专利名称：一种构建cDNA文库的方法及其专用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域中一种构建cDNA文库的方法及其专用引物。
背景技术：
cDNA文库的构建是分子生物学，功能基因组学，优异资源基因分离克隆研究中不可缺少的技术。其构建一般采用纯化的Poly(A)mRNA为反转录酶的模板来合成第一链，随后用DNA聚合酶(Polymerase)合成cDNA双链，为了将合成的cDNA双链克隆到载体中，通常在其末端连接两个不同的酶切位点，以便克隆的cDNA具有方向性。这些方法都存在以下问题不能保证cDNA合成的全长性，因而cDNA文库质量难以保证；为了将合成的cDNA双链克隆到载体中，必须在其末端连接两个不同的酶切位点，使操作十分繁琐；连接时对cDNA长度的选择性偏差较高使文库的代表性降低；都要涉及核酸内切酶与DNA连接酶的使用，而且操作步骤繁琐，需要实验技术人员具有娴熟的操作技能；需用大量的Poly(A)mRNA，也不适应通量化的需要，更不能对微量宝贵样品建库；由于操作太繁琐，不能高通量化，不适应功能基因组学的飞速发展的需要。
随着功能基因组学的飞速发展，对cDNA文库的构建提出更高更新的要求，包括(1)使用微量总RNA为模板以免mRNA纯化，更重要的是使微量宝贵样品(甚至单细胞)的建库成为可能；(2)操作步骤简化以便自动化及通量化。
鉴于以上问题，不同的解决方法相继被研究出来。Clontech公司的LD PCR方法合成双链cDNA可以解决Poly(A)mRNA用量大的问题，但不能保证cDNA的全长性(Chenchik A，Zhu YY，Diatchenko L，Li R，Hill J，and Siebert P.1998.Generation and use of high-quality cDNA from small amount of total RNA bySMART PCR.In Gene Cloning and Analysis by RT-PCR.Edited by Paul Siebertand James Larrick.BioTechique Books，natiek，MA)；Invitrogen公司的GatewayTechnology解决了连接时对cDNA长度的选择性偏差问题，但没有完全解决不使用DNA连接酶的问题(Ohara O and Temple G.2001.Directional cDNA libraryconstruction assisted by the in vitro recombination reaction.Nucleic AcidResearch.vol.29，No.4 e22)。总之，现在还没有一种cDNA文库构建方法能完全解决以上问题。
发明创造内容本发明的目的是提供一种不需核酸内切酶和DNA连接酶的构建cDNA文库的专用引物。
本发明所提供的专用引物共两对，其中，一对引物用于cDNA第一条链的合成，为序列表中的SEQ ID № 1(attB2(dT)25)和SEQ ID № 2(attB1(rG)3)；另一对引物用于cDNA第二条链的合成，为序列表中的SEQ ID № 3(attB1)和SEQ ID №4(attB2)。
序列表中的SEQ ID № 1(attB2(dT)25)由51个碱基组成，在3’端带25个(d)T，尾端设计了VN序列，以提高启动引导的特异性，并在其5’末端设计了attB2重组反应特异序列，使不涉及核酸内切酶与DNA连接酶的克隆操作成为可能；SEQ ID № 2(attB1(rG)3)由28个碱基组成，基于RNase H-反转录酶完成mRNA的反转录之后在第一cDNA链3’末端继续延长三个C碱基的特性(Chenchik A，ZhuYY，Diatchenko L，Li R，Hill J，and Siebert P.1998.Generation and use ofhigh-quality cDNA from small amount of total RNA by SMART PCR.In Gene Cloningand Analysis by RT-PCR.Edited by Paul Siebert and James Larrick.BioTechiqueBooks，natiek，MA)，在引物3’末端设计了三个rG(非脱氧核甘酸G)，这三个rG与第一cDNA链3’末端延长的三个C碱基互补，使RNase H-反转录酶在合成中自动进行模板转换，并将重组反应特异序列attB1固定在第一cDNA链3’末端。
序列表中的SEQ ID № 3和SEQ ID № 4均由29个碱基组成，SEQ ID № 3含有attB1序列，SEQ ID № 4含有attB2序列。
