用o的制作方法

专利名称：用o的制作方法
技术领域：
本发明涉及将标记从合适的底物转移到O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶融合蛋白的方法和获得的新型标记融合蛋白。
背景技术：
亲电子剂如N-甲基-N-亚硝基脲的致突变效应和致癌效应主要由DNA中鸟嘌呤的O6-烷基化引起。为了保护自身免受DNA烷基化，哺乳动物和细菌具有可修复这种损伤的O6-烷基-DNA烷基转移酶(AGT)。AGT将烷基基团从烷基化鸟嘌呤和烷基化鸟嘌呤衍生物的O-6位上转移至自身半胱氨酸的巯基上，形成不可逆烷基化的AGT。其基本机理是SN2型亲核反应，这就解释了为什么不仅甲基，而且苄型基团也容易被转移。由于肿瘤细胞中AGT的过度表达是对烷基化药物(如丙卡巴肼、达卡巴肼、替莫唑胺和双-2-氯乙基-N-亚硝基脲)产生抗性的主要原因，因此AGT的抑制剂可用作化疗中的敏化剂(Pegg等，Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 51167-223，1995)。
DE 199 03 895公开了测定AGT水平的试验，该试验依赖于生物素化O6-烷基鸟嘌呤衍生物和AGT之间的反应，该反应导致AGT的生物素化。这样又可在链亲合素包被的板上分离AGT，并在例如ELISA试验中对其进行检测。这种测定可用于监测肿瘤组织中的AGT水平和筛选AGT抑制剂。
Damoiseaux等，Chembiochem，4285-287，2001公开了结合到寡聚脱氧核糖核酸中的修饰O6-烷基化鸟嘌呤衍生物，该衍生物可用作标记AGT的化学探针，这又促进了检测癌症细胞中这种酶的水平，有助于研究和化疗。
PCT/GB02/01636公开了用于检测和/或处理目标蛋白的方法，其中该蛋白与AGT融合，AGT融合蛋白与带有标记的AGT底物接触，然后用该标记检测并任选进一步处理AGT融合蛋白。其中还介绍了所用的某些AGT融合蛋白、AGT底物的一般结构原则和可用于该方法的各种标记及其检测方法。
发明概述本发明涉及一种检测和/或处理目标蛋白的方法，其中目标蛋白结合到AGT融合蛋白中，AGT融合蛋白与合适的带有标记的AGT底物接触，并在设计用于识别和/或处理标记的系统中利用该标记以任意顺序对AGT融合蛋白进行检测或处理或检测并处理。
本发明的目标蛋白选自酶、DNA结合蛋白、转录调控蛋白、膜蛋白、核受体蛋白、核定位信号蛋白、蛋白辅因子、小单亚基GTP酶、ATP结合盒蛋白、细胞内结构蛋白、具有将蛋白靶向特定细胞区室的序列的蛋白、通常用作标记或亲合标记的蛋白、以及上述蛋白的结构域或亚结构域，不包括PCT/GB02/01636(WO 02/083937)中公开的λ噬菌体主要头部蛋白D(gpD)和具体目标蛋白。
AGT融合蛋白可由一个或者多个(如1、2或3个)目标蛋白与AGT在其N端、C端或N端和C端融合组成。AGT可为人AGT(hAGT)、其他哺乳类动物的AGT或者野生型AGT被置换、缺失或插入一个或多个氨基酸的突变体。
本发明还涉及新型AGT融合蛋白，尤其是本发明方法中获得的标记AGT融合蛋白，该蛋白中包含与标记底物共价结合的AGT融合蛋白。
发明详述在本发明中，目标蛋白或多肽与O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)融合。目标蛋白或者多肽可为任何长度，任选有或没有二级、三级或四级结构，优选包含至少12个氨基酸，最多2000个氨基酸，优选50-1000个氨基酸。
本发明目标蛋白选自酶，例如转移酶(EC 2)，更具体是转移甲基以外烷基或芳基的转移酶(EC 2.5)，尤其是谷胱甘肽转移酶(EC 2.5.1.18)；或激酶，其为转移含磷基团的转移酶(EC 2.7)，尤其是以醇基为接受基团的激酶(EC 2.7.1)，例如以底物蛋白中丝氨酸和苏氨酸作为磷酸化靶点的蛋白激酶，如来自酵母的酪蛋白激酶(EC 2.7.1.37)或酪氨酸蛋白激酶(EC 2.7.1.112)；或氧化还原酶(EC 1)，更具体是作为接纳体作用于过氧化物的氧化还原酶(EC 1.11)，尤其是细胞色素C过氧化物酶(EC 1.11.1.5)；或例如水解酶(EC 3)，更具体是作用于酯键的水解酶(EC 3.1)，尤其是磷酸单脂水解酶(EC 3.1.3)，如蛋白磷酸单脂水解酶；或水解肽键的水解酶，也称为肽酶或蛋白酶(EC 3.4)，尤其是胱冬酶；DNA结合蛋白，更具体是转录阻遏蛋白，该蛋白为抑制mRNA合成的蛋白因子，具体地说是大肠杆菌(E.coli)中抑制mRNA合成的蛋白因子，尤其是LexA蛋白的DNA结合域；转录调控蛋白，更具体是转录阻遏蛋白，尤其是含有色氨酸或天冬氨酸重复结构的转录阻遏蛋白，如酿酒酵母(S.cerevisiae)转录阻遏蛋白Tup1；膜蛋白，例如具有至少一个跨膜螺旋的膜蛋白，更具体是来自内质网(ER)膜的膜蛋白，尤其是在蛋白质转运到ER中发挥活性的膜蛋白，如ER跨膜蛋白Sec62；或例如来自7跨膜螺旋(7-TM)蛋白家族的蛋白，具体是作为G蛋白偶联受体(GPCR)的7-TM蛋白，尤其是与分子量大于1kDa的大分子配体结合的蛋白，例如哺乳动物(如人)的神经激肽-1-受体(NK1)；或例如来自细胞膜的跨膜离子通道蛋白，尤其是配体门控离子通道蛋白，更具体是对5-羟色胺敏感的配体门控离子通道蛋白，如5-羟色胺受体5-HT3；或例如除离子通道和G蛋白偶联受体以外的膜受体；或例如过氧化物酶体膜蛋白，尤其是来自酵母，如Pex15蛋白；核受体蛋白，例如来自转录因子家族的核受体蛋白，更具体是来自配基可诱导转录因子家族的核受体蛋白，尤其是来自类固醇(如雌激素)受体家族的核受体，如人雌激素受体hER；核定位信号蛋白，如来自猿猴病毒40(SV40)的核定位信号；蛋白质辅因子，如在其遗传结构中含有泛素序列的蛋白，小单亚基GTP酶，更具体是膜粘附小单亚基GTP酶，如Ras家族的成员；ATP结合盒(ABC)蛋白，如多重耐药性蛋白；细胞内结构蛋白，更具体是细胞骨架蛋白，更具体是人胞质β-肌动蛋白；具有将蛋白靶向特定细胞区室的序列的蛋白，细胞区室例如为高尔基体、内质网(ER)、线粒体、质膜或过氧化物酶体；通常用作标记或亲和标记的蛋白，如用UV或可见光辐射激发时发出荧光信号的荧光蛋白，尤其是来自称为绿色荧光蛋白(GFP)家族的荧光蛋白，如称为增强型青色荧光蛋白(ECFP)的荧光蛋白；以及前面所述蛋白的结构域和亚结构域。
此外，根据来源选择本发明的目标蛋白。具体的说，目标蛋白为存在于细菌中的蛋白，如沙门氏菌(salmonella)，更具体为伤寒沙门氏菌(salmonella typhi)和鼠伤寒沙门菌(salmonella typhimurium)；分枝杆菌(mycobacteria)，更具体为结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculensis)；或葡萄球菌(staphylococci)，更具体是金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)；或病毒来源的蛋白，如人类免疫缺陷病毒(HIV)、人流感病毒和肝炎病毒。
