糖链天冬酰胺衍生物、糖链天冬酰胺和糖链以及它们的制造方法

专利名称：糖链天冬酰胺衍生物、糖链天冬酰胺和糖链以及它们的制造方法
技术领域：
本发明涉及糖链天冬酰胺衍生物、糖链天冬酰胺和糖链以及它们的制造方法。
另外，本发明还涉及含有岩藻糖的糖链天冬酰胺衍生物及其制造方法。
背景技术：
近年来，作为继核酸(DNA)、蛋白质之后的第三个链状生命分子，糖链分子引人注目。人体是由约60兆个细胞构成的一大细胞社会，所有的细胞表面都被糖链分子覆盖。例如，ABO式血型就是由细胞表面糖链的不同决定的。
糖链具有参与细胞间识别和相互作用的功能，成为构成细胞社会的要素。细胞社会的紊乱与癌、慢性疾病、感染病、老化等有关。
例如，已知细胞如果癌化，就会引起糖链的结构变化。另外也知道霍乱弧菌或流感病毒等通过识别、结合某一特定糖链，侵入、感染细胞。
糖链功能的阐明，预期会带动依据新的原理的医药品和食品的开发等，对疾病的予防、治疗有贡献等广泛的应用。
糖链由于单糖的序列、结合样式以及部位、链长度以及分支样式、整体的高次结构等的多样性，所以与核酸或蛋白质的结构相比，是非常复杂的结构。因此，来自其结构的生物学信息与核酸和蛋白质相比，多种多样。现状是虽然人们认识到糖链研究的重要性，但由于其结构复杂和多样性，与核酸和蛋白质相比，研究进展缓慢。
象上述那样存在于细胞膜表面或血清等的很多蛋白质都结合着糖链。糖链与蛋白质共价结合的分子称为糖蛋白质，由于糖和蛋白质的结合样式不同，可以分为2类。一类是天冬酰胺(Asn)侧链的氨基与糖链结合的天冬酰胺结合型糖链(N-糖苷键型)。另一类是在丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)的羟基处结合了糖链的粘蛋白结合型糖链(O-糖苷键型)。所有的天冬酰胺结合型糖链带有由5个糖残基构成的基本骨架，由于结合的糖链的非还原末端的糖残基种类不同分为高甘露糖型、复合型、杂合型亚类。另外粘蛋白结合型糖链根据基本骨架(core)的不同又分为4类。
如上所述，虽然糖链是重要的化合物，但糖链的绝对量不足。作为获得糖链的手段，有只使糖链从存在于生物体内的糖蛋白质游离出来的方法。然而，要大量将糖链从糖蛋白质中切出是困难的，由于生物体内存在很多结构酷似的糖链，要只是大量获得单一的糖链是很难的。另外生物体内不存在的糖链要大量获得也是困难的。
本发明的课题在于提供在非还原末端至少含有1种以上唾液酸或唾液酸衍生物的新的糖链天冬酰胺衍生物及其制造方法。
另外，本发明的课题还在于提供在非还原末端至少含有1种以上唾液酸或唾液酸衍生物的新的糖链天冬酰胺及其制造方法。
另外，本发明的课题还在于提供在非还原末端至少含有1种以上唾液酸或唾液酸衍生物的新的糖链及其制造方法。
本发明的课题还在于提供在天冬酰胺的氨基氮被脂溶性保护基团保护的糖链天冬酰胺的非还原末端一侧的N-乙酰葡糖胺至少含有一个以上岩藻糖的新的糖链天冬酰胺衍生物及其制造方法。

发明内容
本发明涉及到以下发明。
1.一种式(1)所示的含有11～7糖的α2，3糖链天冬酰胺衍生物及其制造方法。
[式中、R1和R2是氢原子、式(2)～(5)表示的基团，可以相同，也可以不同。但是R1和R2中的一方必须是式(2)表示的基团。] R，R’，R”表示如下组合。
(a)R＝F、R’＝OH、R”＝OH(b)R＝OH、R’＝F、R”＝OH(c)R＝OH、R’＝OH、R”＝F(d)R＝OH、R’＝OH、R”＝OH
2.一种式(6)所示的含氟的含有11～7糖的α2，6糖链天冬酰胺衍生物及其制造方法。
[式中、RX和RY是氢原子、式(7)表示的基团、或式(3)～(5)表示的基团。但是RX和RY中有一方必须是式(7)表示的基团。] R，R’，R”表示如下组合。
(a)R＝F、R’＝OH、R”＝OH(b)R＝OH、R’＝F、R”＝OH(c)R＝OH、R’＝OH、R”＝F3.一种式(8)所示的含有11～7糖的α2，3糖链天冬酰胺及其制造方法。
[式中、R1和R2如上所述。]4.一种式(9)所示的含氟的含有11～7糖的α2，6糖链天冬酰胺及其制造方法。
[式中、RX和RY如上所述。]5.一种式(10)所示的含有11～7糖的α2，3糖链及其制造方法。
[式中、R1和R2如上所述。]6.一种式(11)所示的含氟的含有11～7糖的α2，6糖链及其制造方法。
[式中、RX和RY如上所述。]7.一种式(22)所示的含有11糖的(α2，3)(α2，6)糖链天冬酰胺衍生物。
[式中、R1是式(2)表示的基团，RY是下述式(7)表示的基团。] R，R’，R”表示如下组合。
(a)R＝F、R’＝OH、R”＝OH(b)R＝OH、R’＝F、R”＝OH(c)R＝OH、R’＝OH、R”＝F(d)R＝OH、R’＝OH、R”＝OH8.一种式(2 3)所示的含有11糖的(α2，3)(α2，6)糖链天冬酰胺衍生物。
[式中、R2是式(2)表示的基团，RX是下述式(7)表示的基团。]
R，R’，R”表示如下组合。
(a)R＝F、R’＝OH、R”＝OH(b)R＝OH、R’＝F、R”＝OH(c)R＝OH、R’＝OH、R”＝F(d)R＝OH、R’＝OH、R”＝OH本发明涉及在天冬酰胺的氨基氮被脂溶性保护基团保护的糖链天冬酰胺的非还原末端一侧的N-乙酰葡糖胺至少含有一个以上岩藻糖的新的糖链天冬酰胺衍生物及其制造方法。
本发明人在先前申请的专利2001-185685号(以下称为先前申请专利)中开发了与以往相比可以非常容易而且大量地获得各种分离的糖链天冬酰胺衍生物的糖链天冬酰胺衍生物、糖链天冬酰胺、糖链的制造方法，以及结合了任意缺失糖残基的糖链的新的糖链天冬酰胺衍生物、糖链天冬酰胺、糖链。
该先前申请的方法，包括例如(1)包括以下工序的来自糖链天冬酰胺的糖链天冬酰胺衍生物的制造方法(a)将脂溶性保护基导入到在含有1种或2种以上糖链天冬酰胺的混合物中所含有的该糖链天冬酰胺中，获得糖链天冬酰胺衍生物混合物的工序，以及(b)将该糖链天冬酰胺衍生物混合物或该糖链天冬酰胺衍生物混合物含有的糖链天冬酰胺衍生物水解后得到的混合物供给到色谱，对各糖链天冬酰胺衍生物进行分离的工序。
(2)上述(1)所述的糖链天冬酰胺衍生物的制造方法，其还包括(b’)用糖水解酶对工序(b)中分离的糖链天冬酰胺衍生物进行水解的工序。
(3)上述(1)或(2)所述的糖链天冬酰胺衍生物的制造方法，其中含有1种或2种以上糖链天冬酰胺的混合物是含有下述式(A)的化合物和/或在该化合物中缺失1个以上糖残基的化合物的混合物。
(4)上述(1)～(3)任一项所述的糖链天冬酰胺衍生物的制造方法，其中脂溶性保护基是芴甲氧羰(Fmoc)基。
(5)上述(1)～(3)任一项所述的糖链天冬酰胺衍生物的制造方法，其中工序(a)是向含有在非还原末端带有唾液酸残基的1种或2种以上糖链天冬酰胺的混合物中所含的该糖链天冬酰胺导入Fmoc基，并且向唾液酸残基导入苄基从而得到糖链天冬酰胺衍生物混合物的工序。
(6)包括以下工序的糖链天冬酰胺的制造方法(a)将脂溶性保护基导入到在含有1种或2种以上的糖链天冬酰胺的混合物所含的该糖链天冬酰胺中，获得糖链天冬酰胺衍生物混合物的工序，(b)将该糖链天冬酰胺衍生物混合物或该糖链天冬酰胺衍生物混合物含有的糖链天冬酰胺衍生物水解后得到的混合物供给到色谱，对各糖链天冬酰胺衍生物进行分离的工序，以及(c)除去工序(b)中分离的糖链天冬酰胺衍生物的保护基，得到糖链天冬酰胺的工序。
(7)上述(6)所述的糖链天冬酰胺的制造方法，其还包括(b’)用糖水解酶对在工序(b)中分离的糖链天冬酰胺衍生物进行水解的工序和/或(c’)用糖水解酶对在工序(c)中得到的糖链天冬酰胺进行水解的工序。
(8)上述(6)或(7)所述的糖链天冬酰胺的制造方法，其中含有1种或2种以上糖链天冬酰胺的混合物是含有下述式(A)的化合物和/或在该化合物中缺失1个以上糖残基的化合物的混合物。
(9)上述(6)～(8)任一项所述的糖链天冬酰胺的制造方法，其中脂溶性保护基是Fmoc基。
(10)上述(6)～(8)任一项所述的糖链天冬酰胺的制造方法，其中工序(a)是向含有在非还原末端带有唾液酸残基的1种或2种以上糖链天冬酰胺的混合物中所含该糖链天冬酰胺中导入Fmoc基，并且向唾液酸残基导入苄基从而得到糖链天冬酰胺衍生物混合物的工序。
有关这些糖链天冬酰胺衍生物以及糖链天冬酰胺的制造的详细描述由于在上述先前申请中已叙述，所以引用该申请。但是如果讲到若干先前申请的内容，先前申请的糖链天冬酰胺衍生物的制造方法其一大特征是例如向来自天然糖蛋白质的糖链天冬酰胺、优选是由天冬酰胺结合型糖链得到的糖链天冬酰胺的混合物中含有的该糖链天冬酰胺导入(结合)脂溶性保护基，得到糖链天冬酰胺衍生物的混合物，然后将该混合物分离为各糖链天冬酰胺衍生物。在本说明书中，所谓“糖链天冬酰胺”指的是结合了天冬酰胺状态的糖链。而所谓“天冬酰胺结合型糖链”指的是存在于还原末端的N-乙酰葡糖胺通过N-糖苷键与蛋白质多肽中天冬酰胺(Asn)的酸氨基连接的糖链组，以Man(β1-4)GlcNac(β1-4)GlcNac作为母核的糖链组。所谓“糖链天冬酰胺衍生物”指的是在天冬酰胺残基上结合了脂溶性保护基状态的糖链天冬酰胺。在化合物的结构式中，“AcHN”表示乙酰胺基。
如上所述，来自天然糖蛋白质的糖链是随机缺失了非还原末端的糖残基的糖链的混合物。本发明人意外地还发现通过向来自天然糖蛋白质的糖链、具体来说是糖链天冬酰胺混合物中含有的该糖链天冬酰胺导入脂溶性保护基，利用众所周知的色谱的方法，可以容易地将导入了该保护基的糖链天冬酰胺衍生物的混合物分离为各个糖链天冬酰胺衍生物。通过这样操作可以分别大量制备具有各种结构的糖链天冬酰胺衍生物。例如，以往分离困难的类似结构的糖链天冬酰胺衍生物之间的分离变为可能，可以容易而且大量地分别制备这些化合物。另外，以得到的糖链天冬酰胺衍生物作为起始原料，例如通过使糖水解酶依次作用，除去糖残基，也可以进一步合成各种各样的糖链天冬酰胺衍生物。
因此通过向糖链天冬酰胺导入脂溶性保护基使其成为衍生物，各个糖链天冬酰胺衍生物的分离成为可能，认为这是由于通过导入脂溶性保护基，糖链天冬酰胺衍生物整体的脂溶性提高，例如，与适合使用的反相系柱的相互作用显著提高，其结果可更敏锐地反映糖链结构的差别，能够分离各个糖链天冬酰胺衍生物的缘故。
另外按照先前申请，通过除去得到的糖链天冬酰胺衍生物的保护基，可以人工容易而且大量地获得各种糖链天冬酰胺。
然而，上述先前申请中得到的糖链天冬酰胺衍生物、糖链天冬酰胺以及糖链都是α2，6结合体。
此外，上述先前申请中得到的糖链天冬酰胺衍生物、糖链天冬酰胺以及糖链都是没有结合岩藻糖的糖链天冬酰胺衍生物。
而在本发明中，可以获得上述先前申请中没有报道的α 2，3结合体的糖链天冬酰胺衍生物、糖链天冬酰胺以及糖链、以及α2，6结合体相应物质，以及含有氟的均为新的糖链天冬酰胺衍生物、糖链天冬酰胺以及糖链。
另外，在本发明中可以得到上述先前申请中没有报道的岩藻糖结合体的糖链天冬酰胺衍生物。
以下就α2，3结合体和α2，6结合体的差异进行说明。
所谓α2，3结合体和α2，6结合体是表示唾液酸与半乳糖之间的结合形式。前者指的是唾液酸的2位碳与半乳糖的3位碳进行α结合，后者指的是唾液酸的2位碳与半乳糖的6位碳进行α结合。两者的区别是结合半乳糖的碳不同。
而这一差别，例如流感病毒识别末端带有唾液酸的糖链作为受体。而在人和鸟的流感病毒中，受体的特异性不同。前者特异地识别唾液酸与半乳糖α2，6结合的糖链，后者特异地识别唾液酸与半乳糖α2，3结合的糖链。已知唾液酸-半乳糖间的结合形式不同，以及唾液酸的差别在限制流感病毒的宿主域上起到很大的作用。
在本发明中涉及到上述先前申请中没有报道的新的糖链天冬酰胺衍生物、糖链天冬酰胺和糖链、以及它们的制造方法。
在本发明的方法中，首先，用唾液酸转移酶将作为起始化合物的用脂溶性保护基保护的糖链天冬酰胺(9糖-Asn-Fmoc)使唾液酸或唾液酸的衍生物转移，将得到的用脂溶性保护基保护的糖链天冬酰胺供给色谱进行分离，可以得到用脂溶性保护基保护的双唾液酸糖链天冬酰胺衍生物以及2种单唾液酸糖链天冬酰胺衍生物。
然后，得到的双唾液酸糖链天冬酰胺衍生物和2种单唾液酸糖链天冬酰胺衍生物通过进行糖水解，可以得到含有唾液酸或唾液酸衍生物的9～7糖链天冬酰胺衍生物。
另外，以上述得到的11～7糖链天冬酰胺衍生物或双唾液酸糖链天冬酰胺(α2，6-11糖-Asn-Fmoc)作为起始原料，然后通过对其进行糖水解可得到10～6糖链天冬酰胺衍生物，通过用糖转移酶向10～6糖链天冬酰胺衍生物转移岩藻糖，可以得到含有岩藻糖的13～7糖链天冬酰胺衍生物。
作为该保护基没有特别限定，例如可以使用Fmoc基、叔丁氧羰(Boc)基、苄基、烯丙基、烯丙氧羰基、乙酰基等碳酸酯系或酰胺系的保护基等。从将得到的糖链天冬酰胺衍生物直接用于所期望的糖肽的合成的观点出发，作为该保护基，优选Fmoc基或Boc基等，更优选Fmoc基。Fmoc基在唾液酸等比较酸性的条件下糖链中存在不稳定的糖时特别有效。另外保护基的导入可以根据众所周知的方法(例如参照Protecting groups in Organic Chemistry，John Wiley &Sons INC.，New York 1991，ISBN 0-471-62301-6)进行。
例如，使用Fmoc基时，向糖链天冬酰胺中加适量丙酮后，然后加9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺碳酸酯和碳酸氢钠进行溶解，通过于25℃下进行Fmoc基向天冬酰胺残基的结合反应，可以向该糖链天冬酰胺的天冬酰胺残基导入Fmoc基。
通过以上操作可以获得导入了脂溶性保护基的糖链天冬酰胺衍生物。
作为唾液酸，可以使用一般市售的唾液酸或化学合成的唾液酸。
作为唾液酸的衍生物，可以使用一般市售的唾液酸衍生物或化学合成的唾液酸衍生物。具体来说，可以列举与唾液酸的7位、8位或9位碳结合的羟基用氢原子或卤素原子取代后的化合物。作为卤素原子，可以列举氟、氯、溴等，优选氟。
作为唾液酸转移酶，可以使用通常市售的、来自天然的、通过基因重组生产的唾液酸转移酶，可以根据要转移的唾液酸或唾液酸衍生物的种类适当选择。具体来说，可以列举作为α2，3转移酶的来自RatRecombinant的酶、作为α2，6转移酶的来自Rat Liver的酶。另外通过使用唾液酸酶，进行pH调整等使平衡错开，也可以使唾液酸或唾液酸衍生物转移。
上述糖链天冬酰胺衍生物采用色谱的分离可以通过适当地单独或多个组合使用众所周知的色谱进行。
例如，将得到的糖链天冬酰胺衍生物混合物用凝胶过滤柱色谱纯化后，再用HPLC纯化。作为在HPLC中可以使用的柱子，反相系柱合适，可以利用例如ODS、Phenyl系、腈系、阴离子交换系柱，具体来说，可以利用例如Pharmacia公司生产的モノQ柱、ィャトロン公司生产的ィァトロビ-ズ柱等。分离条件等可以参照众所周知的条件进行适当调整。通过以上操作可以由糖链天冬酰胺衍生物混合物得到所期望的各个糖链天冬酰胺衍生物。
通过以上操作，例如当保护基为Fmoc基时，可以以单独或混合物形式获得式(12)、(13)、(17)、(18)、(22)、(23)的糖链天冬酰胺衍生物。
然后通过对上述分离得到的糖链天冬酰胺衍生物进行水解，可以有效地获得具有所期望的糖链结构的糖链天冬酰胺衍生物。例如在分离糖链天冬酰胺衍生物阶段，对混合物中含有的糖链天冬酰胺衍生物的种类进行限制，对糖链天冬酰胺衍生物进行粗略分离，然后进行水解，例如通过使用糖水解酶进行水解，可以有效地获得具有所期望的糖链结构的糖链天冬酰胺衍生物。水解可以如上述那样进行。特别是从更有效获得具有所期望的糖链结构的糖链天冬酰胺衍生物的观点出发，优选糖残基的切断方式使用明确的糖水解酶进行水解。
例如，半乳糖残基的去除可以通过将水解的化合物溶于缓冲液(例如磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、グッド缓冲液等)，根据众所周知的条件，使用半乳糖水解酶进行半乳糖残基的切断反应可以完成。而被水解的化合物无论是分别分离的化合物，还是混合物都可以。在该反应中使用的半乳糖水解酶优选利用市售的众所周知的外切型的酶。只要是具有同样活性，无论是新分离的酶，还是在基因工学上创造的酶都可以。然后与上述同样，将反应后得到的反应液(糖残基被切断的糖链天冬酰胺衍生物的混合物)供给色谱，可以获得各个糖链天冬酰胺衍生物。例如，分离优选使用HPLC(ODS柱、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝82∶18)进行。