本发明的第二个目的是提供一种可确保cDNA的全长性的合成cDNA第一链的方法。
本发明所提供的合成cDNA第一链的方法，是以总RNA(Total RNA)为模板，以序列表中的SEQ ID № 1和SEQ ID № 2为引物合成cDNA第一条链。
其中，所述cDNA第一条链的合成反应分两步进行，先用序列表中的SEQ ID №1合成cDNA第一条链，然后再用SEQ ID № 2进行cDNA第一条链合成中的模板转换反应。cDNA第一条链的合成过程如图1所示，cDNA第一条链的合成反应步骤如下将以下试剂按顺序加入微试管之中RNA样品 (1微克总量RNA)attB2(dT)25引物(10uM) 1微升DEPC-H2O 至5微升混匀并将溶液离心至管底，置于72℃水浴2分钟，之后快速冰浴2分钟，再加入下面试剂5×第一链合成缓冲液 2微升DTT(20mM) 1微升dNTP(10mM)1微升SuperScript II反转录酶1微升反应容积 10微升混匀，离心，置于42℃，反应进行60分钟后，加入以下试剂进行模板转换反应attB1(rG)3引物(10uM) 1微升5×第一链合成缓冲液 0.5微升SuperScript II反转录酶1微升反应容积 12.5微升混匀，离心，置于42℃，60分钟后反应完毕。
该方法将cDNA第一链合成反应与模板转换反应分解为两步，但仍然在同一反应管中进行，这样，第一链合成完毕之后，再进行模板转换反应，有效地避免了反转录未完成之前的模板转换，从而大大提高了cDNA的全长性。
本发明的第三个目的是提供一种完全不需核酸内切酶和DNA连接酶的构建全长cDNA文库的方法。
本发明所提供的完全不需核酸内切酶和DNA连接酶的构建cDNA文库的方法，包括以下步骤1)以总RNA(Total RNA)为模板，以序列表中的SEQ ID № 1和SEQ ID № 2为引物合成cDNA第一条链；2)用序列表中的SEQ ID № 3和SEQ ID № 4合成双链cDNA；3)将步骤2)合成的双链cDNA用λ噬菌体插入/切除特异序列重组系统连接到载体中，将所述载体导入宿主，得到cDNA文库。
其中，步骤1)中所述cDNA第一条链的合成反应分两步进行，先用序列表中的SEQ ID № 1合成cDNA第一条链，然后再用SEQ ID № 2进行cDNA第一条链合成中的模板转换反应。cDNA第一条链的合成过程如图1所示，cDNA第一条链的合成反应步骤如下将以下试剂按顺序加入微试管之中RNA样品(1微克总量RNA)attB2(dT)25引物(10uM) 1微升
DEPC-H2O至5微升混匀并将溶液离心至管底，置于72℃水浴2分钟，之后快速冰浴2分钟，再加入下面试剂5×第一链合成缓冲液 2微升DTT(20mM)1微升dNTP(10mM) 1微升SuperScript II反转录酶 1微升反应容积 10微升混匀，离心，置于42℃，反应进行60分钟后，加入以下试剂进行模板转换反应attB1(rG)3引物(10uM)1微升5×第一链合成缓冲液 0.5微升SuperScript II反转录酶 1微升反应容积 12.5微升混匀，离心，置于42℃，60分钟后反应完毕。
步骤1)将cDNA第一链合成反应与模板转换反应分解为两步，但仍然在同一反应管中进行，这样，第一链合成完毕之后，再进行模板转换反应，有效地避免了反转录未完成之前的模板转换，从而大大提高了cDNA的全长性。
因为利用序列表中的SEQ ID № 1和SEQ ID № 2将attB1与attB2序列分别固定在第一链的5’与3’末端，cDNA双链的合成变得非常简单，如图2所示，cDNA双链的合成可以采用PCR扩增来实现。
cDNA双链的合成反应完毕后进行质量检测，通常采用0.75％的琼脂糖凝胶电泳。然后进入文库构建，与常规建库一样，在构建文库前，扩增好的cDNA必须经过分子筛(层析或琼脂糖凝胶电泳)去掉合成不完全的小片段cDNA。回收的cDNA就可以供文库构建。
其中步骤3)中所述λ噬菌体插入/切除特异序列重组系统包括重组克隆酶和载体，所述载体含有attP1和attP2特异重组位点，所述重组克隆酶和载体均有商业试剂盒，如Invitrogen的BP Clonase即λ噬菌体插入酶(integrase)与pDONR207。cDNA文库的构建按照图3所示的程序进行。至此，cDNA文库已经被构建在质粒载体之中。之后，用以上反应液转化大肠杆菌，如大肠杆菌DH10B感受态细胞，得到cDNA文库。
序列表中的SEQ ID № 1和SEQ ID № 2这两个引物，不但奠定了LD PCR合成双链cDNA的基础，而且将重组克隆有机的整合，使不涉及核酸内切酶与DNA连接酶的克隆操作成为可能。本发明将cDNA第一链合成反应与模板转换反应分解，分两步进行(但仍然在同一反应管中)，这样，第一链合成完毕之后，再进行模板转换反应，有效地避免了反转录未完成之前的模板转换，从而保证了cDNA的全长性。