优选目标蛋白为，例如受体，例如膜受体，尤其是7-TM受体(GPCR)；具有酶活性的受体，尤其是可能需要二聚才有活性的激酶型受体；涉及病毒停靠(virusdocking)和病毒进入细胞的离子通道蛋白和膜蛋白；或例如胞内受体，尤其是跨膜化合物的受体，如类固醇激素受体；胞外信号分子和信号因子，如白介素、生长因子、释放的激素、前列腺素、胰岛素和胰高血糖素；胞内信号级联蛋白，如涉及磷脂酰肌醇信号传导以及cAMP和cGMP产生的酶和辅因子、膜粘附和游离的激酶、激酶激酶和磷酸酶、以及胞内信号级联中最终活化或失活的酶，尤其是活化胱冬酶的酶；激素，以及涉及激素的合成、释放、活化、受体活性和失活的酶；与细胞状态相关的膜表面标志，如甲胎蛋白；以及涉及血压控制和心脏功能的蛋白，如ACE抑制剂、肾受体和肾通道蛋白、心脏钾通道蛋白。
本发明权利要求范围外的蛋白为具有λ噬菌体头部主要蛋白和PCT/GB02/01636(WO 02/083937)中公开的目标蛋白的融合蛋白，尤其是MHHHHHHSSA-hAGT，即包含His6短肽以及甲硫氨酸(M)、丝氨酸(S)和丙氨酸(A)的融合蛋白；hAGT-DHFR-HA，即hAGT、短连接肽、小鼠二氢叶酸还原酶和Ha表位的融合蛋白；V5-NLS-B42-hAGT，即V5表位、SV40大T抗原核定位序列、人工转录激活因子B42、连接肽和hAGT的融合蛋白；hAGT-HA-Ura3，即hAGT、Ha表位和酵母乳清酸脱羧酶Ura3的融合蛋白；以及hAGT-SSN6，即hAGT、短连接肽和名为SSN6的DNA转录酵母阻遏因子的融合蛋白。
本发明公开了如下制备的融合蛋白，即一方面是野生型人AGT(hAGT)、其他哺乳动物AGT(如小鼠或大鼠AGT)、或上述AGT DNA突变体，将目标蛋白(如上所述)编码序列连接到AGT DNA序列的N端或C端或同时连接到N端和C端，获得本发明的融合蛋白。融合蛋白可进一步包含合适的连接体，如在合适条件下容易被酶切的连接体，融合蛋白中连接体可在AGT和目标蛋白之间和/或两个目标蛋白之间。这种连接体的实例为，例如在DNA阶段可被合适限制性内切酶酶切的连接体，如可被Bgl II酶切的AGATCT，和/或在蛋白阶段可被合适酶(如烟草蚀纹病毒Nla(TEV)蛋白酶)酶切的连接体。
融合蛋白可以在原核宿主中表达，优选大肠杆菌，或在真核宿主中表达，如真细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)具有将底物上的标记转移到AGT半胱氨酸残基上的性质，其中AGT形成融合蛋白的部分。在优选实施方案中，AGT为已知的人O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶hAGT。也可考虑小鼠型或大鼠型酶，因为它们在与底物反应方面具有与人AGT相似的性质。在本发明中，O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶也包括野生型AGT的突变体，这种突变体的差别在于可能被置换、缺失或插入一个或多个(如1、2、3或4个)氨基酸，但它们仍保持将底物上的标记转移到融合蛋白AGT部分的性质。可用本领域技术人员熟知的技术对AGT进行化学修饰，得到AGT突变体。优选使用本领域技术人员熟知的蛋白质工程技术和/或分子进化技术来生产AGT突变体，从而产生和选择新的O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶。这种技术例如为饱和诱变、将变异引入序列任何部位的易错PCR、饱和诱变和/或易错PCR后使用DNA改组、或用来自某些不同种属的基因进行家族改组(family shuffling)。
在噬菌体展示技术的帮助下，发现了对O6-苯甲基鸟嘌呤和本发明AGT底物活性显著提高的突变体。hAGT可作为与λ噬菌体主要头部蛋白D的融合蛋白有功能地展示在λ噬菌体上，并且hAGT独特的作用机制可用于从野生型λ噬菌体混合物中筛选出展示hAGT的λ噬菌体(Damoiseaux等，ChemBiochem.4285-287，2001)。hAGT也可作为与噬菌体衣壳蛋白pIII的融合蛋白有功能地展示在丝状噬菌体上。
与O6-苯甲基鸟嘌呤在其活性位点结合的hAGT的结构中，四个氨基酸在苯甲基环的附近(Pro 140、Ser 159、Gly 160)或可能与核碱基的N9接触(Asn 157)。此前发现，在Pro 140和Gly 160位置上的突变影响hAGT与O6-苯甲基鸟嘌呤的反应(Xu-Welliver等，Biochemical Pharmacology 581279-85，1999)140位上的脯氨酸是其与苯甲基环的相互作用所必须的，160位上甘氨酸突变为色氨酸可提高hAGT对O6-苯甲基鸟嘌呤的反应活性。本发明中考虑的具体突变体为140位上为苯丙氨酸或甲硫氨酸；157位上为甘氨酸、脯氨酸、精氨酸或色氨酸，尤其是甘氨酸；159位上为谷氨酸、天冬酰胺、脯氨酸或谷氨酰胺，尤其是谷氨酸；以及160位上为丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸或缬氨酸，尤其是色氨酸。优选突变体为Asn157被甘氨酸置换且Ser159被谷氨酸置换，以及其中Gly160被丙氨酸或色氨酸置换的突变体。最优选Asn157被丝氨酸置换、Ser159被组氨酸置换并且Gly160被天冬酰胺置换的突变体。
包含目标蛋白和O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)的融合蛋白与带有标记的特殊底物接触。选择反应条件使AGT与底物反应并转移底物的标记。常用条件为室温下(例如约25℃)约pH7的缓冲溶液中。但是，应理解的是AGT也可在各种其它条件下进行反应，并且本文提到的条件并不限制本发明的范围。
AGT不可逆地将烷基从底物O6-烷基鸟嘌呤-DNA上转移到它的一个半胱氨酸残基上。可与hAGT快速反应的底物类似物是O6-苯甲基鸟嘌呤；其二级速率常数约为103/秒·M。O6-苯甲基鸟嘌呤的苯甲基环C4位上的取代并不显著影响hAGT与O6-苯甲基鸟嘌呤衍生物的反应活性，这种性质可用于将连接在苯甲环C4上的标记转移到AGT上。
本领域技术人员可根据本发明融合蛋白的用途选择底物的标记部分。包含AGT的融合蛋白与底物接触后，标记共价结合到融合蛋白上。然后可利用转移的标记进一步处理和/或检测标记AGT融合蛋白。
“处理”应理解为任何物理和化学的处理。例如，处理可以指从细胞中分离、用标准纯化技术纯化(如层析)、与化学试剂或结合配偶对的结合配偶体反应(尤其是当结合配偶体固定在固相上时)等。这种处理可取决于标记L，而且除标记融合蛋白的“检测”外也可发生。如果处理并检测标记融合蛋白，检测可在处理之前或之后，或发生在本文所定义的处理中。
具体的AGT底物为式1的化合物 其中R1-R2是被AGT识别为底物的基团；X为氧或硫；R3为芳基或杂芳基，或为以双键与CH2连接的任选取代的不饱和烷基、环烷基或杂环基；R4为连接体；L为标记、多个相同或不同的标记、将R4和R1连接形成环状底物的键或其它-R3-CH2-X-R1-R2基团。
在基团R1-R2中，残基R1优选为含有1-5个氮原子的杂芳基，被AGT识别为底物，优选式2的嘌呤基 其中R2为氢、1-10个碳原子的烷基或糖部分；R5为氢、卤基(如氯和溴)、三氟甲基或羟基；R6为氢、羟基或未取代或取代的氨基。
如果R5或R6为羟基，嘌呤基主要以互变异构体的形式存在，其中与带有R5或R6的碳原子相邻的氮带有氢原子，该氮原子与带有R5或R6的碳原子之间的双键成为单键，R5或R6分别为双键连接的氧。
