的作用和胆固醇氧化酶等酶反应，也可以往本发明的生物传感器中添加pH缓冲剂。此时，和胆固醇氧化酶等酶一样，也可以包含在玻璃滤器等载体中。作为pH缓冲剂，可以举出邻苯二甲酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、磷酸盐、醋酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)等。另外，グツド缓冲剂即2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、哌嗪-N，N’-二(2-乙磺酸)(PIPES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)可以将pH调节到中性附近，因而也是优选的。
而且，为了提高LDL的选择性，也可以往本发明的生物传感器中添加二价的金属盐。此时，和胆固醇氧化酶等酶一样，可以包含在玻璃滤器等载体中。其中，作为二价金属盐，优选镁盐、钙盐或者锰盐等。其中，为了提高对LDL的选择性，优选镁盐。而且也可以含有脂蛋白脂肪酶。
而且，除了构成前述载体的过滤器等之外，本发明的生物传感器还可以包含第二过滤器，可以在该第二过滤器将试样中的血球分离。作为前述过滤器，可以举出玻璃滤器、滤纸、膜滤器、筛网或者棉等。
前述生物传感器通过与第一光源组合，构成测试系统。该测试系统也可进一步具备第二光源。此时，优选通过来自前述第二光源的信息，可以补正来自前述第一光源的信息。另外，通过前述第一光源或者前述第二光源，可以进行试样检测。
作为被测试样，所有体液均可，可以使用例如血液、血浆、血清或者间质液等。
下面，参照
本发明生物传感器的结构的优选实例。
实施方式1图1是本发明第一种实施方式的生物传感器的分解透视图。该生物传感器由具有2个贯通的孔9和19的基板1、透明片材2、试剂干燥体3、具有狭缝的隔板4、从血液过滤血球成分的过滤器7以及具有空气孔6的盖5构成。
空气孔6位于隔板4的狭缝4a的左侧端部，在狭缝4a右半部分设置过滤器7。试剂干燥体3设置在透明片材2上，但组装后会位于狭缝4a内。另外，试剂干燥体3位于孔9的上部，孔19位于与过滤器7相对的位置。此外，基板1在右侧比透明片材2、隔板4和盖5长，形成点加试样的试样供给部8。
使用具有图1所示结构的生物传感器时，将血液等试样滴加到试样供给部8附近。供给的血液在过滤器7内水平方向移动时，血球成分被过滤。过滤的血液到达空气孔6的附近，溶解试剂干燥体3。此时，存在于过滤器7内的对LDL选择性进行酶反应的试剂与试剂干燥体3中的胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化酶、4-氨基安替比林、HDAOS作用，进行发色。通过测定部9，从基板1的下部照射发光二极管产生的光时，用光二极管检测反射光，可测定此时的发色程度。
通过以上方法，只一次供给血液，就可以一步测定血液中的LDL胆固醇。采用本实施方式的干式测试条，无需在一定时间内分别添加试剂这样烦杂的操作，能够再现性和准确性良好地进行定量。其中，由于试剂被干燥，特别是充分除去了含有胆固醇氧化酶等和过氧化酶等的试剂层的水分，因而具有即使长期保存也不会劣化的优点，没有必要养护。
另外，通过利用发光二极管和光二极管进行测光，可以检测试样的导入或者试样的种类。另外，使用第二光源，从孔19测定光，也可以进行试样检测。而且，也可以由使用第二光源的光测定得到的信息，补正使用发光二极管和光二极管的光测定得到的信息。
实施方式2图2是本实施第二种实施方式的生物传感器的分解透视图。该生物传感器由具有贯通的孔29的基板11、透明片材12、试剂干燥体13、具有狭缝14a的隔板14、从血液过滤血球成分的过滤器17、具有空气孔16的盖15、能够调节高度使之与过滤器17的高度相符的隔板24以及具有研钵状的试样供给部18的盖25构成。
空气孔16位于隔板14的狭缝14a的左侧端部，在狭缝14a的右半部分设置能够收纳过滤器17的开口部14b。试剂干燥体13设置在透明片材12上，但组装后会位于狭缝14a内。另外，试剂干燥体13位于孔29的上部。
此外，在基板11的右侧，保持过滤器17，该过滤器17嵌入到隔板14的开口部14b和盖15的空气孔16中。而且，在盖15的空气孔16之上，设置隔板24和盖25，可从试样供给部18导入试样。