N-乙酰葡糖胺残基的去除通过将水解的化合物溶于缓冲液(例如磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、グッド缓冲液等)，根据众所周知的条件，使用N-乙酰葡糖胺水解酶进行N-乙酰葡糖胺残基的切断反应可以完成。也可以使用N-乙酰氨基己糖酯酶水解酶。而被水解的化合物无论是分别分离的化合物，还是混合物都可以。在该反应中使用的各个酶优选利用市售的外切型的酶。只要是具有同样活性，无论是新分离的酶，还是在基因工学上创造的酶都可以。然后与上述同样，将反应后得到的反应液(糖残基被切断的糖链天冬酰胺衍生物的混合物)供给色谱，可以获得各个糖链天冬酰胺衍生物。例如，分离优选使用HPLC(ODS柱、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶甲醇＝65∶35或50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝82∶18)进行。
甘露糖残基的去除通过将水解的化合物溶于缓冲液(例如磷酸缓冲溶液、醋酸缓冲溶液、グッド缓冲溶液等)，根据众所周知的条件，使用甘露糖水解酶进行甘露糖残基的切断反应可以完成。而被水解的化合物无论是分别分离的化合物，还是混合物都可以。在该反应中使用的甘露糖水解酶优选利用市售的外切型的酶。只要是具有同样活性，无论是新分离的酶，还是在基因工学上创造的酶都可以。然后与上述同样，将反应后得到的反应液(糖残基被切断的糖链天冬酰胺衍生物的混合物)供给色谱，可以获得各个糖链天冬酰胺衍生物。例如，分离优选使用HPLC(ODS柱、洗脱溶剂可将10～200mM左右的醋酸铵等缓冲溶液与乙腈、或乙醇、或甲醇、或丁醇、或丙醇等具有脂溶性的水溶性有机溶剂适当混合后使用。这里作为洗脱溶剂，优选为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝82∶18)进行。
得到如上述那样操作得到的各个糖链天冬酰胺衍生物后，通过使岩藻糖转移，可以制造天冬酰胺的氨基氮被本发明的脂溶性保护基团保护的糖链天冬酰胺的非还原末端侧的N-乙酰葡糖胺至少含有一个以上岩藻糖的新的糖链天冬酰胺衍生物。
作为岩藻糖可以使用一般市售的岩藻糖或化学合成的岩藻糖。
作为岩藻糖转移酶可以使用一般市售的、来自天然的、或通过基因重组生产的岩藻糖转移酶，可以根据被转移的岩藻糖的种类适当选择。具体来说，可以列举作为使岩藻糖转移到糖链天冬酰胺的非还原末端侧的N-乙酰葡糖胺的酶的Fucosyltransferase V(Human、Recombinant、来自血浆、来自血清、来自乳汁、来自肝脏)等。另外，通过使用岩藻糖水解酶进行pH调整等，错开平衡也可以转移岩藻糖。
上述糖链天冬酰胺衍生物采用色谱的分离可以通过适当地单独或多个组合使用众所周知的色谱进行。
例如，将得到的糖链天冬酰胺衍生物混合物用凝胶过滤柱色谱纯化后，再用HPLC纯化。作为在HPLC中可以使用的柱子，优选反相系柱，可以利用例如ODS、Phenyl系、腈系、阴离子交换系柱，具体来说，可以利用例如Pharmacia公司生产的モノQ柱、ィャトロン公司生产的ィァトロビ-ズ柱等。分离条件等可以参照众所周知的条件进行适当调整。通过以上操作可以由糖链天冬酰胺衍生物混合物得到所期望的各个糖链天冬酰胺衍生物。
通过上述操作得到各个糖链天冬酰胺衍生物后，再通过使用各种糖水解酶等对该衍生物进行水解，除去糖链的非还原末端的糖残基，作为各个单一化合物可以得到例如糖链的末端的分支结构不均一的各种各样的糖链天冬酰胺衍生物。而使用各种糖水解酶，通过改变水解的顺序或其种类，可以制造更多种类的糖链天冬酰胺衍生物。
根据以往的方法，要获得分析级的具有极限的糖链结构的糖链天冬酰胺衍生物需要更庞大的时间和成本，但通过本发明则不需要特别的装置和试剂，只是使用惯用的凝胶过滤柱、HPLC柱，至少3种糖水解酶(例如，半乳糖水解酶、甘露糖水解酶、N-乙酰葡糖胺水解酶)等，用2周时间左右就可以制造1克左右具有所期望的糖链结构的糖链天冬酰胺衍生物。
通过以上操作，例如当保护基为Fmoc基时，可以以单独或混合物的形式获得式(14)～(16)、(19)～(21)的糖链天冬酰胺衍生物。
另外，本发明提供可以大量获得各种分离的糖链天冬酰胺的糖链天冬酰胺的制造方法。该方法在根据上述糖链天冬酰胺衍生物的制造方法制造糖链天冬酰胺衍生物的制造工序基础上，还包括从得到的糖链天冬酰胺衍生物除去保护基的工序。
由糖链天冬酰胺衍生物除去保护基可以根据众所周知的方法进行(例如，参照Protecting groups in Organic chemistry，John Wiley& Sons INC.，New York 1991，ISBN 0-471-62301-6)。例如，当保护基为Fmoc基时，在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，通过向糖链天冬酰胺衍生物中加入吗啉进行反应，可以除去Fmoc基。而Boc基可以通过使弱酸反应而除去。保护基除去后，根据需要可以适当利用众所周知的方法，例如使用凝胶过滤柱、离子交换柱等的各种色谱，或利用HPLC进行分离的方法进行纯化，可以得到糖链天冬酰胺。
通过以上操作，可以以单独或混合物形式获得例如式(8)、(9)的糖链天冬酰胺。
另外，本发明提供可以大量获得各种分离的糖链的糖链的制造方法。该方法在根据上述糖链天冬酰胺的制造方法制造糖链天冬酰胺的制造工序基础上，还包括从得到的糖链天冬酰胺除去天冬酰胺残基的工序。
从糖链天冬酰胺中除去天冬酰胺残基可以根据众所周知的方法进行。例如，使糖链天冬酰胺与无水肼反应后，通过乙酰化除去天冬酰胺残基可以获得糖链。另外，将糖链天冬酰胺于碱性水溶液中加热回流后，通过乙酰化除去天冬酰胺残基也可以获得糖链。除去天冬酰胺残基后，根据需要可以适当通过众所周知的方法，例如使用凝胶过滤柱、离子交换柱等的各种色谱，或利用HPLC的分离方法进行纯化。
通过以上操作，可以以单独或混合物形式获得例如式(10)、(11)的糖链。
因此，通过本发明可以低成本且有效地大量制造具有所期望的糖链结构的糖链天冬酰胺衍生物、糖链天冬酰胺以及糖链(以下有时将三者一并称为糖链类)。
这样的糖链类在医药品开发等领域非常有用。例如，作为医药品开发中的应用例子，可以列举例如癌的疫苗的合成。已知细胞一癌化，就会出现体内没有的糖链。此外还已知化学合成该糖链，作为疫苗给予个体，可以抑制癌的增殖。因此，如果通过本发明能够制造希望的糖链类，就可以进行对癌的治疗有效的疫苗的合成。另外，再通过将化学反应和利用糖转移酶的反应等组合使通过本发明得到的糖链类结合新的糖残基，也可以进行新的疫苗的合成。
具体实施例方式
以下举出参考例、实施例进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。
参考例1 α2，6-双唾液酸糖链天冬酰胺的合成将来自卵的粗纯化SGP(唾液酸糖肽)2.6g溶解于トリス-盐酸-氯化钙缓冲液(TRI ZMA BASE 0.05mol/l、氯化钙0.01mol/l、pH7.5)100mL中。然后加入叠氮化钠58mg(772μmol)和ァクチナ-ゼ-E(科研制药公司生产)526mg，于37℃下静置。65小时后，再加263mgァクチナ-ゼ-E，再于37℃下静置24小时。将该溶液冷冻干燥后，将残留物用凝胶过滤柱色谱(SephadexG-25、2.5φ×1m、展开溶解为水，流速1.0mL/min)纯化2次，获得1.3g(555μmol)α2，6-双唾液酸糖链天冬酰胺。
得到的双唾液酸糖链天冬酰胺的物理数据如下。
1H-NMR(D2O，30℃)δ5.13(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAcl-H-1)，4.95(s，1H，Man4-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61(d，1H，J＝7.6Hz，GlcNAc2-H-1)，4.60(d，2H，J＝7.6Hz，GlcNAc5，5-H-1)，4.44(d，2H，J＝8.0Hz，Ga16，6-H-1)，4.25(bd，1H，Man3-H-2)，4.20(bdd，1H，Man4-H-2)，4.12(bd，1H，Man4-H-2)，2.94(dd，1H，J＝4.5 H z，17.2Hz，Asn-βCH)，2.85(dd，1H，J＝7.0Hz，17.2Hz，Asn-βCH)，2.67，2.66(dd，2H，J＝4.6Hz，12.4Hz，NeuAc7，7-H-3eq)，2.07(s，3H，Ac)，2.06(s，6H，Ac×2)，2.02(s，6H，Ac×2)，2.01(s，3H，Ac)，1.71(dd，2H，J＝12.4Hz，12.4Hz，NeuAc7，7-H-3ax.) 参考例2 化合物1、2、3和4的合成将参考例1中得到的α2，6-双唾液酸糖链天冬酰胺(609mg，261μmol)溶解于20.7mL水中，再加入0.1当量盐酸13.8mL。将该溶液于70℃加热35分钟后，迅速进行冰冷，加饱和碳酸氢钠水溶液，调到pH7。对其进行冷冻干燥后，将残留物用凝胶过滤柱色谱(SephadexG-25、2.5φ×1m、展开溶解为水，流速1.0mL/min)进行纯化，获得α2，6-双唾液酸糖链天冬酰胺、2种α2，6-单唾液酸糖链天冬酰胺以及唾液酸缺失糖链天冬酰胺的混合物534mg。这4种成分都不分别进行分离，直接进行下面工序。
得到的糖链混合物的物理数据如下。
1H-NMR(D2O，30℃)5.13(s，Man4-H1)，5.12(s，Man4-H1)，5.01(d，GlcNAcl-H1)，4.94(s，Man4’-H1)，4.93(s，Man4’-H1)，4.82(s，Man3-H1)，4.60(d，GlcNAc2-H1)，4.58(d，GlcNAc5，5’-H1)，4.47(dd，Gal6，6’-H1)，4.44(d，Ga16，6’-H1)，4.24(d，Man3-H2)，4.19(d，Man4’-H 2)，4.11(d，Man4-H2)，2.97(bdd，AsN-βCH)，2.72(dd，NeuAc7-H3eq，NeuAc7-H3eq)，2.64(bdd，AsN-βCH)，2.15(s×5，-Ac)，1.79(dd，NeuAc7-H3ax，NeuAc7’-H3ax)将得到的糖链混合物429mg溶解于16.3mL丙酮和水11.2mL。然后加入9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺碳酸酯(155.7mg、461.7μmol)和碳酸氢钠(80.4mg、957μmol)，于室温下搅拌2小时。将该溶液通过蒸发器除去丙酮，剩下的溶液用凝胶过滤柱色谱(SephadexG-25、2.5φ×1m、洗脱溶剂为水，流速1.0mL/min)进行纯化，得到化合物1、化合物2和3、化合物4的混合物309mg。将该混合物通过HPLC(ODS柱、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶甲醇＝65∶35、2.0φ×25cm、流速3mL/min)纯化，在51分钟后洗脱下化合物1，在67分钟后洗脱下化合物2和3的混合物，93分钟后洗脱下化合物4。对各个级分分别进行冷冻干燥后，通过用凝胶过滤柱色谱(SephadexG-2 5、2.5φ×30cm、洗脱溶剂为水，流速1.0mL/min)进行脱盐，得到目的化合物2和3的混合物150mg。
得到的化合物1的物理数据如下。
1H-NMR(D2O，30℃)7.99(2H，d，Fmoc)，7.79(2H，d，Fmoc)，7.55(4H，m，Fmoc)，5.15(1H，s，Man 4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAcl-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man 3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5，5’-H1)，4.53(2H，d，Ga16，6’-H1)，4.34(1H，d，Man 3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，4.19(1H，d，Man4-H2)，3.03(1H，bdd，AsN-βCH)，3.00(1H，bdd，AsN-βCH)，2.76(2H，dd，NeuAc7，7’-H3eq)，2.15(18H，s×6，-Ac)，1.79(2H，dd，NeuAc7，7’-H3ax)；HRMS Calcdfor C103H154N8NaO66[M+Na+]2581.8838，found，2581.8821 上述糖链结构中的缩写符号表示如下NeuAc唾液酸 GalD-半乳糖 GlcNAcN-乙酰葡糖胺ManD-甘露糖Asn天冬酰胺。
得到的化合物2和3的混合物的物理数据如下。
1H-NMR(D2O，30℃)
7.99(d，Fmoc)，7.79(d，Fmoc)，7.55(m，Fmoc)，5.14(s，Man4-H1)，5.12(s，Man4-H)，5.00(d，GLcNAc1-H1)，4.94(s，Man4’-H1)，4.93(s，Man4’-H1)，4.82(s，Man3-H1)，4.60(d，GlcNAc2-H1)，4.58(d，G1cNAc5，5’-H1)，4.46(dd，GaK6，6’-H1)，4.44(d，Ga16，6’-H1)，4.24(d，Man3-H2)，4.19(d，Man4’-H2)，4.11(d，Man4-H2)，2.97(bdd，AsN-βCH)，2.72(dd，NeuAc7-H3eq，NeuAc7-H3eq)，2.64(bdd，AsN-βCH)，2.15(s×5，-Ac)，1.79(dd，NeuAc7-H3ax，NeuAc7’-H3ax)得到的化合物4的物理数据如下。
1H-NMR(D2O，30℃)7.99(2H，d，Fmoc)，7.79(2H，d，Fmoc)，7.55(4H，m，Fmoc)，5.12(1H，s，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.93(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5，5’-H1)，4.53(2H，d，Gal6，6’-H1)，4.34(1H，d，Man3-H2)，4.27(1H，d，Man4′-H2)，4.19(1H，d，Man4-H2)，3.03(1H，bdd，AsN-βCH)，3.00(1H，bdd，AsN-βCH)，2.15(12H，s×4，-Ac)；HRMS Calcd for C81H120N6NaO50[M+Na+]1999.6930，found，1999.6939
表2给出了上述化合物4的结构简化形式。
参考例3化合物2、3的合成和分离将参考例2得到的化合物2、3的混合物(5.0mg、2.2μmol)溶解于220μL的水中，加入100μL的22mM碳酸铯水溶液，调整到pH7.0。将该溶液冷冻干燥。向干燥后的固体物中加入430μL N，N-二甲基甲酰胺，再加入6.6μmol的苄基溴/N，N-二甲基甲酰胺溶液20μL。在氩气氛围下对该溶液进行搅拌。48小时后，通过TLC(洗脱溶剂使用1MNH4OAc∶异丙醇＝1∶2)确认原料消失后，加4.4mL二乙醚使化合物沉淀。对沉淀的糖链进行过滤，将剩下的糖链溶解并进行冷冻干燥。将冷冻干燥后的残留物通过分级HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝78∶22，流速4.0mL/min)进行纯化，结果在88分钟后洗脱下化合物3，在91分钟后洗脱下化合物2。分别收集，再通过ODS柱(コスモシ-ル75C18-OPN、15×100mm、最初使50mL水流过，然后使2 5％乙腈流过进行洗脱)脱盐，得到作为目的化合物2的苄基体1.6mg、化合物3的苄基体1.8mg。