取代氨基R6为1-4个碳原子的低级烷基氨基；或为酰胺基，其中酰基为1-5个碳原子的低级烷基羰基，如乙酰基、丙酰基、正丙基羰基、异丙基羰基、正丁基羰基、异丁基羰基、叔丁基羰基；或为芳基羰基，如苯甲酰基。
如果R6为未取代或取代氨基且与嘌呤基相连的基团X为氧，式2的基团为鸟嘌呤衍生物。
糖部分R2为糖的单体或寡聚体，由长度可变的间隔区连接到鸟嘌呤碱基的N9位上。本文中间隔区为烷基链(优选1-15个碳原子)、由1-200个乙二醇单位组成的聚乙二醇间隔区、酰胺基-CO-NH-、酯基-CO-O-、亚烃基-CH＝CH-，或为烷基链、聚乙二醇基、酰胺基、酯基和亚烃基的组合。
本发明中，糖部分R2可进一步包括β-D-2’-脱氧核糖基或结合到2-99个核苷酸长度的单链寡脱氧核糖核苷酸中的β-D-2’-脱氧核糖基，其中鸟嘌呤衍生物R1在寡核苷酸序列内占据任何位置。
本发明的另一个优选实施方案中，R1-R2为8-氮杂嘌呤基，其中式2基团的C-R5部分被氮置换，R2和R6具有如式2中定义的含义。
X优选为氧。
R3为芳基或杂芳基、或任选取代的不饱和烷基、环烷基或杂环基，是空间上和电荷上都被AGT接受的基团(与其反应机理一致)，这样就允许R3-R4-L单位共价转移到融合蛋白上。在R3-R4-L单位中，R4-L还可指带有多个相同或不同标记L的多个相同或不同的连接体R4。
R3为芳基，优选为苯基或萘基，尤其是苯基，如在对位或间位被R4取代的苯基。
杂芳基R3为单环或双环的杂芳基，包含0、1、2、3或4个环氮原子和0或1个氧原子和0或1个硫原子，前提条件是至少一个环碳原子被氮、氧或硫原子置换，R3具有5-12个、优选5-6个环原子；该基团除带有取代基R4外可不被取代，或被一个或多个、尤其是一个其它取代基取代，取代基选自低级烷基(如甲基)、低级烷氧基(如甲氧基或乙氧基)、卤基(如氯、溴或氟)、卤代低级烷基(如三氟甲基)或羟基。优选杂芳基R3为三唑基，尤其是在4位或5位还带有取代基R4的1-三唑基；四唑基，尤其是在4位或5位还带有取代基R4的1-四唑基或在5位还带有取代基的2-四唑基；异噁唑基，尤其是在5位还带有取代基的3-异噁唑基或在3位还带有取代基的5-异噁唑基；噻吩基，尤其是在3、4或5位、优选4位还带有取代基R4的2-噻吩基，或在4位还带有取代基R4的3-噻吩基。
任选取代的不饱和烷基R3为1或2位、优选2位还带有取代基R4的1-烯基，或1-炔基。1-烯基中可考虑的取代基为低级烷基如甲基、低级烷氧基如甲氧基、低级酰基氧基如乙酰氧基或卤基如氯。
任选取代的不饱和环烷基为具有3-7个碳原子且1位上不饱和的环烷基，如1-环戊基或1-环己基，在任何位置还可带有取代基R4。可考虑的取代基例如为低级烷基如甲基、低级烷氧基如甲氧基、低级酰基氧基如乙酰氧基或卤基如氯。
任选取代的不饱和杂环基具有3-12个原子、1-5个选自氮、氧、硫的杂原子和连接杂环基与亚甲基CH2的双键。可考虑的取代基例如为低级烷基如甲基、低级烷氧基如甲氧基、低级酰基氧基如乙酰氧基或卤基如氯。具体地说，任选取代的不饱和杂环基为部分饱和的杂芳基，该杂芳基的定义如上述对杂芳基R3的定义。这种杂环基的实例为异噁唑烷基，尤其是5位还带有取代基的3-异噁唑烷基或3位还带有取代基的5-异噁唑烷基。
连接基团R4优选为柔性连接体，它将标记L或多个相同或不同的标记L连接到底物上。根据其预期应用(即底物转移到含AGT融合蛋白的过程)选择连接体单位。连接体还增加底物在合适溶剂中的溶解度。所用的连接体在实际应用条件下具有化学稳定性。连接体既不干扰与AGT的反应也不干扰标记L的检测，但可构建为在式1化合物与含AGT融合蛋白反应后可在某一位点被裂解。
连接体R4为具有1-300个碳原子的直链或支链亚烷基，其中任选(a)一个或多个碳原子被氧置换，尤其是其中每隔两个碳的碳原子都被氧取代，如1-100个乙烯氧基单位的聚乙烯氧基；(b)一个或多个碳原子被带有氢原子的氮置换，而且相邻的碳原子被氧代取代，表现为酰胺官能团-NH-CO-；(c)一个或多个的碳原子被氧置换，而且相邻的碳原子被氧代取代，表现为酯官能团-O-CO-；(d)两个相邻碳原子之间的键为双键或三键，表现为官能团-CH＝CH-或-C＝C-；(e)一个或多个碳原子被下述基团置换亚苯基、饱和或不饱和亚环烷基、饱和或不饱和亚二环烷基(bicycloalkylene)、桥联杂芳基或桥联的饱和或不饱和杂环基；(f)两个相邻的碳原子被二硫键-S-S-置换；或者两个或更多个、尤其是两个或三个上述(a)-(f)中定义的亚烷基和/或修饰亚烷基的组合，任选包含取代基。
可考虑的取代基例如为低级烷基如甲基、低级烷氧基如甲氧基、低级酰基氧基如乙酰氧基或卤基如氯。
可考虑的其它取代基例如为α-氨基酸、尤其是天然存在的α-氨基酸结合到连接体R4中获得的取代基，其中碳原子被如(b)中定义的酰胺官能团-NH-CO-置换。在这种连接体中，亚烷基R4的部分碳链被基团-(NH-CHR-CO)n-置换，其中n在1-100之间，R代表各种α-氨基酸的残基。
其它取代基为可导致连接体R4光裂解的取代基，如邻硝基苯基。具体地说，这种取代基邻硝基苯基位于与酰胺键相邻的碳原子上，如在基团-NH-CO-CH2-CH(邻硝基苯基)-NH-CO中，或为聚乙二醇链中的取代基，如在基团-O-CH2-CH(邻硝基苯基)-O-中。其他可考虑的光裂解连接体例如为苯甲酰甲基、烷氧基二苯乙醇酮、苯甲基硫醚和三甲基乙酰乙二醇衍生物。
如上述(e)中定义置换碳原子的亚苯基例如为1，2-、1，3-或优选的1，4-亚苯基。如上述(e)中定义置换碳原子的饱和或不饱和环烷基例如为亚环戊基、亚环己基，或亚环己基还在1位或2位不饱和。如上述(e)中定义置换碳原子的饱和或不饱和亚二环烷基例如为亚二环[2.2.1]庚基或亚二环[2.2.2]辛基，任选在2位不饱和或在2位和5位双重不饱和。如上述(e)中定义置换碳原子的杂芳基例如为亚三唑基(triazolidene)，优选1，4-亚三唑基，或亚异噁唑基(isoxazolidene)，优选3，5-亚异噁唑基。如上述(e)中定义置换碳原子的饱和或不饱和杂环基例如为2，5-四氢呋喃二基、2，5-二噁烷二基或亚异噁唑烷基(isoxazolidinene)，优选3，5-亚异噁唑烷基。可考虑的特殊杂环基是糖部分，如α-或β-呋喃糖基或α-或β-吡喃糖基。
连接体R4可带有一个或多个相同或不同的标记，如1-100个相同或不同的标记，尤其是1-5个，优选1、2或3个，尤其是1个或2个相同或不同的标记。
底物的标记部分L可由本领域技术人员根据融合蛋白的应用选择。标记可使标记融合蛋白易于从其所在环境中检测和分离。其它可考虑的标记为在标记融合蛋白所在环境中可检测和诱导改变的标记，和/或通过标记特异性引入融合蛋白的物理和/或化学性质有助于处理融合蛋白的标记。
标记L的实例包括光谱探针，如荧光团、发色团、磁性探针或对比剂；放射性标记分子；特异性与配偶体结合、为特异性结合配偶对一部分的分子；可与其它生物分子相互作用的分子；可与其它生物分子相互作用的分子库；可与其它分子交联的分子；暴露于H2O2和抗坏血酸时可产生羟基的分子，如束缚金属螯合物；在光辐射下可反应性基团的分子，如孔雀绿；共价结合到固相支持体上的分子，其中固相支持体可为载玻片、微量滴定板或任何本领域技术人员已知的聚合物；可与其互补链进行碱基配对的核酸或其衍生物；具有膜插入性质的脂类或其它疏水分子；具有所需酶、化学或物理性质的生物分子；或又具有上述性质任何组合的分子。