使用具有图2所示结构的生物传感器时，从试样供给部18滴加血液等试样。试样供给部18由于呈研钵状，因此有助于顺利供给试样。供给的血液在过滤器17内垂直方向移动时，血球成分被过滤。此时，通过过滤器17内存在的试剂发生作用，以便对LDL选择性进行酶反应。
过滤的血液在测试条内水平移动至空气孔16的附近，溶解试剂干燥体。此时，存在于过滤器7内的对LDL选择性进行酶反应的试剂与试剂干燥体13中的胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化酶、4-氨基安替比林、HDAOS作用，与实施方式1同样进行发色。
通过以上方法，可以一步测定血液中的LDL胆固醇。而且，采用本实施方式的干式测试条，无需在一定时间内分别添加试剂，且无需进行养护。而且，血液等试样利用重力在过滤器内垂直移动，因此具有测定时间缩短这一优点。
实施方式3图3是本发明第3种实施方式的生物传感器的分解透视图。该生物传感器由具有贯通的孔34a的隔板34、透明片材32、试剂干燥体43、过滤器47、对LDL选择性进行酶反应的试剂干燥体33以及由血液过滤血球成分的过滤器37构成。
该生物传感器不具有基板，依次将试剂干燥体43、过滤器47、试剂干燥体33和过滤器37层压，收纳在透明片材32上设置的隔板34的孔34a的内部。
使用具有图3所示结构的生物传感器时，在过滤器37中滴加血液等试样。供给的血液在过滤器37或者过滤器47内垂直方向移动时，血球成分被过滤。此时，通过试剂干燥体33发生作用，以便对LDL选择性进行酶反应。血液等试样利用重力在过滤器内垂直移动，因此具有测定时间缩短这一优点。
通过以上方法，可以一步测定血液中的LDL胆固醇。采用本实施方式的生物传感器，无需在一定时间内分别添加试剂，且无需进行养护。
另外，通过过滤器47将对LDL选择性进行酶反应的试剂与胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶等分离，因此试样首先可以受到对LDL选择性进行酶反应的试剂的作用。
而且，由于能够在受到胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶等的作用之前，充分受到对LDL选择性进行酶反应的试剂的作用，因此优选。另外，还具有下述优点通过添加脂蛋白脂肪酶，有望进一步提高精度、缩短测定时间。
实施方式4图4是本发明第4种实施方式的生物传感器的分解透视图。该生物传感器由具有贯通的孔59的基板51、透明片材52、2个隔板54、试剂干燥体53、由血液过滤血球成分的过滤器57以及筛网60构成。
在基板51的中央部分设置贯通的孔59，在其两侧设置2个隔板54。而且，在孔59上，依次层压透明片材52、试剂干燥体53和过滤器57，在最上面设置筛网60。该筛网60具有与基板51相同的大小。
使用具有图4所示结构的生物传感器时，从筛网60滴加血液等试样。筛网的作用在于使血液等试样均匀扩散，防止气泡产生。供给的血液在过滤器57内垂直方向移动时，血球成分被过滤。此时，通过过滤器57内存在的试剂发生作用，以便对LDL选择性进行酶反应。
之后，若试样到达试剂干燥体53，则试剂干燥体53中的胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化酶、4-氨基安替比林、DAOS发生作用，与实施方式1同样进行发色。通过以上方法，可以一步测定血液中的LDL胆固醇。采用本实施方式的干式测试条，无需在一定时间内分别添加试剂，且无需进行养护。
实施方式5图5是本发明第5种实施方式的生物传感器的分解透视图。该生物传感器由具有倾斜开口部的容器70、试剂干燥体63、由血液过滤血球成分的过滤器67和筛网60构成。
在贯通容器70内的倾斜开口部嵌入试剂干燥体63和过滤器67，过滤器67的上端面与容器70的上端部的高度平齐，并配置筛网60。
使用具有图5所示结构的生物传感器时，从筛网60滴加血液等试样。筛网的作用在于使血液等试样均匀扩散，防止气泡产生。供给的血液在过滤器67内斜方向移动时，血球成分被过滤。此时，通过过滤器67内存在的试剂发生作用，以便对LDL选择性进行酶反应。
之后，若试样到达试剂干燥体63，则试剂干燥体63中的胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化酶、4-氨基安替比林、DAOS发生作用，与实施方式1同样进行发色。通过以上方法，可以一步测定血液中的LDL胆固醇。