使化合物2的苄基体(10糖、13.6mg、5.8mmol)在冰冷条件下溶解于NaOHaq.(pH＝12)1.4mL。一边通过HPLC监测反应，一边搅拌约8小时。在反应进行到终点时，用40mM HCl将反应液调到pH＝7.0。将中和后的溶液用膜滤器过滤后，浓缩，然后通过HPLC(YMC-PackODS-AM，SH-343-5AM，20×250mm、AN/25mM醋酸铵缓冲液＝20/80，7.0mL/min.，波长274nm)进行分级、纯化。分级的溶液浓缩后，再通过ODS柱(コスモシ-ル75C18-OPN、ナカラィテスク公司生产)进行脱盐处理，浓缩、冷冻干燥，得到目的化合物2(6.2mg，47.4％)。得到的化合物的物理数据如下。表1给出了化合物2的结构简化形式。
1H-NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)8.00(d，2H，J＝7.2，Fmoc)，7.79(d，2H，J＝7.2，F m o c)，7.5 9(d d，2 H，J＝7.2，Fmoc)，7.53(dd，2H，J＝7.2，Fmoc)，5.22(s，1H，Man4-H1)，5.09(d，1H，J＝9.8，GlcNAc2-H1)，5.01(s，1H，Man4’-H-1)，4.85(s，1H)，4.58-4.75(m，5H)，4.57(dd，2H，J＝8.0)，4.38-4.48(m，2 H)，4.33(s，1H)，4.28(bs，1H，Man4-H2)，4.19(bs，1H)，2.64-2.85(m，3H，Asn-βCHx2，NeuAc7-H3eq)，2.16，2.13，2.12(eachs，12H，Acx4)，1.98(s，3H，Ac)1.80(dd，1H，Ja＝12.0，Jb＝12.0，NeuAc7-H3ax).
使化合物3的苄基体(10糖、5.0mg、2.1mmol)在冰冷条件下溶解于NaOHaq.(pH＝12)2.0mL。一边通过HPLC监测反应，一边搅拌约5小时。在反应进行到终点时，用40mM HCl将反应液调到pH＝7.0。将中和后的溶液用膜滤器过滤后，浓缩，然后通过HPLC(YMC-PackODS-AM，SH-343-5AM，20×250mm、AN/25mM醋酸铵缓冲液＝20/80，7.0mL/min.，波长274nm)进行分级、纯化。分级的溶液浓缩后，再通过ODS柱(コスモシ-ル75C18-OPN、ナカラィテスク公司生产)进行脱盐处理，浓缩、冷冻干燥，得到目的化合物3(2.5mg，52.0％)。得到的化合物的物理数据如下。表1给出了化合物3的结构简化形式。1H-NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ8.01(d，2H，J＝7.6，Fmoc)，7.80(d，2H，J＝7.6，Fmoc)，7.59(dd，2H，J＝7.6，Fmoc)，7.52(dd，2H，J＝7.6，Fmoc)，5.21(s，1H，Man4-H1)，5.09(d，1H，J＝9.5，GlcNAc1-H1)，5.03(s，1H，Man4’-H-1)，4.58-4.71(m，5H)，4.54(t，2H，J＝7.5)，4.40-4.50(b，2H)，4.34(s，1H)，4.28(bs，1H，Man4-H2)，4.19(bs，1H)，2.70-2.85(m，2H，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.55-2.70(m，1H，Asn-βCH)，2.16，2.15，2.13，2.11(eachs，12H，Acx4)，1.98(s，3 H，Ac)1.80(dd，1H，Ja＝12.4，Jb＝12.4，NeuAc7-H3ax).
参考例4化合物5和6的合成使参考例2得到的化合物2和3的混合物(224mg、97μmol)和牛血清清蛋白24mg溶解于22mL的HEPES缓冲液(50mM，pH6.0)中，再加入来自Diplococcus pneumoniae的β-半乳糖苷酶(1.35U)。将该溶液于37℃下静置15小时后，进行冷冻干燥。将残留物通过HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝85∶15，流速3mL/min)纯化，在129分钟后洗脱下化合物5，在134分钟后洗脱下化合物6。分别收集，进行冷冻干燥。然后通过HPLC[ODS柱、2.0φ×25cm、洗脱溶剂最初15分钟为水，16分钟后至30分钟按照水∶乙腈(容量比)＝10∶0到85∶15，31分钟后至45分钟按照水∶乙腈＝85∶15到80∶20进行梯度洗脱，流速为3.0mL/min]，进行脱盐处理，得到目的化合物5为81mg，化合物6为75mg。
得到的化合物5的物理数据如下。
1H-NMR(D2O，30℃)7.99(2H，d，Fmoc)，7.79(2H，d，Fmoc)，7.55(4H，m，Fmoc)，5.15(1H，S，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5，5’-H1)，4.53(1H，d，Gal6’-H1)，4.34(1H，d，Man3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，4.19(1H，d，Man4-H2)，2.97(1H，bdd，AsN-βCH)，2.76(1H，dd，NeuAc7’-H3eq)，2.61(1H，bdd，AsN-βCH)，2.15(15H，s×5，-Ac)，1.79(1H，dd，NeuAc7’-H3ax)；HRMS Calcd forC86H127N7NaO53[M+Na+]2128.7356，found，2128.7363另外得到的化合物6的物理数据如下。
1H-NMR(D2O，30℃)7.99(2H，d，Fmoc)，7.79(2H，d，Fmoc)，7.55(4H，m，Fmoc)，5.15(1H，S，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5，5’-H1)，4.53(1H，d，Gal6-H1)，4.34(1H，d，Man 3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，4.19(1H，d，Man4-H2)，2.97(1H，bdd，AsN-βCH)，2.76(1H，dd，NeuAc7-H3eq)，2.60(1H，bdd，AsN-βCH)，2.15(15H，s×5，-Ac)，1.79(1H，dd，NeuAc7-H3ax)；HRMS Calcd forC86H125N7Na3O53[M+Na+]2172.6995，found，2172.7084参考例5 化合物7和8的合成将参考例4得到的化合物5和6的混合物(90mg、47.3μmol)不分别进行分离，直接与牛血清清蛋白8mg溶解于8.1mL的HEPES缓冲液(50mM，pH6.0)中，再加入2.88U来自牛肾脏的β-葡糖胺酶(シグマァルドリッチ公司生产，来自牛肾脏)。将该溶液于37℃下静置18小时后，进行冷冻干燥。将残留物通过HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶甲醇＝65∶35，流速为3mL/min)纯化，在117分钟后洗脱下化合物7，在127分钟后洗脱下化合物8。分别收集，进行冷冻干燥。继续使用HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脱溶剂最初15分钟为水，16分钟后至30分钟按照水∶乙腈＝10∶0到85∶15，31分钟后至45分钟按照水∶乙腈＝85∶15到80∶20进行梯度洗脱，流速为3mL/min]进行脱盐处理，得到40mg目的化合物7，37mg目的化合物8。
得到的化合物7的物理数据如下。
1H-NMR(D2O，30℃)8.01(2H，d，Fmoc)，7.80(2H，d，Fmoc)，7.56(4H，m，Fmoc)，5.22(1H，s，Man4-H1)，5.08(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.94(1H，s，Man4’-H1)，4.84(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(1H，d，GlcNAc5-H1)，4.55(1H，d，Gal6-H1)，4.33(1H，dd，Man3-H2)，4.20(1H，dd，Man4-H2)，4.15(1H，dd，Man4’-H2)，2.97(1H，bdd，AsN-βCH)，2.76(2H，dd，NeuAc7，7’-H3eq)，2.62(1H，bdd，AsN-βCH)，2.15(12H，s×4，-Ac)，1.79(2H，dd，NeuAc7，7’-H3ax)；HRMS Calcd for C78H114N6NaO48[M+Na+]1925.6562，found，1925.6539得到的化合物8的物理数据如下。
1H-NMR(D2O，30℃)7.99(2H，d，Fmoc)，7.79(2H，d，Fmoc)，7.55(4H，m，Fmoc)，5.15(1H，S，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man 4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5，5’-H1)，4.53(2H，d，Gal6，6’-H1)，4.34(1H，d，Man3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，2.97(1H，bdd，AsN-βCH2)，2.76(1H，dd，NeuAc7’-H3eq)，2.61(1H，bdd，AsN-βCH2)，2.15(12 H，s×4，-Ac)，1.79(1H，dd，NeuAc7’-H3ax)；HRMS Calcd for C78H114N6NaO48[M+Na+]1925.6562，found，1925.6533参考例6 化合物9的合成将参考例5得到的化合物7(30mg、473μmol)和牛血清清蛋白3mg溶解于6mL的HEPES缓冲液(50mM，pH6.0)中，再加入10U的来自Jack Beans的α-甘露糖苷酶。将该溶液于37℃下静置21小时后，进行冷冻干燥，接着用HPLC(oDS柱、2.0φ×25cm、洗脱溶剂最初15分钟为水，16分钟后至30分钟按照水∶乙腈＝10∶0到85∶15，31分钟后至45分钟按照水∶乙腈＝85∶15到80∶20进行梯度洗脱，流速为3mL/min)进行纯化，得到20mg的目的化合物9。
得到的化合物9的物理数据如下。
1H-NMR(D2O，30℃)8.01(2H，d，Fmoc)，7.80(2H，d，Fmoc)，7.56(4H，m，Fmoc)，5.00(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.84(1H，s，Man3-H1)，4.67(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.56(1H，d，GlcNAc5-H1)，4.44(1H，d，Gal6-H1)，4.11(1H，dd，Man4’-H2)，4.07(1H，dd，Man 3-H2)，2.97(1H，bdd，AsN-βCH)，2.76(1H，dd，NeuAc7’-H3eq)，2.62(1H，bdd，AsN-βCH)，2.15(12H，s×4，-Ac)，1.79(2H，dd，NeuAc 7’-H3ax)；HRMS Calcd forC72H104N6NaO43[M+Na+]1763.6034，found，1763.6074参考例7 化合物10的合成将参考例5得到的化合物8(40mg、630μmol)和牛血清清蛋白5g溶解于7.8mL的HEPES缓冲液(50mM，pH6.0)中，再加入38U的来自Jack Beans的α-甘露糖苷酶。将该溶液于37℃下静置63小时后，进行冷冻干燥，接着用HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脱溶剂最初15分钟为水，16分钟后至30分钟按照水∶乙腈＝10∶0到85∶15，31分钟至45分钟为85∶15到80∶20，进行梯度洗脱，流速为3mL/min)进行纯化，得到30mg的目的化合物10。
得到的化合物10的物理数据如下。
1H-NMR(D2O，30℃)1H-NMR(30℃)δ7.91(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.51(dd，2H，J＝7.2Hz，Fmoc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.12(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAcl-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.58(d，1H，J＝8.0Hz，GlcNAc2-H-1)，4.55(d，1H，J＝8.4Hz，GlcNAc5’-H-1)，4.47(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6’-H-1)，4.34(t，1H，Fmoc)，4.24(bd，1H，J＝1.9Hz，Man3-H-2)，4.18(bdd，1H，J＝1.4Hz，3.3Hz，Man4-H-2)，4.11(bdd，1H，J＝1.4Hz，3.5Hz，Man4’-H-2)，2.72(bdd，1H，J＝3.0Hz，15.7Hz，AsN-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝8.7Hz，15.7Hz，AsN-βCH)，2.06，2.05，2.04，参考例8 化合物11的合成将化合物5(28mg、21.3μmol)和牛血清清蛋白1.0mg溶解于HEPES缓冲液(50mM，pH5.0，454μL)中，再加入神经氨酸苷酶(SigmaAldrich公司生产，来自Viblio Cholerae，198mU)。将该溶液于37℃下静置20小时后，通过HPLC分析确认反应结束。将反应液通过HPLC(YMCPacked Column D-ODS-5S-5120AODS No.2020178、20×250mm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速4.0mL/min)进行纯化。再通过ODS柱(コスモシ-ル75C18-OPN、15×100mm、最初使50mL水流过，然后使25％乙腈流过进行洗脱)脱盐，得到目的化合物11(17mg、收率70％)。得到的化合物11的物理数据如下。
化合物11结构的简化形式如表2所示。