当标记L为荧光团、发色团、磁性探针或放射活性标记等时，检测采用适合标记的标准方法，无论在体外还是在体内使用该方法。可将该方法比作绿色荧光蛋白(GFP)的应用，该蛋白与目标蛋白遗传融合，允许在活体细胞中检测蛋白。标记L的具体实例还可为表现非线性光学性质的硼化合物，或为在标记底物与AGT融合蛋白反应时可改变其光谱性质的FRET对成员。
依靠标记L的特殊性质，包含目标蛋白和AGT的融合蛋白可结合到固相支持体上。与含AGT融合蛋白反应的底物的标记可在与AGT反应时已结合到固相支持体上，或随后，即转移到AGT后，用于将AGT融合蛋白结合到固相支持体上。标记可为特异性结合配偶对的一员，该结合配偶对的另一员以共价或其它任何方式结合或可结合到固相支持体上。可考虑的特异性结合配偶对例如为生物素和亲合素或链亲合素。结合配偶对的任一部分都可作为底物的标记L，而另一员连接到固相支持体上。容易结合到固相支持体上的标记的其它实例例如为麦芽糖结合蛋白、糖蛋白、FLAG标记，或与固相支持体表面互补官能团之间可发生化学选择性反应的反应性取代基。这种反应性取代基和互补官能团对的实例例如为胺与活化羧基形成酰胺、叠氮化物与丙炔酸衍生物经历1，3-偶极环加成反应、胺和另一个胺官能团与外加的双-二羧酸衍生物类双官能团连接试剂反应产生两个酰胺键、或本领域中已知的其它组合。
方便的固相支持体的实例例如为化学修饰的氧化物表面，如二氧化硅、五氧化二钽、二氧化钛；玻璃表面，如载玻片；聚合物表面，如微量滴定板，尤其是功能化聚合物(如以小珠的形式)；化学修饰的金属表面，如贵金属表面(如金和银的表面)；或由任何上述材料制成的合适传感元件。不可逆结合和/或点样的AGT底物然后可用于以空间分辨(spatially resolved)的方式连接AGT融合蛋白，尤其是通过点样，在固相支持体上表示蛋白微阵列、DNA微阵列或小分子微阵列。
当受外界刺激时标记物L能产生反应基团(如羟基)，则该基团能使AGT融合蛋白以其类似物失活，以此来研究这些蛋白质在反应中的作用。此种标记有系留金属螯合物，其与H2O2和抗坏血酸盐接触可以生成羟基，还有发色团如孔雀绿，其在激光辐照下可生成羟基。用发色团与激光生成羟基也即常见的发色基团结合的激光失活技术(CALI)。本发明中，用孔雀绿作为发色团标记AGT融合蛋白，随后用激光辐照使AGT融合蛋白或以定时控制和空间分辨方式与AGT融合蛋白反应的蛋白失活。此方式适于体内或体外。除此之外，对与AGT融合蛋白的近似物鉴别，可用特定抗体检测该蛋白质碎片，或利用其在二维胶体电泳中的消失进行鉴别，或通过分离技术和测序技术(如质谱或通过N端分解进行蛋白质测序)鉴定蛋白质碎片。
当标记L为可与其它蛋白、例如含官能团(如顺丁烯二酰亚胺、活性酯、叠氮化物或其它本领域技术人员已知的基团)的分子交联的分子时，使可与其它蛋白相互作用(体外或体内)的AGT融合蛋白与这种标记AGT底物接触，导致AGT融合蛋白与其相互作用的蛋白通过标记共价交联。这样可鉴定与AGT融合蛋白相互反应的蛋白。用于光交联的标记L例如为二苯甲酮。交联的一个特殊方面是，标记L分子自身是AGT的底物，导致AGT融合蛋白的二聚。这种二聚体的化学结构可为对称的(同源二聚体)或不对称的(异源二聚体)。
其它可考虑的标记L例如为富勒烯、用于中子捕获处理的硼烷、如用于自定位芯片(self-addressing chips)的核苷酸或寡核苷酸、肽核酸、金属螯合物如特异性结合DNA的铂螯合物。
如果底物带有两个或更多标记，这些标记可相同或不同。
本发明提供了在体外和体内标记AGT的方法。术语体内标记AGT融合蛋白包括在细胞所有区室内进行的标记，也指在胞外隙标记AGT融合蛋白。如果AGT融合蛋白的标记在体内完成而且与AGT融合的是膜蛋白、尤其是质膜蛋白，融合蛋白的AGT部分可连接到膜的任一面，如连接到质膜的胞质面或胞外面。
如果标记在体外进行，融合蛋白的标记可在细胞提取物中进行，或使用纯化或富集形式的AGT融合蛋白。
如果标记在体内或在细胞提取物中进行，优先考虑标记宿主的内源性AGT。如果宿主细胞的内源AGT不接受O6-烷基鸟嘌呤衍生物或相关化合物作为底物，对融合蛋白的标记则是特异性的。在哺乳动物细胞中，如在人、小鼠或大鼠细胞中，可标记内源AGT。在同时标记内源AGT和AGT融合蛋白会产生问题的实验中，可使用已知的AGT缺陷细胞系。
在一个具体的方面，本发明提供了测定候选化合物或候选化合物库与靶蛋白或靶蛋白库相互作用的方法。候选化合物和靶蛋白的实例包括配基和蛋白质、药物和药物靶点、或小分子和蛋白。在本发明的该具体方法中，融合AGT的目标蛋白包含转录因子的DNA结合域或转录因子的活化域。物质的推定蛋白靶点或蛋白库与转录因子的DNA结合域或活化域连接，其连接方式可形成有功能的转录因子，并且本发明AGT酶底物的L标记为可能与目标物质相互作用的候选化合物或候选化合物库。作为底物一部分的候选化合物或候选化合物库然后被转移到AGT融合蛋白上。转移后，包含靶物质的ATG融合蛋白被候选化合物标记。与AGT融合蛋白连接的候选化合物和与DNA结合域或活化域融合的靶蛋白质的相互作用导致有功能转录因子的形成。活化的转录因子可驱动报道基因的表达，如果该方法在细胞外进行，若该报道基因的表达可给予细胞选择优势，则可检测到该报道基因的表达。在具体实施例中，该方法可能涉及一个或多个其它步骤，例如检测、分离、鉴定或定性候选化合物或靶物质。
在一个具体实例中，标记L为与未鉴定蛋白Y结合的药物或生物活性小分子。期望可表达未鉴定靶蛋白Y的生物cDNA文库与转录因子的活化域融合，并且AGT与转录因子的DNA结合域融合；或者，期望可表达未鉴定靶蛋白Y的生物cDNA文库与转录因子的DNA结合域融合，并且AGT与转录因子的活化域融合。只有在该分子与存在于cDNA文库中的靶蛋白Y结合并且分别融合到活化域或结合域上时，加入本发明包含该标记L的AGT底物导致有功能转录因子的形成和基因表达。如果基因表达与选择优势相连，则可鉴定出携带相应质粒的宿主，该质粒具有编码该药物或生物活性分子靶蛋白Y的基因。
在另一个具体实例中，标记L为化学分子库。该库期望包含在体内条件下与已知药物靶蛋白Y结合的未鉴定化合物。靶蛋白Y与转录因子的活化域融合，并且AGT与转录因子的DNA结合域融合；或者，靶蛋白Y与转录因子的DNA结合域融合，并且AGT与转录因子的活化域融合。加入携带化合物库的底物，导致库中的化合物与AGT共价连接，该AGT分别与转录因子的DNA结合域或转录因子的活化域融合。只有在化学库中的化合物通过AGT-底物键与转录因子中的DNA结合域或活化域连接，并分别与融合了转录因子活化域或DNA结合域的靶蛋白Y结合时，连接在AGT融合蛋白上的库化合物(表示标记)与靶蛋白Y的相互作用才会导致有功能转录因子的形成和基因表达。如果基因表达与选择优势相连，则可确认导致宿主生长的库分子。
当L为将R4和R1连接形成环状底物的键时，优选化合物为环状底物，其中连接R4和R1的键为连接连接体R4和氨基R6的键(如式2中的定义)。在这种优选环状底物中，R2优选为寡核苷酸，即结合到单链寡聚脱氧核糖核苷酸中的β-D-2′-脱氧核糖基，该寡核苷酸如上面的详述长2-99个核苷酸。该寡核苷酸可进一步被化学修饰，如此其可被检测并因此具有标记的功能。取代基的化学修饰与上述对L标记的修饰本质上是相同的。