采用本实施方式的生物传感器，由于流路相对于重力方向是倾斜的，因此具有下述优点试样利用重力迅速被过滤，而且易于看到过滤的情况。另外，试剂干燥体63的位置在最前面，因此容易通过目视确认试样是否达到容器70的下部。
这里，以图1所示的第一种实施方式的生物传感器为代表，参照图6所示的流程图，说明使用了本发明生物传感器的测试系统的使用方法(定量方法)。
首先，供给血液等试样(步骤1)。在用光源1检测试样的导入之前呈保持状态，如果检测试样的导入(步骤2)，则接着利用光源2进行检测。如果没有用光源2检测试样的导入(步骤3)，则出现错误，中止测定。
如果用光源2检测试样的导入(步骤3)，则通过光源2测定发色的程度(步骤4)，进行LDL胆固醇的定量，并显示测定结果(步骤5)。另外，如果需要，通过利用光源1或2的补正信息(步骤6)进行补正，显示测定结果(步骤5)。特别是使用光源2进行补正的场合，基于发色前后的信息进行补正。
另外，同时且断续地进行测定部孔9中的光的测定和测定部孔19中的光的测定，可以测定试样从孔19(光源1侧)移动至孔9(光源2侧)的时间。试样的移动时间超过一定时间的场合，认为试样的导入存在异常，也可以终止测定。
另外，如果分离了对LDL选择性进行酶反应的试剂和胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶等，试样可首先受到对LDL选择性进行酶反应的试剂的作用。而且，优选在受到胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶等的作用之前，能够充分受到对LDL选择性进行酶反应的试剂的作用。另外，试样供给部8优选可以将供给的试样保持一定时间。
另外，为了避免空气中的水分的吸湿，优选密闭保存制作的生物传感器。如果在硅胶、氧化铝等吸湿剂存在下保存更好。进行铝包装等的话，可以遮断光，抑制试剂的劣化，因此优选。另外，作为试剂类的干燥方法，也可以采用冷冻干燥。如果采用冷冻干燥，则能够充分除去试剂中的水分，因此可以抑制试剂的劣化。
下面，用实施例更详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。
实施例实施例1在本实施例中，制作图1所示的生物传感器，将血液用作试样，测定血液中的LDL胆固醇。
首先，准备将聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)制的基板1、PET制的透明片材2和PET制的隔板4压接得到的接合体。设置与隔板4的狭缝4a的右侧部分相符，从血液过滤血球成分的过滤器7。作为过滤器7，使用玻璃滤器。然后，将含有对LDL选择性进行酶反应的试剂聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、α环糊精硫酸酯、葡聚糖硫酸酯和氯化镁的水溶液，滴加到插入隔板4的过滤器7内并干燥。
接着，将含有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化酶、4-氨基安替比林、HDAOS和MOPS(pH7.0)的水溶液滴加到透明片材2上并干燥(试剂干燥体3)。最后，从上面放置PET制的盖5，进行热压接，制作本发明的干式测试条。
将血液滴加到试样供给部8附近。供给的血液在过滤器7内水平方向移动时，血球成分被过滤。过滤的血液到达空气孔6的附近，溶解试剂干燥体3。此时，存在于过滤器7内的对LDL选择性进行酶反应的试剂类，与试剂干燥体3中的胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化酶、4-氨基安替比林、HDAOS作用，进行发色。
通过测定部，即孔9，从基板1的下部照射发光二极管产生的光，用光二极管检测反射光，从而测定此时的发色程度。通过以上方法，仅一次供给血液，就可以一步测定血液中的LDL胆固醇。
实施例2在本实施例中，制作如图2所示的生物传感器，将血液用作试样，测定血液中的LDL胆固醇。
首先，准备用粘结剂将PET制的基板11、PET制的透明片材12和PET制的隔板14固定得到的接合体。将含有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化酶、4-氨基安替比林、HDAOS和MOPS(pH7.0)的水溶液滴加到透明片材12上，并干燥(试剂干燥体13)。