1H-NMR(30℃)δ7.91(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.12(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAcl-H-1)，4.92(s，1H，Man 4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.58(d，1H，J＝8.0Hz，GlcNAc2-H-1)，4.55(d，1H，J＝8.4Hz，GlcNAc5’-H-1)，4.47(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6’-H-1)，4.34(t，1H，Fmoc)，4.24(bd，1H，J＝1.9Hz，Man3-H-2)，4.18(bdd，1H，J＝1.4Hz，3.3Hz，Man4-H-2)，4.11(bdd，1H，J＝1.4Hz，3.5Hz，Man4’-H-2)，2.72(bdd，1H，J＝3.0Hz，15.7Hz，AsN-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝8.7Hz，15.7Hz，AsN-βCH)，2.06，2.05，2.04，1.89(eachs，each3H，Ac)；HRMS Calcd for C75H110N6NaO45[M+Na+]1837.6402，found1837.6471参考例9 化合物12的合成将化合物6(20mg、9.4μmol)和牛血清清蛋白1.6mg溶解于HEPES缓冲液(50mM，pH5.0，323μL)中，再加入神经氨酸苷酶(SigmaAldrich公司生产，来自Viblio Cholerae，141mU)。将该溶液于37℃下静置18小时后，通过HPLC分析确认反应结束。然后通过HPLC(YMC PackedColumn D-ODS-5 S-5120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速4mL/min)进行纯化。再通过ODS柱(コスモシ-ル75C18-OPN、15×100mm、最初使50mL水流过，然后使25％乙腈流过进行洗脱)脱盐，得到目的化合物12(13mg、收率76％)。得到的化合物的结构由1H-NMR与标准品-致进行确认。
化合物12结构的简化形式如表2所示。
参考例10 化合物13的合成将化合物7(45mg、24μmol)和牛血清清蛋白1.7mg溶解于HEPES缓冲液(50mM，pH5.0，820μL)中，再加入神经氨酸苷酶(SigmaAldrich公司生产，来自Viblio Cholerae，134mU)。将该溶液于37℃下静置14小时后，通过HPLC分析确认反应结束。接着将反应液通过HPLC(YMCPacked Column D-ODS-5 S-5120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速4mL/min)进行纯化。再通过ODS柱(コスモシ-ル75C18-OPN、15×100mm、最初使50mL水流过，然后使25％乙腈流过进行洗脱)脱盐，得到目的化合物13(28mg、收率74％)。得到的化合物的物理数据如下。
化合物13结构的简化形式如表2所示。
1H-NMR(30℃)δ7.92(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmo.c)，7.44(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.10(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.58(d，2H，GlcNAc2，5’-H-1)，4.47(d，1H，J＝8.0Hz，Gal6’-H-1)，4.35(t，1H，Fmoc)，4.24(bd，1H，J＝1.9Hz，Man3-H-2)，4.11(bs，1H，Man4’-H-2)，4.07(bs，1H，Man4-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，AsN-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝8.7Hz，15.5Hz，AsN-βCH)，2.06，2.04，1.89(eachs，each 3H，Ac)；HRMS Calcd forC67H97N5NaO40[M+Na+1634.5608，found，1634.5564参考例11化合物14的合成将化合物8(47mg、25μmol)和牛血清清蛋白1.9mg溶解于HEPES缓冲液(50mM，pH5.0，840μL)中，再加入神经氨酸苷酶(SigmaAldrich公司生产，来自Viblio Cholerae，369mU)。将该溶液于37℃下静置37小时后，通过HPLC分析确认反应结束。将该反应液冷冻干燥，然后通过HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODSNo.2020178、20×250mm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速4.0mL/min)进行纯化。再通过ODS柱(コスモシ-ル75C18-OPN、15×100mm、最初使50mL水流过，然后使25％乙腈流过进行洗脱)脱盐，得到目的化合物14(26mg、收率65％)。得到的化合物的物理数据如下。
化合物14结构的简化形式如表2所示。
1H-NMR(30℃)δ7.92(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.12(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.4Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.57(bd，2H，GlcNAc2，5’-H-1)，4.46(d，1H，J＝7.5kz，Gal6’-H-1)，4.34(t，3H，Fmoc)，4.24(bs，1H，Man4’-H-2)，4.19(bs，1H，Man4-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，AsN-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝9.2Hz，15.5Hz，AsN-βCH)，2.06，2.05，1.89(each s，each 3H，Ac)；HRMSCalcd for C67H97N5NaO40[M+Na+]1634.5608，found，1634.5644参考例12化合物15的合成将化合物9(32mg、18.4μmol)和牛血清清蛋白2.5mg溶解于HEPES缓冲液(50mM，pH5.0，713μL)中，再加入神经氨酸苷酶(Sigma Aldrich公司生产，来自Viblio Cholerae，134mU)。将该溶液于37℃下静置17小时后，通过HPLC分析确认反应结束。接着将反应液通过HPLC(YMCPacked Column D-ODS-5S-5120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速4mL/min)进行纯化。再通过ODS柱(コスモシ-ル75C18-OPN、15×100mm、最初使50mL水流过，然后使25％乙腈流过进行洗脱)脱盐，得到目的化合物15(13mg、收率52％)。得到的化合物的物理数据如下。
化合物15结构的简化形式如表2所示。
1H-NMR(30℃)δ7.92(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.44(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.00(d，1H，J＝9.9H z，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.75(s，1H，Man3-H-1)，4.58(d，2H，J＝7.5Hz，GlcNAc2，5’-H-1)，4.47(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6’-H-1)，4.34(t，1H，Fmoc)，4.10(bd，1H，Man3-H-2)，4.07(bs，1H，Man 4’-H-2)，2.72(bdd，1H，J＝15.5Hz，AsN-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝9.2Hz，15.5Hz，AsN-βCH)，2.07，2.05，1.89(eachs，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd forC61H88N5O35[M+H+]1450.5，found，1450.3参考例13化合物16的合成将化合物10(28mg、16μmol)和牛血清清蛋白1.7mg溶解于HEPES缓冲液(50mM，pH5.0，624μL)中，再加入神经氨酸苷酶(SigmaAldrich公司生产，来自Viblio Cholerae，117mU)。将该溶液于37℃下静置17小时后，通过HPLC分析确认反应结束。然后将反应液通过HPLC(YMCPacked Column D-ODS-5S-5120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速4mL/min)进行纯化。再通过ODS柱(コスモシ-ル75C18-OPN、15×100mm、最初使50mL水流过，然后使25％乙腈流过进行洗脱)脱盐，得到目的化合物16(14.6mg、收率68％)。得到的化合物的物理数据如下。
化合物16结构的简化形式如表2所示。
1H-NMR(30℃)δ7.92(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.50(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.12(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.77(s，1H，Man 3-H-1)，4.57(d，2H，J＝7.2Hz，GlcNAc2-H-1)，4.46(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6-H-1)，4.34(t，1H，Fmoc)，4.22(bd，1H，J＝2.7Hz，Man3-H-2)，4.19(b，1H，Man4-H-2)，2.72(bdd，1H，J＝15.5Hz，AsN-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝9.8Hz，15.5Hz，AsN-βCH)，2.05(s，6H，Ac×2)，1.89(s，3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C61H88N5O35[M+H+]1450.5，found，1450.3参考例14(5-乙酰胺-3，5，7-三脱氧-7-氟-D-甘油基-β-D-半乳糖基-2-九吡喃糖苷酸(7-氟唾液酸)5-acetamide-3，5，8-trideoxy-8-fluoro-D-glycero-β-D-galacto-2-nonulopyranosidonic acid 25的合成) (1)化合物17的合成将乙酸钠(5g，69mmol)溶解于乙酸酐(60mL)中，加热后一点一点地加入D-半乳糖(G)(10g，55mmol)。加热回流2小时后通过TLC(甲苯∶乙酸乙酯＝5∶1)确认反应结束。将反应溶液恢复到室温后，注入到冰水300cc中。过滤后收集沉淀物。将沉淀物溶解于乙醇(14mL)进行重结晶，得到9.0g化合物17(收率41％)。
(2)化合物18的合成将化合物17(4.3g，11mmol)溶于二氯甲烷(120mL)后，于氩气流下冷却至-20℃。然后，向反应溶液中加入四氯化锡(3.1g，12mmol)，搅拌20分钟后，加入苄醇(2.3g，22mmol)，将反应温度恢复到室温。用TLC(己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)确认反应结束后，将反应溶液注入到饱和碳酸氢钠水溶液中，用二氯甲烷进行萃取。二氯甲烷层经无水硫酸镁干燥后，进行过滤、减压浓缩。将残渣用干燥器干燥后，溶于蒸馏后的甲醇(80mL)中，加入甲醇钠(431mg，5.5mmol)，氩气流下进行搅拌。用TLC(乙酸乙酯∶甲醇∶水＝10∶5∶1)确认反应结束后，用阳离子交换树脂IR-120(+)进行中和，使反应结束。将树脂过滤除去后，对滤液进行减压浓缩。残渣经干燥器干燥后，溶于吡啶(44mL)，将反应溶液冷却到0℃。向反应溶液中加三甲基乙酰氯(4.6g，38.5mmol)后，恢复至室温，于氩气流下搅拌1小时。用TLC(己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)确认反应结束后，冷却到0℃后，加入甲醇使反应终止。将反应溶液直接进行减压浓缩后，将残渣溶于乙酸乙酯，用饱和食盐水溶液、水进行清洗，用无水硫酸镁使乙酸乙酯干燥。将硫酸镁过滤除去后，对滤液进行减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(洗脱溶剂己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)精制，得到化合物18(2.8g，收率58％)。
(3)化合物19的合成将化合物18(200mg，0.455mmol)溶于二氯甲烷(7.8mL)和吡啶(1.3mL)中，加入氯乙酸酐(155mg，0.91mmol)，于氩气流下、-15℃下边搅拌边反应15分钟。确认反应结束后，用甲醇(5mL)将氯乙酸酐骤冷，边用甲苯进行3次共沸，边进行减压浓缩。用乙酸乙酯对残渣进行萃取，用饱和食盐水进行清洗。用无水硫酸镁使有机层干燥，过滤后进行浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯∶己烷＝1∶4)精制，得到化合物19(收量172mg，收率73.5％)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ7.37-7.29(m，5H，Ph)，5.39(dd，1H，J1，2＝8.0Hz，J2，3＝10.4Hz，H-2)，4.89(dd，1H，J3，4＝3.4Hz，H-3)，4.89，4.62(2d，2H，J＝12.5Hz，OCH2Ph)，4.53(d，1H，H-1)，4.37(dd，1H，J6a，6b＝11.5Hz，J6a，5＝6.0Hz，H-6a)，4.32(dd，1H，J6b，5＝6.6Hz，H-6b)，4.00(m，1H，H-4)，3.92(s，2H，COCH2Cl)，3.75(dd，1H，H-5)，1.23，1.19〔2s，18H，COC(CH3)3〕13C-NMR(400MHz，CDCl3)δ178.33，177.57，165.92，(C＝O)，136.66，128.48，128.07，127.89(Ph)，99.16(C-1)，72.82(C-3)，72.35(C-5)，70.92(C-2)，70.49(OCH2Ph)，67.29(C-4)，62.30(C-6)，40.40(OCCH2Cl)，38.95，38.80〔COC(CH3)3〕，27.14，26.98〔COC(CH3)3〕1H-NMR、13C-NMR通过Bruker的AVANCE 400(表示为400MHz)进行测定。溶剂为重氯仿时，作为内部标准使用三甲基硅烷。使用其他的重溶剂时将溶剂峰作为基准。化学位移用δ(ppm)表示，结合常数用J(Hz)表示。硅胶柱色谱使用Merck Silicage160，70-230目或230-400目，球状硅胶使用关东化学公司生产的Silica Gel 60(Spherical)，作为反应检测用(以下TLC)使用E.Merk公司生产的DC-Platten kieselgel 60 F254(Artl，05715)。高效液相色谱(HPLC)柱使用ナカラィテスク公司生产的COSMOSIL 5C18-ARPaeked Column(φ4.6×150mm)，分光荧光光度计使用JASCO公司生产的FP-210 Spectrofluorometer。