当L为其它R3-CH2-X-R1-R2基团时，底物为二聚化合物，在与包含AGT的融合蛋白反应时导致融合蛋白的二聚。
实施例实施例1谷胱甘肽S-转移酶(C)hAGT融合蛋白hAGT克隆到表达载体pGEX2T(Pharmacia)的BamHl和EcoRl位点之间。蛋白质表达在大肠杆菌菌株JM83中进行。对数生长的培养物用1mM的IPTG诱导，表达在24℃下进行3.5小时。收集细胞，重悬于加入了1mM PMSF和2μg/mL抑酶肽的PBS，用溶菌酶和超声波破碎。为了除去DNA，MgCl2调整为1mM，加入DNA酶至浓度为0.01mg/mL。混合物在冰上放置30分钟，然后在40,000×g下离心分离细胞碎片。提取物上样到平衡后的谷胱甘肽琼脂糖，然后用一倍床体积的pH8.5的Tris·HCl和20倍床体积的PBS洗涤。然后GST-hAGT融合蛋白用50mM Tris·HCl(pH7.9)中的10mM还原谷胱甘肽洗脱。纯化后的蛋白用pH7.2的50mMHEPES、1mM DTT和30％丙三醇透析，然后-80℃贮存。纯化的GST-hAGT在体外与O6-苯甲基鸟嘌呤(Sigma)或O6-4-溴代噻吩甲基鸟嘌呤孵育。在90μl的总反应体积中，0.4μM的GST-hAGT与2μM溶于pH7.2的50mMHEPES的底物和1mM DTT在室温下孵育。
在某些时间点上，一等份试样用8.5pmol O6-苯甲基鸟嘌呤寡核苷酸猝灭，该核苷酸通过O6位与生物素基团连接(R.Damoiseaux等，Chem Biochem 4285，2001)，反应持续10分钟，然后与SDS-Laemmli缓冲液混合，用于蛋白质印迹分析(中性链亲合素-过氧化物酶偶联物(PIERCE)，复活试剂+(NEN))。相应条带的亮度用Kodak Image Station440测量。
实施例2乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶Ura3(C)hAGT融合蛋白使用基于酵母穿梭载体pRS314的质粒(Sikorski和Hieter，Genetics 12219-27，1999)。在pRS314的BamHl和EcoRl限制性酶切位点中插入铜诱导的启动子(CU-启动子)。在Bgl II和Kpn I位点之间插入Ura3基因(带有N端HA标记)，并在EcoR1和BgIII位点之间插入hAGT，形成hAGT-Ura3融合蛋白。
用0.1mM CuSO4诱导5mL OD600值0.3的培养物，孵育3小时，监测hAGT-Ura3融合蛋白的表达水平。离心3mL培养液收集细胞，重悬于50μL 2×Laemmli缓冲液，用3个冰冻-解冻循环破碎。样品上样于SDS-PAGE，然后进行蛋白质印迹(小鼠HA.11抗体(BABCO)；过氧物化酶偶联的抗小鼠抗体A4416(Sigma)；复活试剂+(NEN))。
通过在含CuSO4且无尿嘧啶的平板上生长转化体，测定Ura3的活力。通过ELISA法测定hAGT-Ura3融合蛋白的活力向50mL CM培养基中加入0.1mM CuSO4和100μM O6-苯甲基鸟嘌呤，与5mL静置生长过夜的培养物孵育。蛋白表达进行约5小时，直到OD600达到1.0。收集的细胞重悬于酵母分解缓冲液(pH7.5的50mM HEPES；150mM NaCl；5mM EDTA；1％TX100；1mM DTT；1mM PMSF；2μg/mL抑酶肽)，用3个冰冻-解冻循环破碎。300μL所得提取物与5pmol在O6位连接生物素基团的O6-苯甲基鸟嘌呤-寡核苷酸孵育(R.Damoiseaux等，ChemBiochem 4285，2001)，然后包被到已经封闭的StreptaWell平板(Boehringer Mannheim)上，持续1小时。然后用标准方法进行ELISA(用HA.11和A4416抗体检测；用过氧化物酶底物ABTS显色(100mM柠檬酸钠中，1.0mg/mL ABTS和0.01％H2O2)；在405nm处读数)。
实施例3泛素(N)Ura3(C)hAGT融合蛋白为产生带有N端精氨酸的hAGT，用PCR构建线状泛素-hAGT融合蛋白，其中在构建物的两侧为EcoR1和BgIII限制性酶切位点。将构建物插入实施例2所述构建物hAGT-Ura3的EcoR1和BgIII位点之间，形成泛素-hAGT-Ura3融合蛋白。
泛素-hAGT-Ura3融合蛋白的表达水平和所获融合蛋白的活力用实施例2中所述用于hAGT-Ura3的方法监测。
实施例4Tup1(N)W160hAGT融合蛋白Tup1涉及转录的葡萄糖抑制(F.E.Williams和R.Trumbly，MolCell Biol 106500-11，1990)。该核定位蛋白通过连接体DHGSG与W160hAGT的N端融合，该连接体含有克隆位点NcoI并连接Tup1的最后一个氨基酸天冬氨酸和hAGT的第一个氨基酸甲硫氨酸。为了抗体检测，表位HA直接与hAGT的C端融合，然后是终止子。克隆的引物为ak121(N，Tup1)5′-GCATGAATTCATGACTGCCAGCGTTTCG-3′(SEQ ID No.1)、ak122(C，Tup1)5′-GGATCCCCATGGTCATTTGGCGCTATTTTTTTATAC-3′(SEQ IDNo.2)、ak125(N，hAGT)5′-CGTGACCATGGGAGTGGGATGGACAAGGATTGTGAAATG-3′(SEQ ID No.3)和ak132(C，HA)5′-GCATGGGTACCTTAAGCGTAATCTGGAACATCG-3′(SEQ ID No.4)。含表达载体p314AK1(其中Tup1-W160hAGT蛋白在pcup1启动子的控制下)的L40酵母细胞培养物生长到OD600为0.6。通过加入CuSO4至100μM浓度并孵育细胞培养物2.5小时，诱导Tup1-W160hAGT的表达。通过冰冻/解冻循环裂解酵母细胞后，用蛋白质印迹(1.抗HA抗体(Babco)，2.抗小鼠-过氧化物酶偶联物(Sigma))分析细胞提取物中表达的Tup1-W160hAGT融合蛋白的存在。当在体内用BGAF(通过对氨甲基与酰胺键相连而带有5(6)-羧基荧光素二乙酸酯(diacetate of5(6)-carboxy-fluorescein)残基的O6-(对氨甲基)苯甲基鸟嘌呤)标记核融合蛋白时，其活力可用荧光显微镜确证。
BGAF按照下述方法制备
在氩气环境中，6.0mg(0.022mmol)O6-(4-氨甲基-苯甲基)鸟嘌呤溶于2mL无水DMF中(40℃，超声30分钟)。冷却至室温后，加入4.6μL三乙胺(0.033mmol)和14.8mg(0.027mmol)的5(6)-羧基荧光素N-丁二酰亚胺酯(异构体的混合物)。室温下搅拌1小时后，除去溶剂，产物用快速柱色谱纯化，使用甲醇/二氯甲烷分步梯度(1∶20、1∶10、1∶5)。在该条件下分离BGAF和BGAF的水解衍生物(称BGFL)，并分别溶于400μL DMSO。通过荧光素的消光系数(pH7.4时ε492＝98.4×103M-1cm-1)，根据λ＝492nm处的吸光度测定BGFL的浓度。计算BGFL的浓度为4.4mM。产量1.11mg(0.0018mmol，8％)。Rf＝0.02(甲醇/二氯甲烷＝1/10)。MS(ESI)629.27(100[M+H]+)。C34H24N6O7M＝628.61g/mol。通过O6-(4-氨甲基-苯甲基)鸟嘌呤和荧光素的消光系数(ε280＝(7.1+53.3)mM-1cm-1＝60.4mM-1cm-1)，根据λ＝280nm处的吸光度测定BGAF的浓度。计算BGAF的浓度为0.8mM。产量0.23mg(0.3μmol，1.5％)。Rf＝0.38(甲醇/二氯甲烷＝1/10)。MS(ESI)713.35(100[M+H]+)。C38H28N6O9M＝712.68g/mol。