本发明基于RNase H-反转录酶的特性(Clark JM.1988.Novel non-templatednucleotide addition reaction catalyzed by prokaryotic and eucaryotic DNApolymerases.Nucleic Acid Research.169677-9686)与λ噬菌体插入/切除(integration/excision)特异序列重组系统(site-specific recombinationsystem，Bauer CE，Gardner JF，Gumport RI.1985.Extent of sequence homologyrequired for bacteriophage lambda site-specific recombination.J.Mol.Biol.181187-197)，设计了cDNA的合成引物与cDNA文库的构建方法，使cDNA的合成及文库构建更加快捷简便，文库cDNA的全长性得到保障，由于完全不需要核酸内切酶与DNA连接酶的介入，大大简化操作程序，便于高通量化而适应功能基因组学的飞速发展的需要；此外，该方法还具有如下优点采用重组方法将合成的cDNA双链定向克隆到载体中，不需要在其末端必须连接两个不同的酶切位点，使操作更加简便；只需要微量总RNA，不需用大量的Poly(A)mRNA，适应通量化的需要，更使微量宝贵样品甚至单细胞的建库成为可能；cDNA的插入具有方向性；重组频率高(＞106克隆/μg cDNA)；由于采用重组克隆，对cDNA长度的选择性偏差小，使所建文库具有更高的代表性；应用λ噬菌体的切除酶系统可将所建文库穿梭转移至其它载体，如表达载体以供基因表达的通量分析。本发明的方法及其专用引物适用性很广，可用于任何来源生物样品RNA，将为我国资源基因发掘利用提供一种新的强有力的基因克隆技术。
图1为cDNA第一条链的合成示意2为cDNA双链的合成示意3为重组cDNA文库的构建示意4为合成的盐芥叶片cDNA的电泳检测5为PCR检测盐芥叶片cDNA文库的电泳图具体实施方式
实施例1、盐芥(Thellungiella halophila)盐诱导叶片cDNA文库的构建盐芥盐诱导叶片(L)cDNA合成。总量RNA从三星期大小的植物用Invitrogen的Trizol试剂从叶片抽提，用1微克的总量RNA为作为反转录的模板，反转录反应采用Invitrogen的SuperScriptII试剂及其使用指南。然后用以上反转录反应液1微升作为PCR扩增模板，用TaKaRa公司的ExTaq酶试剂扩增双链cDNA。扩增的cDNA经琼脂糖凝胶电泳后回收大于500bp的片段用于建库。cDNA文库构建使用Invitrogen的BP Clonase与pDONR207试剂及其使用指南。具体步骤如下cDNA第一条链的合成反应步骤如下将以下试剂按顺序加入一支0.5毫升的微试管之中RNA样品(1微克总量RNA)attB2(dT)25引物(10uM) 1微升DEPC-H2O 至5微升混匀并将溶液离心至管底，置管于72℃水浴2分钟，之后快速冰浴2分钟，再加入下面试剂5×第一链合成缓冲液 2微升DTT(20mM)1微升dNTP(10mM) 1微升SuperScript II反转录酶 1微升反应容积 10微升混匀，离心，置于42℃，反应进行60分钟后，加入以下试剂进行模板转换反应attB1(rG)3引物(10uM)1微升5×第一链合成缓冲液 0.5微升SuperScript II反转录酶 1微升反应容积 12.5微升混匀，离心，置于42℃，15分钟后反应完毕。
其中，5×第一链合成缓冲液(Invitrogen)cDNA第一链合成反应液 2微升10×缓冲液(TaKaRa) 10微升dNTP 8微升attB1(10uM) 2微升attB2(10uM) 2微升ExTaq酶 1微升
dH2O 75微升反应容积100微升混匀，离心，置于PCR仪上按如下条件进行反应，95℃ 2分钟 1个循环95℃ 5秒钟64℃ 10秒钟72℃ 6分钟 20个循环72℃ 10分钟 1个循环反应完毕后取5微升反应产物，用0.75％的琼脂糖凝胶电泳进行质量检测，结果如图4所示，L为反应产物，M为Marker，cDNA大多分布在1至1.5kb之间，说明cDNA合成非常成功。扩增的cDNA经琼脂糖凝胶电泳后回收大于500bp的片段用于建库。采用Invitrogen的BP Clonase与pDONR207进行如下反应回收的cDNA 10微升(100-200纳克)5×BP克隆酶缓冲液 4微升pDONR207(150纳克/微升 2微升BP克隆酶 4微升反应容量 20微升混匀，离心，置于25℃过夜(16小时)。反应完毕后，加入2微升蛋白水解酶K，置于37℃，反应15分钟。至此，cDNA文库已经被构建在质粒载体之中。其中，5×BP克隆酶缓冲液(Invitrogen)。然后，用以上BP克隆酶反应液按常规方法转化大肠杆菌DH10B感受态细胞而获得cDNA文库，每微克cDNA获得大约3×106个克隆。文库cDNA插入片段PCR扩增检测结果如图5所示，其大小均在500bp以上。