(4)化合物20的合成将化合物19(300mg，0.583mmol)溶于二氯甲烷(5.8mL)中，于氩气流下、-15℃下，边搅拌边加入二乙基氨基磺胺三氟化物(diethylaminosulfatrifluoride)(DAST)。加入DAST 10分钟后，恢复到室温，反应1小时。用TLC确认原料消失，用甲醇(3mL)将DAST骤冷后，进行减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯∶己烷＝1∶6)纯化，得到化合物20(收量211mg、收率70％)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ7.37-7.27(m，5H，Ph)，5.31(ddd，1H，J3，F＝14.3Hz，J3，4＝9.69Hz，J2，3＝9.63Hz，H-3)，5.04(dd，1H，J1，2＝7.93Hz，H-2)，4.86(d，1H，J＝12.2Hz，OCH2Ph)，4.60(d，1H，H-1)，4.59(d，1H，OCH2Ph)，4.44(ddd，1H，J4，5＝9.04Hz，J4，F＝50.6Hz，H-4)，4.43(ddd，1H，J6a，6b＝12.1Hz，J6a，5＝2.41Hz，J6a，F＝2.23Hz，H-6a)，4.24(ddd，1H，J6b，5＝5.67Hz，J6b，F＝1.28Hz，H-6b)，3.93(s，2H，OCOCH2Cl)，3.75(m，1H，H-5)，1.25，1.18〔2s，18H，OCOC(CH3)3〕13C-NMR(400MHz，CDCl3)δ177.94，117.43，165.88(C＝O)，136.34，128.55，138.23，127.92(Ph)，98.68(C-1)，87.35(d，J4，F＝188.62Hz，C-4)，72.65(d，J2，F＝7.96Hz，C-2)，72.05(d，J3，F＝20.02Hz，C-3)，71.49(d，J5，F＝23.09Hz，C-5)，70.80(OCH2Ph)，62.12(C-6)，40.30(OCOCH2Cl)，38.87〔OCOC(CH3)3〕，27.17，26.92〔OCOC(CH3)3〕 (5)化合物21的合成将化合物20(625mg，1.21mmol)溶于甲醇(24.2mL)，于氩气流、-15℃下，边搅拌边加入甲醇钠(13.1mg，0.6mmol)。30分钟后，通过TLC确认原料消失后，用阳离子交换树脂IR-120(+)进行中和(pH6-7)，将树脂过滤后进行减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(乙酸乙酯∶己烷＝1∶4)进行纯化，得到化合物21(收量395mg，收率74％)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ7.38-7.29(m，5H，Ph)，5.18(ddd，1H，J3，F＝14.8Hz，J3，4＝9.51Hz，J2，3＝8.99Hz，H-3)，4.90(d，1H，J＝11.7，OCH2Ph)，4.63(d，1H，OCH2Ph)，4.47(ddd，1H，J5，6a＝2.43Hz，J6a，F＝2.2Hz，H-6a)，4.47(d，1H，J1，2＝7.7Hz，H-1)，4.38(ddd，1H，J4，5＝8.96Hz，J3，4＝9.67Hz，J4，F＝50.8Hz，H-4)，4.23(ddd，1H，J6a，6b＝12.0Hz，J6b，5＝6.05Hz，J6b，F＝1.26Hz，H-6b)，3.75(m，1H，H-5)，3.54(m，1H，J2，OH＝2.70Hz，H-2)，1.27，1.26〔2s，18H，OCOC(CH3)3〕13C-NMR(400MHz，CDCl3)δ178.17，177.94(C＝O)，136.54，128.54，128.17，128.12(Ph)，101.31(C-1)，87.45(d，J4，F＝187.39Hz，C-4)，74.17(d，J3，F＝18.88Hz，C-3)，72.45(d，J2，F＝7.56Hz，C-2)，71.45(d，J5，F＝23.26Hz，C-5)，71.09(OCH2Ph)，62.44(C-6)，38.90，38.85〔OCOC(CH3)3〕，27.14，26.99〔OCOC(CH3)3〕(6)化合物22的合成于0℃下向溶有吡啶(22.2μL，0.274mmol)的二氯甲烷(370μL)溶液中滴加三氟甲磺酸酐(46μL，0.274mmol)，15分钟后，于0℃滴加溶有化合物21的二氯甲烷(1mL)的溶液。用TLC确认原料消失，用二氯甲烷将反应混合物稀释。用饱和碳酸氢钠水、饱和食盐水、水清洗有机层，用无水硫酸镁进行干燥后进行浓缩。将残渣用真空泵进一步干燥后，溶于苯(1mL)，于氩气流下、在室温下加叠氮化钠(13mg，0.206mmol)、四氯化铵(57mg，0.206mmol)，于40℃下使其反应。2小时后用TLC确认原料消失后，进行减压浓缩。用乙酸乙酯对残渣进行萃取，用饱和食盐水、水清洗后，经无水硫酸镁干燥后，进行浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯∶己烷＝1∶4)纯化，获得化合物22(收量30.4mg，收率95％)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ7.39-7.32(m，5H，Ph)，4.99(ddd，1H，J3，F＝13.18Hz，J3，4＝9.27Hz，J2，3＝3.87Hz，H-3)，4.93(d，1H，J＝12.07Hz，OCH2Ph)，4.67(d，1H，J1，2＝1.18Hz，H-1)，4.63(d，1H，OCH2Ph)，4.51(ddd，1H，J6a，6b＝11.95Hz，J6a，5＝2.54Hz，J6a，F＝2.08Hz，H-6a)，4.23(ddd，1H，J6b，5＝6.14Hz，J6b，F＝1.14Hz，H-6b)，4.08(m，1H，H-2)，3.64(m，1H，H-5)，1.26〔2s，18H，OCOC(CH3)3〕13C-NMR(400MHz，CDCl3)δ178.01，177.68(C＝O)，136.06，128.63，128.31，128.14(Ph)，97.25(C-1)，85.51(d，J4，F＝183.97，C-4)，72.01(d，J5，F＝23.89，C-5)，71.73(d，J3，F＝18.98，C-3)70.57(OCH2Ph)，62.42(C-2，C-6)，39.08，38.90〔OCOC(CH3)3〕，27.18，26.95〔OCOC(CH3)3〕 (7)化合物23的合成将化合物22(180mg，0.387mmol)溶于甲醇(8mL)，加入甲醇钠(922mg，9.67mmol)并搅拌，于40℃下使其反应。4.5小时后用TLC确认集中在1点，用阳离子交换树脂IR-120(+)中和后，进行过滤、浓缩。残渣经硅胶柱色谱(乙酸乙酯∶己烷＝1∶1)纯化，得到化合物23(收量105.3mg，收率91.6％)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)，δ7.40-7.31(m，5H，Ph)，4.96(d，1H，J＝12.13Hz，OCH2Ph)，4.71(d，1H，J1，2＝1.33Hz，H-1)，4.69(d，1H，OCH2Ph)，4.49(ddd，1H，J4，F＝51.06Hz，J4，5＝9.19Hz，J3，4＝9.20Hz，H-4)，4.02(m，1H，H-2)，3.93(dddd，1H，J6a，6b＝12.19Hz，J6a，5＝2.31Hz，J6a，F＝2.32Hz，J6a，OH＝6.20Hz，H-6a)，3.89-3.77(m，2H，H-3，H-6b)，3.39(m，1H，H-5)，13C-NMR(400MHz，CDCl3)，δ136.39，128.62，128.24，127.83(Ph)，98.63(C-1)，88.19(d，J4，F＝178.91Hz，C-4)，73.95(d，J5，F＝25.48Hz，C-5)，71.18(OCH2Ph)，71.16(d，J3，F＝19.69Hz，C-3)，64.48(d，J2，F＝8.42Hz，C-2)，61.39(C-6)(8)化合物24的合成将化合物23(105mg，0.353mmol)溶于甲醇(7mL)，加入乙酸酐(333μL，3.53mol)后、于氩气流下，加入催化量的10％ Pd/C，进行氢置换后，于室温下进行搅拌。2小时后用TLC确认原料消失，活性炭过滤后进行浓缩。残渣经硅胶柱色谱(乙酸乙酯∶甲醇＝5∶1)纯化，得到化合物24(收量57mg，收率72％)。
1H-NMR(400MHz，D2O)，δ5.23(dd，1H，J1，2＝2.69Hz，J1，F＝1.44Hz，H-1-α)，4.65(ddd，1H，J4，F＝50.94Hz，J3，4＝9.06Hz，J4，5＝9.58Hz，H-4-α)，4.47(m，1H，H-2-α)，4.43(ddd，1H，J3，F＝14.28Hz，J2，3＝4.9Hz，H-3-α)，4.16(m，1H，H-5-α)，3.95(m，2H，H-6a-α，H-6b-α)，2.14(s，3H，NHCOCH3-α)13C-NMR(400MHz，D2O)，δ175.27(C＝O-α)，93.46(C-1-α)，88.30(d，J4，F＝177.00Hz，C-4-α)，69.91(d，J5，F＝24.41Hz，C-5-α)，67.60(d，J3，F＝18.74Hz，C-3-α)，60.36(C-6)，54.12(d，J2，F＝8.68Hz，C-2-α)，22.31(NHCOCH3-α) (9)化合物25的合成将化合物24(50mg，0.224mmol)、丙酮酸钠(123mg，1.12mmol)和牛血清清蛋白(5mg)溶于磷酸钠缓冲液(100mM，pH7.5，3.4mL)，然后加唾液酸醛缩酶(50U)，于室温下开始反应。24小时后使反应溶液冷冻干燥，溶于少量水中，加到阴离子交换树脂柱(AG1-X8，200-400目，甲酸盐形式)中。使水300mL流过后，用1M甲酸将目的物洗脱，进行减压浓缩，用凝胶过滤柱(Sephadex G-15，水)纯化，得到化合物25(收量40mg，收率58.9％)。
1H-NMR(400MHz，D2O)，δ4.61(dd，1H，J7，8＝8.97Hz，J7，F＝45.56Hz，H-7)，4.18(dd，1H，J5，6＝10.63Hz，J6，F＝29.86Hz，H-6)，4.15(m，1H，H-4)，4.07(m，1H，H-8)，4.02(dd，1H，J4，5＝10.10Hz，H-5)，3.90(ddd，1H，J9a9b＝12.18Hz，J9a，8＝2.77Hz，J9a，F＝2.86Hz，H-9a)，3.76(ddd，1H，J9b，8＝5.33Hz，J9b，F＝2.06Hz，H-9b)，2.40(dd，1H，J3eq，3ax＝13.00，J3eq，4＝4.88Hz，H-3eq)，2.15(s，3H，OCOCH3)，2.00(dd，1H，J3ax，4＝11.70Hz，H-3ax)，13C-NMR(400MHz，D2O)，δ175.17，173.68(C＝O)，96.01(C-1)，89.12(d，J7，F＝179.23Hz，C-7)，69.67(d，J6，F＝17.41Hz，C-6)，68.31(d，J8，F＝26.50Hz，C-8)，67.26(C-4)，62.70(C-6)，52.17(C-5)，39.19(C-3)，22.61(NHCOCH3)，参考例15(5-乙酰胺-3，5，8-三脱氧-8-氟-D-甘油基-β-D-半乳糖基-2-九吡喃糖苷酸(8-氟唾液酸)5-acetamide-3，5，8-trideoxy-8-fluoro-D-glycero-β-D-galacto-2-nonulopyranosidonic acid 27的合成)按照下述方案由唾液酸(26)合成5-乙酰胺-3，5，8-三脱氧-8-氟-D-甘油基-β-D-半乳糖基-2-九吡喃糖苷酸(27)。
以下给出了8-氟唾液酸的NMR数据。
1H-NMR(400MHz，D2O)，δ4.69(dddd，1H，J8，F＝48.7Hz，J8，9a＝5.0Hz，J8，9b＝3.5Hz，H-8)，4.03(ddd，1H，J4，5＝10.0Hz，J3ax，4＝11.1Hz，J3eq，4＝4.7Hz，H-4)，3.95(dd，1H，J4，5＝10.0Hz，J5，6＝9.9Hz，H-5)，3.94(ddd，1H，J6，7＝～0Hz，J7，8＝6.8Hz，J7，F＝14.0Hz，H-7)，3.88(ddd，1H，J9a9b＝13.3Hz，J9a，8＝3.5Hz，J9b，F＝28.0Hz，H-9b)，3.86(dd，1H，J5，6＝9.9Hz，J6，7＝～0Hz，H-6)，3.72(ddd，1H，J9a，9b＝5.33H ，J9a，8＝5.0Hz，J9a，F＝30.6Hz，H-9a)，2.28(dd，1H，J3eq， 3ax＝13.00，J3eq，4＝4.6Hz，H-3eq)，2.05(s，3H，Ac)，1.87(dd，1H，J3ax，4＝11.1Hz，J3eq，3ax＝13.00，H-3ax)参考例16(5-乙酰胺-3，5，9-三脱氧-9-氟-D-甘油基-β-D-半乳糖基-2-九吡喃糖苷酸(9-氟唾液酸)5-acetamide-3，5，9-trideoxy-9-fluoro-D-glycero-β-D-galacto-2-nonulopyranosidonic acid 28的合成)按照下述方案，由唾液酸(26)合成5-乙酰胺-3，5，9-三脱氧-9-氟-D-甘油基-β-D-半乳糖基-2-九吡喃糖苷酸(28)。
参考例17CMP-唾液酸的合成 (a)(1)Dowex 50-X8，MeOH，(2)Ac2O，60％HClO4；(b)(1)1H-Tetrazole，CH3CN，(2)t-BuOOH，CH3CN，(3)DBU，CH3CN，(4)NaOMe，MeOH，H2O将唾液酸(0.074mmol)溶于蒸馏甲醇(3mL)中，于氩气流下、室温下边搅拌边加Dowex-50W-X8(65mg)，反应3小时。确认反应结束后，过滤后减压浓缩。将残渣溶于乙酸酐(200μL)，于-20℃下边搅拌边加乙酸酐∶60％高氯酸＝15∶1溶液(22μL)，于10℃下反应40分钟。确认反应结束后，将反应溶液用乙酸乙酯稀释，用饱和碳酸氢钠水清洗。用无水硫酸镁干燥有机层，过滤后减压浓缩，得到含有羧基被保护的唾液酸(29)的残渣。将残渣和CMP-5’-氨基磷酸酯衍生物(30)(0.23mmol)用苯分别进行3次共沸，分别溶于蒸馏的乙腈(100μL)，混合。于氩气流下、冰水中边搅拌边加1H-四唑(17mg，0.23mmol)。5分钟后恢复到室温，再应10分钟。确认反应结束后，溶液用乙酸乙酯稀释，用饱和碳酸氢钠水、饱和食盐水清洗。用无水硫酸镁使有机层干燥，过滤后于30℃以下浓缩后，再用甲苯进行2次共沸，除去水。向残渣加入蒸馏过的乙腈(400μL)，于氩气流下，一边冰冷一边滴入2.5M的t-BuOOH甲苯溶液(290μL)。5分钟后恢复到室温，再搅拌20分钟。确认反应结束后，滴加二甲硫(53μL)，搅拌10分钟，对t-BuOOH进行骤冷。然后滴下DBU(18μL)，于室温下搅拌20分钟。确认反应结束后、加入甲醇(0.67mL)、水(1.35mL)、甲醇钠(360mg)，于室温反应16小时。确认反应结束后，用水提取，用二氯甲烷清洗。于25℃以下，将水层减压浓缩至8mL左右。该水溶液通过使用Sephadex G-15(1.8φ×90cm)的凝胶柱色谱(洗脱溶剂20mM氨水、流速0.3mL/分钟)纯化，得到CMP-唾液酸。
参考例18CMP-7”-脱氧-7”-氟-唾液酸的合成除了使用化合物(25)代替唾液酸以外，其他与参考例7同样，合成CMP-7”-脱氧-7”-氟-唾液酸。以下给出了NMR数据。