实施例5Tup1(N)增强型青色荧光蛋白ECFP(C)W160hAGT融合蛋白Tup1通过实施例4所述的连接体DHGSG融合到W160hAGT的N端。但是融合到hAGT C端的表位HA其后为荧光蛋白ECFP。克隆的引物为ak121(N，Tup1)(SEQ ID NO.1)、ak122(C，Tup1)(SEQ IDNo.2)、ak125(N，hAGT)(SEQ ID No.3)、ak126(ECFP，HA)5′-CTCGCCCTTGCTCACCATCCCGCTGCCGGACCCAGCGTAATCTGGAACATCG-3′(SEO ID No.5)、ak127(ECFP，HA)5′-CGATGTTCCAGATTACGCTGGGTCCGGCAGCGGGATGGTGAGCAAGGGCGAG-3′(SEQ ID No.6)和ak128(C，ECFP)5′-CTAGCTGGGTACCGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGA-3′(SEQID No.7)。
含表达载体p314AK1(其中Tup1-W160hAGT-ECFP蛋白在pcup1启动子的控制下)的L40酵母细胞培养物生长至OD600为0.6。通过向加入CuSO4至100μM浓度并孵育细胞培养物2.5小时，诱导Tup1-W160hAGT-ECFP的表达。通过冰冻/解冻循环裂解酵母细胞后，用蛋白质印迹(1.抗HA抗体(Babco)，2.抗小鼠-过氧化物酶偶联物(Sigma))分析细胞提取物中表达的Tup1-W160hAGT融合蛋白的存在。当在体内用BGAF标记核融合蛋白并且核与残留细胞分离时，其活力可用荧光显微镜确证。
实施例6LexA(C)hAGT融合蛋白LexA是用于酵母双杂合法的大肠杆菌转录调节子的DNA结合域。hAGT与其C端融合，位于酵母表达载体pHybLexZeo(Invitrogen)限制性酶切位点EcoRI和NotI之间。所用的引物为ak101(N，hAGT)5′-CGATACGAATTCATGGACAAGGATTGTGAAATGAAACGC-3′(SEQ ID No.8)和ak102(C，hAGT)5′-TTCATAGCGGCCGCGTCAGTTTCGGCCAGCAGGC-3′(SEQ IDNo.9)。
实施例7细胞色素C过氧化物酶CCP(C)hAGT融合蛋白在hAGT-Ura3构建物(实施例2)中，Ura3被带有D217P和D224Y突变的CCP(不含其线粒体靶向序列)置换(Iffland等，Biochem BiophysRes Commun 286126-132，2001)。为检测融合蛋白的CCP活力，用导致hAGT-CCP表达的载体转化酵母，将菌落转移到硝化纤维素上，并且(经过3个冰冻/解冻循环后)暴露于含0.02％H2O2和5或20mMABTS的50mM KH2PO4缓冲液中。这种菌落在几分钟内染上深绿色，而不表达蛋白的菌落仅微弱的染色。
实施例8增强型青色荧光蛋白ECFP(C)W160hAGT融合蛋白荧光蛋白ECFP融合到W160hAGT的C端，其后为终止密码子。用PCR进行的融合，使用的引物与融合蛋白Tup1-W160hAGT-ECFP(实施例5)所用的引物相同。W160hAGT-ECFP蛋白结合到哺乳动物表达载体pNuc(Clontech)的Nhe I和BamHI位点之间。
AGT缺陷CHO细胞用编码W160hAGT-ECFP的载体转染。瞬时表达24小时后，生长在0.18mm厚载玻片上的细胞被转移到灌流室中，与BGFL(5μM)孵育5分钟。细胞用PBS缓冲液洗涤三次，以除去过量的底物。对于荧光测定，使用Zeiss LSM510激光扫描共聚焦显微镜(Carl Zeiss AG)。用适当的滤镜检测荧光素或ECFP信号(在488nm激发)。调整扫描速率和激光密度，以避免荧光探针的光漂白和细胞的破坏或形态改变。
实施例9膜蛋白ER Sec62/DHFR(C)hAGT融合蛋白以酵母基因组DNA为模板，用分别与所需DNA片段5′和3′端互补的寡核苷酸引物进行PCR，得到编码Sec62p蛋白N端结构域中ORF(可读框)的片断、过氧化物酶体膜蛋白Pex10p和Pex15p的全长ORF和酵母酪蛋白激酶(YCK1)N端片断的ORF。所有5′-引物包含附加的BamHI位点，所有3′-引物包含附加的限制性酶切位点，使3′端可框内融合到pRS314载体上的CUP1-hAGT组件中，或使YCK1的DNA片断可融合到pRS304载体上。Sec62p蛋白N端结构域的ORF框内插入CUP1-hAGT组件和小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)编码序列之间，该DHFR还带有编码HA表位标记(Dha)的附加序列。以包含全长AGT的质粒DNA做为模板，用与hAGT的ORF5′和3′端互补的寡核苷酸引物进行PCR，获得CUP1-hAGT组件。3′引物包含附加的BamHI位点，5′-引物包含附加的EcoRI位点，使3′可融合到pRS314和pRS304载体的酵母CUP1启动子上。质粒CUP1-hAGT-SEC62-314、CUP1-hAGT-PEX10-314和CUP1-hAGT-PEX15-314转化到酵母细胞中。通过在缺乏色氨酸的选择性培养基上生长，控制质粒的存在。为获得hAGT-YCK1融合基因的全序列，用Sal1剪切CUP1-hAGT-YCK1-304，使剪切质粒转化到酵母细胞中后可与染色体YCK1同源重组。可用合适的寡核苷酸作引物，通过诊断PCR确证成功的重组。
hAGT-Sec62-Dha融合蛋白的功能测定100mL表达hAGT-Sec62-Dha的酿酒酵母细胞30℃培养至OD600约为0.5，并在细胞提取前4小时加入100μM CuSO4。离心后，细胞在液氮中磨碎，蛋白用含有150mM NaCl、pH7.5的20mM HEPES、1mM EDTA和蛋白酶抑制剂的混和缓冲液(Boehringer Mannheim，Germany)提取。4℃下20,000rpm离心15分钟后，澄清提取物用10pmol含有底物BGBT的寡核苷酸在室温下处理20分钟。细胞提取物与15μL Dynabead孵育4小时，小珠用1mL提取缓冲液洗涤五次。洗涤后的小珠在30μLLaemmli缓冲液中煮沸，提取物进行SDS-PAGE。蛋白质印迹到硝化纤维素上后，通过与小鼠单克隆HA抗体和辣根过氧化物酶偶联的兔抗小鼠抗体连续孵育，检测纯化的hAGT-Sec62-Dha。
实施例105-烃色胺受体5-HT3(N)hAGT融合蛋白含5-羟色胺受体5-HT3(小鼠)的pEAK8-5HT3R质粒由H.Vogel(EPFL Lausanne，Switzerland)小组提供。W160hAGT结合到受体的第四个环(胞质)中，位于突变引入的限制性酶切位点SnaB I和Pac I之间。