序列表<160>4<210>1<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(50)<223>v＝a，c或g，<220>
<221>misc_feature<222>(51)<223>n＝a，c，g，或t<400>1accactttgt acaagaaagc tgggtttttt tttttttttt tttttttttv n 51<210>2<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(26，27，28)<223>n＝rg
<400>2acaagtttgt acaaaaaagc aggctnnn 28<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>3ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>4ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29
权利要求
1.一种构建cDNA文库的专用引物，共两对，其中，一对引物为序列表中的SEQ ID№ 1和SEQ ID № 2；另一对引物为序列表中的SEQ ID № 3和SEQ ID № 4。
2.一种合成cDNA第一链的方法，是以总RNA为模板，以序列表中的SEQ ID № 1和SEQ ID № 2为引物合成cDNA第一条链。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述cDNA第一条链的合成反应分两步进行，先用序列表中的SEQ ID № 1合成cDNA第一条链，然后再用SEQ ID № 2进行cDNA第一条链合成中的模板转换反应。
4.一种构建cDNA文库的方法，包括以下步骤1)以总量RNA为模板，以序列表中的SEQ ID № 1和SEQ ID № 2为引物合成cDNA第一条链；2)用序列表中的SEQ ID № 3和SEQ ID № 4合成双链cDNA；3)将步骤2)合成的双链cDNA用λ噬菌体插入/切除特异序列重组系统连接到载体中，将所述载体导入宿主，得到cDNA文库。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述cDNA第一条链的合成反应分两步进行，先用序列表中的SEQ ID № 1合成cDNA第一条链，然后再用SEQ ID № 2进行cDNA第一条链合成中的模板转换反应。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于步骤3)中所述λ噬菌体插入/切除特异序列重组系统包括重组克隆酶和载体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述重组克隆酶为BP Clonase。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述载体为pDONR207。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述宿主为大肠杆菌。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述大肠杆菌为大肠杆菌DH10B。
全文摘要
本发明公开了一种构建cDNA文库的方法及其专用引物，其目的是提供一种不需核酸内切酶和DNA连接酶的构建cDNA文库的方法及其专用引物。本发明所提供的构建cDNA文库的专用引物，共两对，其中，一对引物为序列表中的SEQ ID № 1和SEQID № 2；另一对引物为序列表中的SEQ ID № 3和SEQ ID № 4。一种构建cDNA文库的方法，包括以下步骤1)以总量RNA为模板，以序列表中的SEQ ID № 1和SEQID № 2为引物合成cDNA第一条链；2)用序列表中的SEQ ID № 3和SEQ ID № 4合成双链cDNA；3)将步骤2)合成的双链cDNA用λ噬菌体插入/切除特异序列重组系统连接到载体中，将所述载体导入宿主，得到cDNA文库。本发明的方法及其专用引物适用性很广，可用于任何来源的生物样品RNA。
文档编号C12N15/09GK1641040SQ20041000068
公开日2005年7月20日 申请日期2004年1月15日 优先权日2004年1月15日
发明者向成斌 申请人:中国科学技术大学