1H-NMR(400MHz，50mM ND4DCO3in D2O)，δ8.04(d，1H，J5，6＝7.6Hz，H-6)，6.20(d，1H，J6，5＝7.6Hz，H-5)，6.06(d，1H，J1’，2’＝4.5Hz，H-1’)，4.54(dd，1H，J7”，8”＝9.5Hz，J7”，F＝45.9Hz，H-7”)，4.42～4.20(m，7H，H-2’，H-3’，H-4’，H-5’a，H-5’b，H-6”，H-8”)，4.16(ddd，1H，J4”，3”eq＝4.7Hz，J4”，3”ax＝11.3Hz，J4，5＝10.3Hz，H-4”)，4.03(dd，1H，J5”，4”＝J5”，6”＝10.3Hz，H-5”)，3.91(ddd，1H，J9”a，9”b＝12.2Hz，J9”a，8”＝2.8Hz，J9”a，F＝2.8Hz，H-9”a)，3.75(ddd，1H，J9”a，9”b＝12.2Hz，J9”b，8”＝5.4Hz，J9”b，F＝2.1Hz，H-9”b)，2.61(dd，1H，J3”eq，4”＝4.7Hz，Jgem＝13.3Hz，H-3”eq)，2.14(s，3H，Ac)，1.76(ddd，1H，J3”ax，4”＝11.5Hz，Jgem＝13.3Hz，J3”ax，P＝5.6Hz，H-3”ax)，参考例19CMP-8”-脱氧-8”-氟-唾液酸的合成除了使用化合物(27)代替唾液酸以外，其他与参考例7同样，合成CMP-8”-脱氧-8”-氟-唾液酸。以下给出了NMR数据。
1H-NMR(400MHz，50mM ND4DCO3in D2O)，δ8.08(d，1H，J5，6＝7.6Hz，H-6)，6.20(d，1H，J6，5＝7.6Hz，H-5)，6.09(d，1H，J1’，2’＝4.1Hz，H-1’)，4.90(m，1H，H-8”)，4.42(dd，1H，J3’，2’＝J3’，4’＝4.9Hz，H-3’)，4.39(dd，1H，J2’，1’＝4.1Hz，J，2’，3’＝4.9Hz，H-2’)，4.31-4.28(m，3H，H-4’，H-5’a，H-5’b)，4.15(ddd，1H，J4”，3”eq＝4.4Hz，J4”，3”ax＝11.5Hz，J4，5＝10，5Hz，H-4”)，4.10-3.90(m，5H，H-5”，H-6”，H-7”，H-9”a，H-9”b)，2.60(dd，1H，J3”eq，4”＝4.4Hz，Jgem＝13.1Hz，H-3”eq)，2.13(s，3H，Ac)，1.77(ddd，1H，J3”ax，4”＝11.5Hz，Jgem＝13.1Hz，J3”ax，P＝4.5Hz，H-3”ax)，参考例20CMP-9”-脱氧-9”-氟-唾液酸的合成除了使用化合物(28)代替唾液酸以外，其他与参考例7同样，合成CMP-9”-脱氧-9”-氟-唾液酸。
实施例1天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的双唾液酸基α2，3糖链天冬酰胺(C1-1)以及天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的2种单唾液酸基α2，3糖链天冬酰胺(C1-2和C1-3)的合成使用唾液酸转移酶将CMP-唾液酸转移到参考例3得到的天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的去唾液酸基糖链天冬酰胺。
作为唾液酸转移酶使用来自市售的Rat、Recombinant的α2，3转移酶。
将参考例3得到的去唾液酸基9糖(20mg，10.1μmol)溶解于50mM二甲胂酸缓冲液(pH＝6.0，5mL)后，加入牛血清清蛋白(BSA，5mg)。然后加入CMP-唾液酸(26mg，40.4μmol)、碱性磷酸酶(5μL，125unit)，并进行均-化。最后加α2，3-唾液酸转移酶(CALBIOCHEM公司生产，100μL)，于37℃下静置48小时。通过HPLC监测反应，在原料减少到目的量时刻使反应终止，反应液用膜滤器进行过滤。将滤液浓缩，将溶液量减少后，通过HPLC分级柱(YMC-PackR&D ODS，D-ODS-5-A，20×250mm、AN/25mM醋酸铵缓冲液＝18/82，7.5mL/min.，波长274nm)进行纯化，25分钟后，双唾液酸基11糖化合物(C1-1)洗脱下来，30分钟后、34分钟后各个单唾液酸基10糖化合物(C1-2)以及(C1-3)分别被洗脱下来。分别收集后，进行脱盐处理，然后进行冷冻干燥，分别得到化合物1、2、3各0.7mg(2.7％)、1.9mg(8.3％)、3.5mg(15.3％)。各个化合物的NMR数据如下。
化合物(C1-1)1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ7.90(d，2H，Fmoc)，7.69(d，2H，Fmoc)，7.49(dd，2H，Fmoc)，7.42(dd，2H，Fmoc)，5.10(s，1H，Man4-H1)，4.97(d，1H，GlcNAc1-H1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.50-4.60(m，4H)，4.34(1H，Fmoc)，4.24(bs，1H，Man3-H2)，4.18(bs，1H，Man 4-H2)，4.10(m，2H)，2.74(m，3H，Asn-βCH，NeuAc7，7’-H3eq)，2.40-2.60(m，1H，Asn-βCH)，2.05，2.03，2.02(eachs，Ac)，1.77(dd，2H，NeuAc7，7’-H3ax).
化合物(C1-2)1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ7.90(d，2H，Fmoc)，7.69(d，2H，Fmoc)，7.49(dd，2H，Fmoc)，7.42(dd，2H，Fmoc)，5.10(s，1H，Man4-H1)，4.97(d，1H，GlcNAc1-H1)，4.90(s，1H，Man 4’-H-1)，4.47-4.60(m)，4.43(d，1H)，4.32(1H，Fmoc)，4.22(bs，2H)，4.17(bs，1H，Man4-H2)，4.06-4.13(m，2H)，2.72(m，2H，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.50-2.60(m，1H，Asn-βCH)，2.05，2.03，2.01(eachs，Ac)，1.77(dd，1H，NeuAc7-H3ax).
化合物(C1-3)
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ7.90(d，2H，Fmoc)，7.69(d，2H，Fmoc)，7.49(dd，2H，Fmoc)，7.42(dd，2H，Fmoc)，5.10(s，1H，Man4-H1)，4.97(d，1H，GlcNAc1-H1)，4.90(s，1H，Man4’-H-1)，4.50-4.60(m)，4.45(d，1H)，4.33(1H，Fmoc)，4.22(m，2H)，4.17(bs，1H，Man4-H2)，4.09(m，2H)，2.74(m，2H，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.45-2.60(m，1H，Asn-βCH)，2.05，2.03，2.02，2.00(eachs，Ac)，1.77(dd，1H，NeuAc7-H3ax) 实施例2将实施例1得到的化合物(C1-2)(2mg、0.88μmol)和牛血清清蛋白1mg溶解于100μL的HEPES缓冲液(50mM，pH5.0)中，再加入β-半乳糖苷酶(生化学工业公司生产，来自Jack Beans，5μL，100mU)。将该溶液于37℃下静置15小时后，用膜滤器进行过滤。将滤液通过HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝82∶18，流速为7.5mL/min)纯化后，对溶剂进行浓缩，然后进行冷冻干燥。将残留物溶解于200μL水中，通过ODS-柱色谱(コスモシ-ル75C18-OPN、最初用水清洗，然后用25％乙腈水溶液进行洗脱)进行脱盐处理，得到目的化合物(C2)0.5μg。NMR数据如下。
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ7.90(d，2H，Fmoc)，7.69(d，2H，Fmoc)，7.49(dd，2H，Fmoc)，7.42(dd，2H，Fmoc)，5.10(s，1H，Man4-H1)，4.98(d，1H，GlcNAc1-H1)，4.90(s，1H，Man4’-H-1)，4.50-4.60(m)，4.33(1H，Fmoc)，4.22(m，2H)，4.17(bs，1H，Man4-H2)，4.10(m，2H)，2.74(m，2H，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.45-2.60(m，1H，Asn-βCH)，2.05，2.03，2.01(each s，Ac)，1.78(dd，1H，NeuAc7-H3ax) 实施例3将实施例2得到的化合物(C2)(1.8mg、0.86μmol)和牛血清清蛋白1mg-起溶解于90μL的HEPES缓冲液(50mM，pH5.0)中，再加入4μL(250mU)N-乙酰基-β-葡糖胺酶(SigmaAldrich公司生产，来自Jack Beans)。将该溶液于37℃下静置24小时后，用膜滤器进行过滤。将滤夜通过HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝82∶18，流速为7.5mL/min)纯化后，对溶剂进行浓缩，然后进行冷冻干燥。将残留物溶解于200μL水中，通过ODS-柱色谱(コスモシ-ル75C18-OPN、最初用水清洗，然后用25％乙腈水溶液进行洗脱)进行脱盐处理，得到目的化合物(C3)0.9μg。
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ8.01(d，2H，J＝7.6，Fmoc)，7.80(d，2H，J＝7.6，Fmoc)，7.60(dd，2H，J＝7.6，Fmoc)，7.53(dd，2H，J＝7.6，Fmoc)，5.21(s，1H，Man4-H1)，5.09(d，1H，J＝8.8，GlcNAc1-H1)，5.00(s，1H，Man4’-H-1)，4.87(s，1H)，4.60-4.78(m，5H)，4.40-4.50(bm，2H)，4.34(s，1H)，4.28(bs，1H，Man4-H2)，4.20(dd，1H，Ja＝3.0，Jb＝9.9)，2.80-2.95(m，2H，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.65-2.75(m，1H，Asn-βCH)，2.16，2.14，2.12(eachs，Acx3)，1.98(s，3H，Ac)，1.89(dd，1H，Ja＝12.1，Jb＝11.9，NeuAc7-H3ax).
实施例4将实施例3得到的化合物(C3)(0.8mg、0.42μmol)和牛血清清蛋白1mg-起溶解于50μL的HEPES缓冲液(50mM，pH5.0)中，再加入α-甘露糖酶(SigmaAldrich公司生产，来自Jack Beans)30μL(2.9U)。将该溶液于37℃下静置63小时后，用膜滤器进行过滤。将滤夜通过HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速为7.5mL/min)纯化后，对溶剂进行浓缩，然后进行冷冻干燥。将残留物溶解于200μL水中，通过ODS-柱色谱(コスモシ-ル75C18-OPN、最初用水清洗，然后用25％乙腈水溶液进行洗脱)进行脱盐处理，得到目的化合物(C4)0.6μg。
1H NMR(400MHz，D2O，30oC，HOD＝4.81)δ8.00(d，2H，J＝7.2，Fmoc)，7.79(d，2H，J＝7.2，Fmoc)，7.59(dd，2H，J＝7.2，Fmoc)，7.52(dd，2H，J＝7.2，Fmoc)，5.21(s，1H，Man4-H1)，5.09(d，1H，J＝10.0，GlcNAc1-H1)，4.60-4.75(m，)，4.40-4.50(m，2H)，4.32(bd，1H，J＝2.3)，4.28(bs，1H)，4.22(bdd，1H，Ja＝9.7，Jb＝2.8，Man4-H2)，2.80-2.95(m，2H，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.60-2.75(m，1H，Asn-βCH)，2.14，2.14，2.12(eachs，Acx3)，1.98(s，3H，Ac)，1.88(dd，1H，Ja＝12.1，Jb＝12.0，NeuAc7-H3ax).
实施例5将实施例1得到的化合物(C1-3)(1mg、0.44μmol)和牛血清清蛋白1mg溶解于50μL的HEPES缓冲液(50mM，pH5.0)中，再加入β-半乳糖苷酶(生化学工业公司生产，来自Jack Beans，5μL，100mU)。将该溶液于37℃下静置15小时后，用膜滤器进行过滤。将滤夜通过HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝82∶18，流速为7.5mL/min)纯化后，对溶剂进行浓缩，然后进行冷冻干燥。将残留物溶解于200μL水中，通过ODS-柱色谱(コスモシ-ル75C18-opn、最初用水清洗，然后用25％乙腈水溶液进行洗脱)进行脱盐处理，得到目的化合物(C5)0.3μg。
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ8.01(d，2H，J＝7.2，Fmoc)，7.81(d，2H，J＝7.2，Fmoc)，7.60(dd，2H，J＝7.2，Fmoc)，7.53(dd，2H，J＝7.2，Fmoc)，5.21(s，1H，Man4-H1)，5.09(d，1H，J＝9.6，GlcNAc1-H1)，5.02(s，1H，Man4’-H-1)，4.55-4.70(m)，4.44(1H，Fmoc)，4.30-4.38(bm，2H)，4.28(bd，1H，Man4-H2)，4.17-4.25(m，2H)，2.78-2.95(m，2H，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.55-2.70(m，1H，Asn-βCH)，2.16，2.15，2.14，2.12(eachs，12H，Acx4)，1.98(s，3H，Ac)，1.89(dd，1H，Ja＝12.2，Jb＝12.0，NeuAc7-H3ax).
实施例6将实施例5得到的化合物(C5)(1.0mg、0.48μmol)和牛血清清蛋白1mg-起溶解于50μL的HEPES缓冲液(50mM，pH5.0)中，再加入4μL(250mU)N-乙酰基-β-葡糖胺酶(SigmaAldrich公司生产，来自Jack Beans)。将该溶液于37℃下静置22小时后，用膜滤器进行过滤。将滤夜通过HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝82∶18，流速为7.5mL/min)纯化后，对溶剂进行浓缩，然后进行冷冻干燥。将残留物溶解于200μL水中，通过ODS-柱色谱(コスモシ-ル75C18-opn、最初用水清洗，然后用25％乙腈水溶液进行洗脱)进行脱盐处理，得到目的化合物(C6)0.6μg。
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ8.01(d，2H，J＝7.6，Fmoc)，7.80(d，2H，J＝7.6，Fmoc)，7.60(dd，2H，J＝7.6，Fmoc)，7.53(dd，2H，J＝7.6，Fmoc)，5.19(s，1H，Man4-H1)，5.09(d，1H，J＝9.2，GlcNAc1-H1)，5.02(s，1H，Man4’-H-1)，4.85(s，1H)4.58-4.75(m，5H)，4.38-4.48(m，2H，Fmoc)，4.40(bd，J＝2.4，1H)，4.18-4.25(m，2H)，4.15(m，1H)，2.80-2.95(m，2H，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.65-2.75(m，1H，Asn-βCH)，2.16，2.13，2.12(eachs，9H，Acx3)，1.98(s，3H，Ac)，1.89(dd，1H，Ja＝12.2，Jb＝12.0，NeuAc7-H3ax).