在其上用粘结剂固定PET制的盖15、PET制的隔板24和PET制的盖25，从试样供给部18插入由血液过滤血球成分的过滤器17。最后，将含有聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、α环糊精硫酸酯、葡聚糖硫酸酯和氯化镁的水溶液滴加到过滤器17中，并干燥。
从试样供给部18滴加血液。试样供给部18呈研钵状，因此有助于顺利供给试样。供给的血液在过滤器内垂直方向移动时，血球成分被过滤。此时，过滤器17内存在的试剂发生作用，以便对LDL选择性进行酶反应。过滤的血液在传感条内水平移动至空气孔16的附近，溶解试剂干燥体13。
此时，存在于过滤器17内的对LDL选择性进行酶反应的试剂与试剂干燥体13中的胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化酶、4-氨基安替比林、HDAOS作用，与实施方式1同样进行发色。通过以上方法，可以一步测定血液中的LDL胆固醇。
实施例3在本实施例中，制作如图3所示的生物传感器，将血液用作试样，测定血液中的LDL胆固醇。
首先准备将PET制的隔板34和PET制的透明片材32热压接得到的接合体。在隔板34的孔34a中滴加含有脂蛋白脂肪酶、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化酶、4-氨基安替比林、DAOS和MOPS(pH7.0)的水溶液，并干燥(试剂干燥体43)。
在其上重叠过滤器47。将聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、α环糊精硫酸酯、葡聚糖硫酸酯和氯化镁作为颗粒状的试剂干燥体33载置在过滤器47上。最后，载置过滤器37，制作本发明的生物传感器。使用玻璃滤器作为过滤器37和过滤器47。
在过滤器37中滴加血液。供给的血液在过滤器37或者过滤器47内垂直方向移动时，血球成分被过滤。此时，通过试剂干燥体43发生作用，以便对LDL选择性进行酶反应。血液利用重力在过滤器内垂直移动，所以具有测定时间缩短这一优点。通过以上方法，可以一步测定血液中的LDL胆固醇。
另外，通过过滤器47将对LDL选择性进行酶反应的试剂与胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶等酶分离，因此试样首先可以受到对LDL选择性进行酶反应的试剂的作用。而且，在受到胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶等酶的作用之前，可充分受到对LDL选择性进行酶反应的试剂的作用。
实施例4在本实施例中，制作如图4所示的生物传感器，将血液用作试样，测定血液中的LDL胆固醇。
首先，准备用粘结剂将PET制的基板51、PET制的透明片材52和PET制的隔板54固定得到的接合体。将含有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化酶、4-氨基安替比林、DAOS和MOPS(pH7.0)的水溶液滴加到透明片材52上，并干燥(试剂干燥体53)。
然后，将滴加了含有聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、α环糊精硫酸酯、葡聚糖硫酸酯和氯化镁的水溶液并干燥后的过滤器57，载置在试剂干燥体53上。最后，用粘结剂固定筛网60，制作本发明的生物传感器。
从筛网60滴加血液。筛网的作用在于使血液均匀扩散，防止气泡产生。供给的血液在过滤器57内垂直方向移动时，血球成分被过滤。此时，通过过滤器57内存在的试剂发生作用，以便对LDL选择性进行酶反应。之后，如果达到试剂干燥体53，则试剂干燥体53中的胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化酶、4-氨基安替比林、DAOS发生作用，与实施方式1同样进行发色。通过以上方法，可以一步测定血液中的LDL胆固醇。
实施例5在本实施例中，制作如图5所示的生物传感器，将血液用作试样，测定血液中的LDL胆固醇。
首先，在带有倾斜开口部的容器70的底部滴加含有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化酶、4-氨基安替比林、DAOS和MOPS(pH7.0)的水溶液，干燥(试剂干燥体63)。