用于扩增W160hAGT的引物为ak144(N，W160hAGT)5′-GCATGCTACGTAATGGACAAGGATTGTGAAATG-3′(SEQ IDNo.10)和ak145(C，W160hAGT)5′-GAGCACTTAATTAAGTTTCGGCCAGCAGGCGG-3′(SEQ IDNo.11)。用编码5-HT3-(W160hAGT)loop4-受体的质粒转染AGT缺陷CHO细胞。瞬时表达24小时后，生长在0.18mm厚载玻片上的细胞被转移到灌流室中，与BGFL(5μM)孵育5分钟。细胞用PBS缓冲液洗涤三次，以除去过量的底物。对于荧光测定，使用Zeiss LSM510激光扫描共聚焦显微镜(Carl Zeiss AG)。用适当的滤镜检测荧光素信号(在488nm激发)。调整扫描速率和激光密度，以避免荧光探针的光漂白和细胞的破坏或形态改变。
实施例11人雌激素受体hER(C)hAGT融合蛋白包含人雌激素受体的pC1-hER载体由H.Vogel小组(EPFL，Lausanne，Switzerland)提供。W160hAGT与受体C端融合，位于限制性酶切位点NheI和XhoI之间。扩增W160hAGT所需的引物为ak136(N，W160hAGT)5′-ATCGAGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGGACAAGGATTGTGAAATG-3′(SEQ ID No.12)和ak151(C，W160hAGT)5′-CGTAGCTCGAGAGTTTCGGCCAGCAGGC-3′(SEQ ID No.13)。
AGT缺陷CHO细胞用编码W160hAGT-hER的载体转染。瞬时表达24小时后，生长在0.18mm厚载玻片上的细胞被转移到灌流室中，与BGFL(5μM)孵育5分钟。细胞用PBS缓冲液洗涤三次，以除去过量的底物。对于荧光测定，使用Zeiss LSM510激光扫描共聚焦显微镜(Carl Zeiss AG)。用适当的滤镜检测荧光素信号(在488nm激发)。调整扫描速率和激光密度，以避免荧光探针的光漂白和细胞的破坏或形态改变。
位于核中的融合蛋白W160hAGT-hER的标记被确认。核与细胞的其它部分有明显的区别。
实施例12SV40大T抗原核定位序列NLS(C)hAGT和NLS/ECFP(C)hAGT猿猴病毒40大T抗原核定位序列的三个拷贝(NLS3)融合到荧光蛋白ECFP的C端，该ECFP与融合到W160hAGT C端的HA标记融合，得到W160hAGT-HA-ECFP-NLS3，或者NLS3直接融合到W160hAGT的C端形成W160hAGT-NLS3。PCR融合使用的引物与用于融合蛋白Tup1-W160hAGT-ECFP的相同(实施例5)。然后W160hAGT-HA-ECFP-NLS3或W160hAGT-NLS3分别结合到哺乳动物表达载体pNuc(Clontech)中，位于限制性酶切位点Nhe I和Bgl II之间。引物为ak136(N，W160hAGT)(SEQ ID No.12)、ak137(C，ECFP)5′-CATGCAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTC-3′(SEQ ID No.14)和ak107(C，W160hAGT)5′-CCAGGCAGATCTGTTTCGGCCAGCAGGCGGGG-3′(SEQ ID No.15)。AGT缺陷CHO细胞用编码W160hAGT-HA-ECFP-NLS3或W160hAGT-NLS3的pNuc载体转染。瞬时表达24小时后，生长在0.18mm厚载玻片上的细胞被转移到灌流室中，与BGFL(5μM)孵育5分钟。细胞用PBS缓冲液洗涤三次，以除去过量的底物。对于荧光测定，使用Zeiss LSM510激光扫描共聚焦显微镜(Carl Zeiss AG)。用适当的滤镜检测荧光素或ECFP信号(在488nm激发)。调整扫描速率和激光密度，以避免荧光探针的光漂白和细胞的破坏或形态改变。
序列表<110>洛桑生态综合技术联合公司(Ecole Polytechnique fédérale de Lausanne(EPFL))<120>用O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶标记蛋白<130>P303A<150>EP02405855.4<151>2002-10-03<160>15<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>1gcatgaattc atgactgcca gcgtttcg 28<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>2ggatccccat ggtcatttgg cgctattttt ttatac 36<210>3<211>39
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>3cgtgaccatg ggagtgggat ggacaaggat tgtgaaatg 39<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>4gcatgggtac cttaagcgta atctggaaca tcg 33<210>5<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>5ctcgcccttg ctcaccatcc cgctgccgga cccagcgtaa tctggaacat cg52<210>6<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物
<400>6cgatgttcca gattacgctg ggtccggcag cgggatggtg agcaagggcg ag 52<210>7<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>7ctagctgggt accgttactt gtacagctcg tccatga 37<210>8<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>8cgatacgaat tcatggacaa ggattgtgaa atgaaacgc 39<210>9<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>9ttcatagcgg ccgcgtcagt ttcggccagc aggc 34<210>10<211>33
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>10gcatgctacg taatggacaa ggattgtgaa atg 33<210>11<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>11gagcacttaa ttaagtttcg gccagcaggc gg 32<210>12<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>12atcgagctag cgctaccggt cgccaccatg gacaaggatt gtgaaatg 48<210>13<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物