实施例7将实施例6得到的化合物(C6)(1.0mg、0.53μmol)和牛血清清蛋白1mg溶解于50μL的HEPES缓冲液(50mM，pH5.0)中，再加入α-甘露糖酶(SigmaAldrich公司生产，来自Jack Beans)10μL(0.9U)。将该溶液于37℃下静置20小时后，用膜滤器进行过滤。将滤夜通过HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速为7.5mL/min)纯化后，对溶剂进行浓缩，然后进行冷冻干燥。将残留物溶解于200μL水中，通过ODS-柱色谱(コスモシ-ル75C18-opn、最初用水清洗，然后用25％乙腈水溶液进行洗脱)进行脱盐处理，得到目的化合物(C7)0.5μg。
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ8.01(d，2H，J＝7.6，Fmoc)，7.81(d，2H，J＝7.6，Fmoc)，7.60(dd，2H，J＝7.2，Fmoc)，7.53(dd，2H，J＝7.6，Fmoc)，5.D9(d，1H，J＝9.2，GlcNAc1-H1)，5.01(s，1H，Man4’-H-1)，4.84(s，1H)，4.55-4.70(m，5H)，4.44(t，1H，J＝6.0，Fmoc)，4.30-4.38(bs，1H)，4.15-4.25(m，2H)，4.17(s，1 H)，2.80-2.95(m，2H，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.55-2.70(m，1H，Asn-βCH)，2.16，2.13，2.12(eachs，Acx3)，1.98(s，3H，Ac)1.89(dd，1H，Ja＝12.2，Jb＝12.3，NeuAc7-H3ax).
实施例7A天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的双唾液酸基(α2，6)(α2，3)糖链天冬酰胺的合成使用唾液酸转移酶将CMP-唾液酸转移到参考例3得到的天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的去唾液酸糖链天冬酰胺(化合物2)。
作为唾液酸转移酶使用来自市售的Rat，Recombinant的α2，3转移酶。
将参考例3得到的化合物2(1.7mg，0.75μmol)溶解于50mM二甲胂酸缓冲液(pH＝5.0，85μL)后，加牛血清清蛋白(BSA，1mg)。然后加入CMP-唾液酸(4.8mg，7.5μmol)、碱性磷酸酶(1μL，75unit)，并进行均一化。最后加α2，3-唾液酸转移酶(CALBIOCHEM公司生产，75μL、34mU)，于37℃下静置3.5小时。通过HPLC监测反应，在原料消失的时刻，使反应终止，反应液用膜滤器进行过滤。将滤液浓缩，将溶液量减少后，通过HPLC分级柱(YMC-Pack R&D ODS，D-ODS-5-A，20×250mm、AN/25mM醋酸铵缓冲液＝18/82，7.5mL/min.，波长274nm)进行纯化，25分钟后，化合物(C7A)被洗脱下来。分别收集后，进行脱盐处理，然后进行冷冻干燥，可以得到化合物(C7A)1.3mg(67.8％)。化合物的NMR数据如下。
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ8.00(d，2H，J＝7.2，Fmoc)，7.79(d，2H，J＝7.2，Fmoc)，7.60(dd，2H，J＝7.2，Fmoc)，7.52(dd，2H，J＝7.2，Fmoc)，5.21(s，1H，Man4-H1)，5.09(d，1H，J＝8.8，GlcNAc1-H1)，5.03(s，1H，Man4’-H-1)，4.86(s，1H)，4.58-4.72(m，5H)，4.54(d，1H，J＝8.0)，4.38-4.48(m，2H)4.34(bs，1H)，4.28(bs，1H)，4.15-4.25(m，2H)，2.80-2.86(dd，1H，Ja＝4.4，Jb＝12.4，NeuAc7-H3eq)，2.73-2.83(m，dd，3H，Ja＝4.4，Jb＝12.4，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.60-2.72(m，1H，Asn-βCH)，2.16，2.15，2.14，2.12(each s，Ac x5)，1.98(s，3H，Ac)，1.89(dd，1H，Ja＝12.4，Jb＝12.0，NeuAc7-H3ax)，1.81(dd，1H，Ja＝12.4，Jb＝12.0，NeuAc7-H3ax).
实施例7B天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的双唾液酸基(α2，3)(α2，6)糖链天冬酰胺的合成使用唾液酸转移酶将CMP-唾液酸转移到参考例3得到的天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的去唾液酸糖链天冬酰胺(化合物3)。
作为唾液酸转移酶使用来自市售的Rat，Recombinant的α2，3转移酶。
将参考例3得到的化合物3(1.2mg，0.53μmol)溶解于50mM二甲胂酸缓冲液(pH＝5.0，60μL)后，加牛血清清蛋白(BSA，1mg)。然后加入CMP-唾液酸(3.4mg，5.3μmol)、碱性磷酸酶(1μL，75unit)，并进行均一化。最后加α2，3-唾液酸转移酶(CALBIOCHEM公司生产，52.9μL，24mU)，于37℃下静置3小时。通过HPLC监测反应，在原料全部消耗的时刻，使反应终止，反应液用膜滤器进行过滤。将滤液浓缩，将溶液量减少后，通过HPLC分级柱(YMC-Pack R&DODS，D-ODS-5-A，20×250mm、AN/25mM醋酸铵缓冲液＝18/82，7.5mL/min.，波长274nm)进行纯化，23分钟后，化合物(C7B)被洗脱下来。分别收集后，进行脱盐处理，然后进行冷冻干燥，可以得到化合物(C7B)1.1mg(81.2％)。各化合物的NMR数据如下。
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ8.00(d，2H，J＝7.6，Fmoc)，7.79(d，2H，J＝7.6，Fmoc)，7.59(dd，2H，J＝7.6，Fmoc)，7.51(dd，2H，J＝7.6，Fmoc)，5.21(s，1H，Man4-H1)，5.08(d，1H，J＝10.0，GlcNAc1-H1)，5.00(s，1H，Man4’-H-1)，4.84(s，1H)，4.60-4.72(m，5H)，4.52(d，1H，J＝7.6)，4.35-4.45(m，2H)，4.33(bs，1H)，4.27(bs，1H)，4.15-4.25(m，2H)，2.80-2.86(dd，1H，Ja＝4.8，Jb＝12.4，NeuAc7-H3eq)，2.73-2.83(bs，dd，3H，Ja＝4.8，Jb＝12.4，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.60-2.72(m，1H，Asn-βCH)，2.15，2.12，2.10(each s，Ac x5)，1.97(s，3H，Ac)，1.88(dd，1H，Ja＝12.4，Jb＝12.4，NeuAc7-H3ax)，1.80(dd，1H，Ja＝12.4，Jb＝12.4，NeuAc7-H3ax).

实施例8天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的7”-脱氧-7”-氟-唾液酸基α2，3-糖链天冬酰胺(C8-1)以及天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的2种单7”-脱氧-71”-氟-唾液酸基α2，3-糖链天冬酰胺(C8-2和C8-3)的合成除了使用参考例8得到的CMP-7”-脱氧-7”-氟-唾液酸以外，其它与实施例1同样操作，得到如下所示的天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的7”-脱氧-7”-氟-唾液酸基α2，3-糖链天冬酰胺以及天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的2种单7”-脱氧-7”-氟-唾液酸基α2，3糖链天冬酰胺。
实施例9除了使用实施例8得到的化合物(C8-2)代替实施例2的化合物(C1-2)以外，其它与实施例2同样操作，得到目的化合物(C9)。

实施例10除了使用实施例9得到的化合物(C9)代替实施例3的化合物(C2)以外，其它与实施例3同样操作，得到目的化合物(C10)。
实施例11除了使用实施例10得到的化合物(C10)代替实施例4的化合物(C3)以外，其它与实施例4同样操作，得到目的化合物(C11)。
实施例12除了使用实施例8得到的化合物(C8-3)代替实施例5的化合物(C1-3)以外，其它与实施例5同样操作，得到目的化合物(C12)。
实施例13除了使用实施例12得到的化合物(C12)代替实施例6的化合物(C5)以外，其它与实施例6同样操作，得到目的化合物(C13)。
实施例14除了使用实施例13得到的化合物(C13)代替实施例7的化合物(C6)以外，其它与实施例7同样操作，得到目的化合物(C14)。
实施例15天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的8”-脱氧-8”-氟-唾液酸基α2，3糖链天冬酰胺(C15-1)以及天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的2种单8”-脱氧-8”-氟-唾液酸基α2，3糖链天冬酰胺(C15-2和C15-3)的合成除了使用参考例9得到的CMP-8”-脱氧-8”-氟-唾液酸以外，其它与实施例1同样操作，得到如下所示的天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的8”-脱氧-8”-氟-唾液酸基α2，3糖链天冬酰胺以及天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的2种单8”-脱氧-8”-氟-唾液酸基α2，3糖链天冬酰胺。
该糖链天冬酰胺相当于式(1)的R1＝R2＝式(2)、R＝OH、R’＝F、R”＝OH。
该糖链天冬酰胺相当于式(1)的R1＝式(3)、R2＝式(2)、R＝OH、R’＝F、R”＝OH。
该糖链天冬酰胺相当于式(1)的R1＝式(2)、R＝OH、R’＝F、R”＝OH、R2＝式(3)。
实施例16(实施例15的半乳糖水解酶)除了使用实施例15得到的化合物(C15-2)代替实施例2的化合物(C1-2)以外，其它与实施例2同样操作，得到目的化合物(C16)。
该糖链天冬酰胺相当于式(1)的R1＝式(4)、R2＝式(2)、R＝OH、R’＝F、R”＝OH。
实施例17(实施例16的N-乙酰葡糖胺水解酶)除了使用实施例16得到的化合物(C16)代替实施例3的化合物(C2)以外，其它与实施例3同样操作，得到目的化合物(C17)。
该糖链天冬酰胺相当于式(1)的R1＝式(5)、R2＝式(2)、R＝OH、R’＝F、R”＝OH。
实施例18(实施例17的甘露糖水解酶)除了使用实施例17得到的化合物(C17)代替实施例4的化合物(C3)以外，其它与实施例4同样操作，得到目的化合物(C18)。
该糖链天冬酰胺相当于式(1)的R1＝H、R2＝式(2)、R＝OH、R’＝F、R”＝OH。
实施例19(实施例15的半乳糖水解酶)除了使用实施例15得到的化合物(C15-3)代替实施例5的化合物(C1-3)以外，其它与实施例5同样操作，得到目的化合物(C19)。
该糖链天冬酰胺相当于式(1)的R1＝式(2)、R＝OH、R’＝F、R”＝OH、R2＝式(4)。
实施例20(实施例19的N-乙酰葡糖胺水解酶)除了使用实施例19得到的化合物(C19)代替实施例6的化合物(C5)以外，其它与实施例6同样操作，得到目的化合物(C20)。
该糖链天冬酰胺相当于式(1)的R1＝式(2)、R＝OH、R’＝F、R”＝OH、R2＝式(5)。
实施例21(实施例20的甘露糖水解酶)除了使用实施例20得到的化合物(C20)代替实施例7的化合物(C6)以外，其它与实施例7同样操作，得到目的化合物(C21)。
该糖链天冬酰胺相当于式(1)的R1＝式(2)、R＝OH、R’＝F、R”＝OH、R2＝H。
实施例22天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的9”-脱氧-9”-氟-唾液酸基α2，3糖链天冬酰胺(C22-1)以及天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的2种单9”-脱氧-9”-氟-唾液酸基α2，3糖链天冬酰胺(C22-2和C22-3)的合成除了使用参考例10得到的CMP-9”-脱氧-9”-氟-唾液酸以外，其它与实施例1同样操作，得到上述的天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的9”-脱氧-9”-氟-唾液酸基α2，3糖链天冬酰胺以及天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的2种单9”-脱氧-9”-氟-唾液酸基α2，3糖链天冬酰胺。
(C22-1)相当于式(1)的R1＝R2＝式(2)、R＝OH、R’＝OH、R”＝F的糖链天冬酰胺。
(C22-2)相当于式(1)的R1＝式(3)、R2＝式(2)、R＝OH、R’＝OH、R”＝F的糖链天冬酰胺。
(C22-3)相当于式(1)的R1＝式(2)、R＝OH、R’＝F、R”＝OH、R2＝式(3)的糖链天冬酰胺。
实施例23(实施例22的半乳糖水解酶)除了使用实施例22得到的化合物(C22-2)代替实施例2的化合物(C1-2)以外，其它与实施例2同样操作，得到目的化合物(C23)。
(C23)相当于式(1)的R1＝式(4)、R2＝式(2)、R＝OH、R’＝OH，R”＝F的糖链天冬酰胺。
实施例24(实施例23的N-乙酰葡糖胺水解酶)
除了使用实施例23得到的化合物(C23)代替实施例3的化合物(C2)以外，其它与实施例3同样操作，得到目的化合物(C24)。
(C24)相当于式(1)的R1＝式(5)、R2＝式(2)、R＝OH、R’＝OH、R”＝F的糖链天冬酰胺。
实施例25(实施例24的甘露糖水解酶)除了使用实施例24得到的化合物(C24)代替实施例4的化合物(C3)以外，其它与实施例4同样操作，得到目的化合物(C25)。
(C25)相当于式(1)的R1＝H、R2＝式(2)、R＝OH、R’＝OH、R”＝F的糖链天冬酰胺。
实施例26(实施例22的半乳糖水解酶)除了使用实施例22得到的化合物(C22-3)代替实施例5的化合物(C1-3)以外，其它与实施例5同样操作，得到目的化合物(C26)。
(C26)相当于式(1)的R1＝式(2)、R＝OH、R’＝OH、R”＝F、R2＝式(4)的糖链天冬酰胺。
实施例27(实施例26的N-乙酰葡糖胺水解酶)除了使用实施例26得到的化合物(C26)代替实施例6的化合物(C5)以外，其它与实施例6同样操作，得到目的化合物(C27)。
(C27)相当于式(1)的R1＝式(2)、R＝OH、R’＝OH、R”＝F、R2＝式(5)的糖链天冬酰胺。
实施例28(实施例27的甘露糖水解酶)除了使用实施例27得到的化合物(C27)代替实施例7的化合物(C6)以外，其它与实施例7同样操作，得到目的化合物(C28)。
(C28)相当于式(1)的R1＝式(2)、R＝OH、R’＝OH、R”＝F、R2＝H的糖链天冬酰胺。
实施例29天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的7”-脱氧-7”-氟-唾液酸基(2-6)糖链天冬酰胺(C29-1)以及天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的2种单7”-脱氧-7”-氟-唾液酸基(2-6)糖链天冬酰胺(C29-2和C29-3)的合成除了使用参考例7得到的CMP-7”-脱氧-7”-氟-唾液酸，使用作为α2，6转移酶的市售的来自Rat Liver的酶作为唾液酸转移酶，将二甲胂酸缓冲液的pH调到6.0以外，其它与实施例1同样操作，得到如下所示的天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的7”-脱氧-7”-氟-唾液酸基(2-6)糖链天冬酰胺以及天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的2种单7”-脱氧-7”-氟-唾液酸基(2-6)糖链天冬酰胺。(C29-1)～(C29-3)的化学式如下所示。

实施例30(实施例29的半乳糖水解酶)除了使用实施例29得到的化合物(C29-2)代替实施例2的化合物(C1-2)以外，其它与实施例2同样操作，得到目的化合物(C30)。(C30)的化学式如下所示。
实施例31(实施例30的N-乙酰葡糖胺水解酶)除了使用实施例30得到的化合物(C30)代替实施例3的化合物(C2)以外，其它与实施例3同样操作，得到目的化合物(C31)。(C31)的化学式如下所示。
实施例32(实施例31的甘露糖水解酶)除了使用实施例31得到的化合物(C31)代替实施例4的化合物(C3)以外，其它与实施例4同样操作，得到目的化合物(C32)。(C32)的化学式如下所示。

实施例33(实施例29的半乳糖水解酶)除了使用实施例29得到的化合物(C29-3)代替实施例5的化合物(C1-3)以外，其它与实施例5同样操作，得到目的化合物(C33)。(C33)的化学式如下所示。
实施例34(实施例33的N-乙酰葡糖胺水解酶)除了使用实施例33得到的化合物(C33)代替实施例6的化合物(C5)以外，其它与实施例6同样操作，得到目的化合物(C34)。(C34)的化学式如下所示。
实施例35(实施例34的甘露糖水解酶)除了使用实施例34得到的化合物(C34)代替实施例7的化合物(C6)以外，其它与实施例7同样操作，得到目的化合物(C35)。(C35)的化学式如下所示。
实施例36～49以下同样操作合成了以下所示的糖链天冬酰胺衍生物。


另外，作为代表例，以下给出了8Fα2，6-11糖-Asn-Fmoc(C36-1)的NMR数据。
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ 8.01(d，2H，J＝7.4，Fmoc)，7.80(d，2H，J＝7.4，Fmoc)，7.59(dd，2H，J＝7.4，Fmoc)，7.52(bdd，2H，J＝7.4，Fmoc)，5.22(s，1H，Man4-H1)，5.08(d，1H，J＝9.4，GlcNAc1-H1)，5.05(s，1H，Man4’-H-1)，4.85-4.95(m，1H)，4.55-4.75(m)，4.53(d，1H，J＝7.9)，4.43(m，1H)，4.35(bs，2H，Man3-H2)，4.28(bs，1H，Man4-H2)，4.10-4.25(m，2H)，2.75-2.85(m，1H，Asn-βCH)，2.63-2.70(dd，2H，Ja＝3.9，Jb＝12.0，NeuAc7，7’-H3eq)，2.55-2.65(m，1H，Asn-βCH)，2.16，2.11，2.08(eachs，15H，Acx5)，1.84(s，3H，Ac)，1.74(dd，1H，Ja＝12.3，Jb＝12.2，NeuAc7-H3ax).