然后，将滴加了含有聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、α环糊精硫酸酯、葡聚糖硫酸酯和氯化镁的水溶液并干燥后的过滤器67，载置在试剂干燥体63上。最后，用粘结剂将筛网60固定在容器70上，制作本发明的生物传感器。
从筛网60滴加血液。筛网的作用在于使血液均匀扩散，防止气泡产生。供给的血液在过滤器67内斜方向移动时，血球成分被过滤。此时，通过过滤器67内存在的试剂发生作用，以便对LDL选择性进行酶反应。之后，如果达到试剂干燥体63，则试剂干燥体63中的胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化酶、4-氨基安替比林、DAOS发生作用，与实施方式1同样进行发色。通过以上方法，可以一步测定血液中的LDL胆固醇。
本发明的生物传感器由于能够简单地定量血液、血清和血浆等试样中低密度脂蛋白(LDL)所含的胆固醇，因此可以适用于一般家庭和医院等诊断高胆固醇血症。
权利要求
1.一种生物传感器，其特征在于，在基板上担载有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶、对低密度脂蛋白选择性进行酶反应的试剂、过氧化酶和色素源。
2.权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，在前述基板上具有载体，前述载体是滤纸、玻璃滤器、膜滤器或者纤维素纤维。
3.权利要求2所述的生物传感器，其特征在于，通过冷冻干燥、高温干燥、暖风干燥或者自然干燥将前述胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶、前述试剂、前述过氧化酶和前述色素源担载在前述载体上。
4.权利要求3所述的生物传感器，其特征在于，前述试剂与前述胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶和前述色素源分离担载。
5.权利要求4所述的生物传感器，其特征在于，进一步具有流路，在前述流路的上游侧设置前述试剂，在前述流路的下游侧设置前述胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶、前述过氧化酶和前述色素源。
6.权利要求1～5任一项所述的生物传感器，其特征在于，前述试剂是表面活性剂。
7.权利要求6所述的生物传感器，其特征在于，前述表面活性剂是非离子类表面活性剂或者阴离子类表面活性剂。
8.权利要求7所述的生物传感器，其特征在于，前述非离子类表面活性剂是非离子类聚合物。
9.权利要求1～8任一项所述的生物传感器，其特征在于，进一步包含α环糊精硫酸。
10.权利要求1～9任一项所述的生物传感器，其特征在于，进一步包含葡聚糖硫酸。
11.权利要求1～10任一项所述的生物传感器，其特征在于，进一步包含pH缓冲剂。
12.权利要求1～11任一项所述的生物传感器，其特征在于，进一步包含二价的金属盐。
13.权利要求12所述的生物传感器，其特征在于，前述二价金属盐是镁盐、钙盐或者锰盐。
14.权利要求1～13任一项所述的生物传感器，其特征在于，进一步包含脂蛋白脂肪酶。
15.权利要求1～14任一项所述的生物传感器，其特征在于，进一步包含从试样分离特定成分的过滤器。
16.权利要求15所述的生物传感器，其特征在于，前述试样通过过滤器内的方向相对于重力方向为平行、垂直或者倾斜。
17.一种测试系统，其特征在于，具备权利要求1～16任一项所述的生物传感器和第一光源。
18.权利要求17所述的测试系统，其特征在于，进一步具备第二光源。
全文摘要
本发明提供仅一次供给试样，就可以准确且简便地测定LDL胆固醇的生物传感器和测定方法。通过将胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶、对LDL选择性进行酶反应的试剂、过氧化酶和色素源担载在基板上，构成生物传感器。
文档编号C12Q1/60GK1510146SQ20031011317
公开日2004年7月7日 申请日期2003年12月25日 优先权日2002年12月25日
发明者渡边基一, 中南贵裕, 谷池优子, 宫下万里子, 吉冈俊彦, 子, 彦, 裕, 里子 申请人:松下电器产业株式会社