<400>13cgtagctcga gagtttcggc cagcaggc28<210>14<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>14catgcagatc tgagtccgga cttgtacagc tc 32<210>15<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>15ccaggcagat ctgtttcggc cagcaggcgg gg 3权利要求
1.一种标记AGT融合蛋白，所述蛋白包含选自下述的目标蛋白酶、DNA结合蛋白、转录调控蛋白、膜蛋白、核受体蛋白、核定位信号蛋白、蛋白质辅因子、小单亚基GTP酶、ATP结合盒蛋白、细胞内结构蛋白、具有将蛋白靶向特定细胞区室的序列的蛋白、通常用作标记或亲合标记的蛋白、以及上述蛋白质的结构域或亚结构域，前提条件是所述目标蛋白不包括噬菌体λ主要头部蛋白D(gpD)以及蛋白MHHHHHHSSA、DHFR-HA、V5-NLS-B42、HA-Ura3、SSN6。
2.权利要求1的标记AGT融合蛋白，其中目标蛋白为膜蛋白。
3.权利要求1的标记AGT融合蛋白，其中目标蛋白为激酶。
4.权利要求1的标记AGT融合蛋白，其中目标蛋白为核受体蛋白。
5.权利要求1的标记AGT融合蛋白，其中目标蛋白为磷酸酶。
6.权利要求1的标记AGT融合蛋白，其中目标蛋白为蛋白酶。
7.权利要求1的标记AGT融合蛋白，所述蛋白组成为一个或多个融合到AGT N端、C端或N端和C端的目标蛋白和带标记的底物。
8.权利要求1的标记AGT融合蛋白，其中AGT为人AGT置换、缺失或插入一个或多个氨基酸的突变体。
9.权利要求8的标记AGT融合蛋白，其中AGT为Asn157被甘氨酸置换且Ser159被谷氨酸置换的突变体和Gly160被丙氨酸或色氨酸置换的突变体。
10.权利要求8的标记AGT融合蛋白，其中AGT为Asn157被丝氨酸置换、Ser159被组氨酸置换且Gly160被天冬酰胺置换的突变体。
11.权利要求1的标记AGT融合蛋白，其中标记为光谱探针；放射性标记分子；特异性与配偶体结合、为结合配偶对一部分的分子；可与其它生物分子相互作用的分子；可与其它生物分子相互作用的分子库；可与其它分子交联的分子；暴露于H2O2和抗坏血酸时会产生羟基的分子；在光辐射下可产生反应性基团的分子；共价连接到固相支持物上的分子；可与其互补链进行碱基配对的核酸或其衍生物；具有膜插入性质的脂类或其它疏水分子；具有所需酶、化学或物理性质的生物分子；或拥有上述属性任何组合的分子。
12.权利要求11的标记AGT融合蛋白，其中标记为荧光团、发色团、磁性探针或是对比剂。
13.权利要求12的标记AGT融合蛋白，其中标记为荧光团。
14.权利要求11的标记AGT融合蛋白，其中标记为特异性与配偶体结合、为结合配偶对一部分的分子。
15.权利要求11的标记AGT融合蛋白，其中标记为能够与其它分子交联的分子。
16.权利要求11的标记AGT融合蛋白，其中的标记为连接到固相支持物上的分子。
17.权利要求16的标记AGT融合蛋白，其中固相支持物为化学修饰的氧化物表面、玻璃表面、聚合物表面、功能化聚合物和贵金属表面。
18.权利要求17的标记AGT融合蛋白，其中固相支持物为小珠、微量滴定板或是传感元件的形式。
19.权利要求11的标记AGT融合蛋白，其中标记为可与其互补链进行碱基配对的核酸或其衍生物。
20.权利要求1的标记AGT融合蛋白，所述蛋白中包含多个标记。
21.一种AGT融合蛋白，所述蛋白包含选自下述的目标蛋白酶、DNA结合蛋白、转录调控蛋白、膜蛋白、核受体蛋白、核定位信号蛋白、蛋白质辅因子、小单亚基GTP酶、ATP结合盒蛋白、细胞内结构蛋白、具有将蛋白靶向特定细胞区室的序列的蛋白、通常用作标记或亲合标记的蛋白、以及上述蛋白质的结构域或亚结构域，前提条件是所述目标蛋白不包括噬菌体λ主要头部蛋白D(gpD)以及蛋白MHHHHHHSSA、DHFR-HA、V5-NLS-B42、HA-Ura3、SSN6。
22.权利要求21的AGT融合蛋白，其中目标蛋白为膜蛋白。
23.权利要求21的AGT融合蛋白，其中目标蛋白为激酶。
24.权利要求21的AGT融合蛋白，其中目标蛋白为核受体蛋白。
25.权利要求21的AGT融合蛋白，其中目标蛋白为磷酸酶。
26.权利要求21的AGT融合蛋白，其中目标蛋白为蛋白酶。
27.权利要求21的AGT融合蛋白，所述蛋白组成为一个或多个融合到AGT的N端、C端或N端和C端的目标蛋白，以及带有标记的底物。
28.权利要求21的AGT融合蛋白，其中AGT为人AGT置换、缺失或插入一个或多个氨基酸的突变体。
29.权利要求28的AGT融合蛋白，其中AGT为Asn157被甘氨酸置换且Ser159被谷氨酸置换的突变体和Gly160被丙氨酸或色氨酸置换的突变体。
30.权利要求28的AGT融合蛋白，其中AGT为Asn157被丝氨酸置换、Ser159被组氨酸置换且Gly160被天冬酰胺置换的突变体。
31.一种人AGT的突变体，其中Asn157被甘氨酸置换且Ser159被谷氨酸置换，或其中Gly160被丙氨酸或色氨酸置换，或其中Asn157被丝氨酸置换、Ser159被组氨酸置换且Gly160被天冬酰胺置换。
32.一种检测和处理目标蛋白的方法，所述方法特征为结合到AGT融合蛋白中的目标蛋白与带有标记的适当AGT底物接触，在设计为识别或处理标记的系统中利用标记检测并任选进一步处理AGT融合蛋白。
33.权利要求32的方法，所述方法还包括从目标蛋白和AGT形成AGT融合蛋白的步骤。
34.权利要求32的方法，其中目标蛋白选自酶、DNA结合蛋白、转录调控蛋白、膜蛋白、核受体蛋白、核定位信号蛋白、蛋白质辅因子、小单亚基GTP酶、ATP结合盒蛋白、细胞内结构蛋白、具有将蛋白靶向特定细胞区室的序列的蛋白、通常用作标记或亲合标记的蛋白、以及上述蛋白质的结构域或亚结构域，前提条件是所述目标蛋白不包括噬菌体λ主要头部蛋白D(gpD)以及蛋白MHHHHHHSSA、DHFR-HA、V5-NLS-B42、HA-Ura3、SSN6。
35.权利要求34的方法，其中目标蛋白为膜蛋白。
36.权利要求34的方法，其中目标蛋白为激酶。
37.权利要求34的方法，其中目标蛋白为核受体蛋白。
38.权利要求34的方法，其中目标蛋白为磷酸酶。
39.权利要求34的方法，其中目标蛋白为蛋白酶。
40.权利要求32的方法，其中AGT融合蛋白组成为一个或多个融合到AGT的N端、C端或N端和C端的目标蛋白。
41.权利要求32的方法，其中AGT融合蛋白中的AGT为人AGT或人AGT置换、缺失或插入一个或多个氨基酸的突变体。
全文摘要
本发明涉及将标记从合适的底物转移到O
文档编号C12N9/10GK1717496SQ200380104559
公开日2006年1月4日 申请日期2003年10月1日 优先权日2002年10月3日
发明者A·朱勒拉特, A·克普勒尔, K·约翰逊, T·格罗内迈尔, S·根德赖茨希, A·布雷希特 申请人:洛桑生态综合技术联合公司