实施例50(糖链天冬酰胺衍生物的Fmoc基的脱保护)在所有的糖链天冬酰胺衍生物中，都按照以下顺序进行Fmoc基的脱保护。首先，对于每1μmol糖链天冬酰胺Fmoc体加入240μL的N，N-二甲基甲酰胺、160μL的吗啉，在室温、氩气氛围下使其反应。通过TLC(洗脱溶剂使用1M醋酸铵∶异丙醇＝8∶5)确认反应结束后，于冰水中冷却。然后加相当于反应溶液10倍量的二乙醚，搅拌15分钟后，对析出的沉淀物进行过滤。使得到的残渣溶解于水，于35℃下进行蒸发。再加3mL甲苯，反复进行3次上述蒸发操作。将残留物通过反相柱色谱(コスモシ-ル75C18-OPN、15×100mm、洗脱溶剂为水)进行纯化，得到对应的糖链天冬酰胺。
实施例51(糖链天冬酰胺的天冬酰胺残基的除去)使实施例50得到的糖链天冬酰胺与无水肼反应后，通过乙酰化，除去天冬酰胺残基后，得到对应的糖链。
实施例52～69使参考例2、3、8～13、实施例1～7中制造的各个Fmoc-糖链天冬酰胺2nmol溶解于约10mL的Tris-HCl缓冲液。向该溶液中加入GDP-岩藻糖200nmol、岩藻糖基转移酶V(Human，Recombinant)0.5mU，于37℃下静置约2小时，使其反应。将反应液用超纯水20mL稀释后，通过毛细管电泳(fused silica capillary，50mm i.d.，60cm，buffer；100mM Tris-borate，pH＝8.3，100mM Heptane sulfonate，外加电压27kV，温度25℃，214mm)进行分离，得到各个目的物。
以下给出了各个实施例中的原料及其目的物。
表1实施例52原料 (化合物2)目的物
实施例53原料 (化合物3)目的物 表2实施例54原料 (化合物4)
目的物 实施例55原料 (化合物11)目的物 实施例56原料 (化合物12)
目的物 实施例57原料 (化合物13)目的物 实施例58原料 (化合物14)目的物
实施例59原料 (化合物15)目的物 实施例60原料 (化合物16)目的物 表3实施例61原料 (化合物17)目的物
实施例62原料 (化合物18)目的物
表4实施例63原料 (化合物19)目的物
实施例64原料 (化合物20)目的物 实施例65
原料 (化合物21)目的物 实施例66原料 (化合物22)目的物 实施例67
原料 (化合物23)目的物 实施例68原料 (化合物24)目的物
实施例69原料 (化合物25)目的物
权利要求
1.下式(1)所示的含有11～7糖的α2，3糖链天冬酰胺衍生物， 式中，R1和R2是氢原子、式(2)～(5)表示的基团，可以相同，也可以不同，但是R1和R2中的一方必须是式(2)表示的基团， R，R’，R”表示如下组合。(a)R＝F、 R’＝OH， R”＝OH(b)R＝OH、 R’＝F， R”＝OH(c)R＝OH、 R’＝OH， R”＝F(d)R＝OH、 R’＝OH， R”＝OH
2.下式(6)所示的含氟的含有11～7糖的α2，6糖链天冬酰胺衍生物， 式中，RX和RY是氢原子、式(7)表示的基团、或式(3)～(5)表示的基团，但是RX和RY中的一方必须是式(7)表示的基团， R，R’，R”表示如下组合。(a)R＝F、 R’＝OH， R”＝OH(b)R＝OH、 R’＝F， R”＝OH(c)R＝OH、 R’＝OH， R”＝F
3.下式(8)所示的含有11～7糖的α2，3糖链天冬酰胺， 式中，R1和R2如上所述。
4.下式(9)所示的含氟的含有11～7糖的α2，6糖链天冬酰胺， 式中，RX和RY如上所述。
5.下式(10)所示的含有11～7糖的α2，3糖链， 式中，R1和R2如上所述。
6.下式(11)所示的含氟的含有11～7糖的α2，6糖链， 式中，RX和RY如上所述。
7.下式(12)所示的含有11糖的α2，3双唾液酸基糖链天冬酰胺衍生物的制造方法，其特征是用唾液酸转移酶使唾液酸或唾液酸的衍生物转移到用脂溶性保护基保护的糖链天冬酰胺上，将得到的用脂溶性保护基保护的糖链天冬酰胺供给色谱进行分离， 式中，R1和R2都是式(2)表示的基团。
8.下式(13)表示的含有10糖的α2，3单唾液酸基糖链天冬酰胺衍生物的制造方法，其特征是用唾液酸转移酶使唾液酸或唾液酸的衍生物转移到用脂溶性保护基保护的糖链天冬酰胺上，将得到的用脂溶性保护基保护的糖链天冬酰胺供给色谱进行分离， 式中，R1、R2的一方是式(2)表示的基团，另一方是式(3)表示的基团。
9.下式(14)表示的含有9糖的α2，3单唾液酸基糖链天冬酰胺衍生物的制造方法，其特征是用半乳糖水解酶对式(13)表示的单唾液酸基糖链天冬酰胺衍生物进行水解， 式中，R1、R2的一方是式(2)表示的基团，另一方是式(4)表示的基团。
10.下式(15)表示的含有8糖的α2，3单唾液酸基糖链天冬酰胺衍生物的制造方法，其特征是用N-乙酰葡糖胺水解酶对式(14)表示的单唾液酸基糖链天冬酰胺衍生物进行水解， 式中，R1、R2的一方是式(2)表示的基团，另一方是式(5)表示的基团。
11.下式(16)表示的含有7糖的α2，3单唾液酸基糖链天冬酰胺衍生物的制造方法，其特征是用甘露糖水解酶对式(15)表示的单唾液酸基糖链天冬酰胺衍生物进行水解， 式中，R1、R2的一方是式(2)表示的基团，另一方为氢原子。
12.下式(17)表示的含有11糖的α2，6双唾液酸基糖链天冬酰胺衍生物的制造方法，其特征是用唾液酸转移酶使唾液酸或唾液酸的衍生物转移到用脂溶性保护基保护的糖链天冬酰胺上，将得到的用脂溶性保护基保护的糖链天冬酰胺供给色谱进行分离， 式中，RX和RY都是式(7)表示的基团。
13.下式(18)表示的含有10糖的α2，6单唾液酸基糖链天冬酰胺衍生物的制造方法，其特征是用唾液酸转移酶使唾液酸或唾液酸的衍生物转移到用脂溶性保护基保护的糖链天冬酰胺上，将得到的用脂溶性保护基保护的糖链天冬酰胺供给色谱进行分离， 式中，RX和RY的一方是式(7)表示的基团，另一方是式(3)表示的基团。
14.下式(19)表示的含有9糖的α2，6单唾液酸基糖链天冬酰胺衍生物的制造方法，其特征是用半乳糖水解酶对式(18)表示的单唾液酸基糖链天冬酰胺衍生物进行水解， 式中，RX和RY的一方是式(7)表示的基团，另一方是式(4)表示的基团。
15.下式(20)表示的含有8糖的α2，6单唾液酸基糖链天冬酰胺衍生物的制造方法，其特征是用N-乙酰葡糖胺水解酶对式(19)表示的单唾液酸基糖链天冬酰胺衍生物进行水解， 式中，RX和RY的一方是式(7)表示的基团，另一方是式(5)表示的基团。
16.下式(21)表示的含有7糖的α2，6单唾液酸基糖链天冬酰胺衍生物的制造方法，其特征是用甘露糖水解酶对式(20)表示的单唾液酸基糖链天冬酰胺衍生物进行水解， 式中，RX和RY的一方是式(7)表示的基团，另一方为氢原子。
17.式(8)表示的含有11～7糖的α2，3糖链天冬酰胺的制造方法，其特征是除去式(1)表示的含有11～7糖的α2，3糖链天冬酰胺衍生物的保护基。
18.式(9)表示的含有11～7糖的α2，6糖链天冬酰胺的制造方法，其特征是除去式(6)表示的含有11～7糖的α2，6糖链天冬酰胺衍生物的保护基。
19.式(10)表示的含有11～7糖的α2，3糖链的制造方法，其特征是除去式(8)表示的含有11～7糖的α2，3糖链天冬酰胺的天冬酰胺残基。
20.式(11)表示的含有11～7糖的α2，6糖链的制造方法，其特征是除去式(9)表示的含有11～7糖的α2，6糖链天冬酰胺的天冬酰胺残基。
21.下式(22)表示的含有11糖的(α2，3)(α2，6)糖链天冬酰胺衍生物， 式中，R1是式(2)表示的基团， RY是下式(7)表示的基团， R，R’，R”表示如下组合。(a)R＝F、 R’＝OH， R”＝OH(b)R＝OH、 R’＝F， R”＝OH(c)R＝OH、 R’＝OH， R”＝F(d)R＝OH、 R’＝OH、 R”＝OH
22.下式(23)表示的含有11糖的(α2，3)(α2，6)糖链天冬酰胺衍生物， 式中，R2是式(2)表示的基团， RX是下式(7)表示的基团， R，R’，R”表示如下组合。(a)R＝F、 R’＝OH， R”＝OH(b)R＝OH、 R’＝F， R”＝OH(c)R＝OH、 R’＝OH， R”＝F(d)R＝OH、 R’＝OH、 R”＝OH
23.糖链天冬酰胺衍生物，其在天冬酰胺的氨基氮用脂溶性保护基保护的糖链天冬酰胺的非还原末端侧的N-乙酰葡糖胺上含有至少1个以上的岩藻糖。
24.权利要求23所述的含有岩藻糖的糖链天冬酰胺衍生物，其中天冬酰胺的氨基氮用脂溶性保护基保护的糖链天冬酰胺是式(1)所示的含有11～7糖的α2，3糖链天冬酰胺衍生物。
25.权利要求23所述的含有岩藻糖的糖链天冬酰胺衍生物，其中天冬酰胺的氨基氮用脂溶性保护基保护的糖链天冬酰胺是式(6)所示的含氟的含有11～7糖的α2，6糖链天冬酰胺衍生物。
26.权利要求23所述的含有岩藻糖的糖链天冬酰胺衍生物，其中天冬酰胺的氨基氮用脂溶性保护基保护的糖链天冬酰胺是下式(6)所示的含有11～6糖的α2，6糖链天冬酰胺衍生物， 式中，RX和RY是氢原子、下式(7)表示的基团，或上述式(3)～(5)表示的基团，但RX和RY中的一方必须是式(7)或式(3)表示的基团， 其中，R＝OH、R′＝OH、R”＝OH。
27.天冬酰胺的氨基氮被脂溶性保护基保护的糖链天冬酰胺的非还原末端侧的N-乙酰葡糖胺至少含有一个以上岩藻糖的糖链天冬酰胺衍生物的制造方法，其特征是用岩藻糖转移酶使岩藻糖转移到天冬酰胺的氨基氮被脂溶性保护基团保护的糖链天冬酰胺上，将得到的被脂溶性保护基保护的糖链天冬酰胺供给色谱进行分离。
全文摘要
含有11～7糖的α2，3糖链天冬酰胺衍生物、含氟的含有11～7糖的α2，6糖链天冬酰胺衍生物、以及在天冬酰胺的氨基氮被脂溶性保护基团保护的糖链天冬酰胺的非还原末端侧的N－乙酰葡糖胺上至少含有一个以上岩藻糖的糖链天冬酰胺衍生物，以及它们的制造方法。
文档编号C12P19/00GK1714155SQ20038010400
公开日2005年12月28日 申请日期2003年12月24日 优先权日2002年12月24日
发明者梶原康宏, 掛樋一晃, 深江一博 申请人:大塚化学株式会社, 梶原康宏