专利名称：一种生物抗菌剂的制备方法
一、所属领域本发明属于生物工程领域，具体涉及一种用微生物发酵制备活性物质的方法。
背景技术：
植物病害常常给农业生产带来重大损失，是世界粮食减产的主要原因之一。而植物病害中80％是由植物病原真菌引起的，如何有效地防治植物真菌病害，一直是农业生产中亟待解决的问题之一。国内外通常是通过施用化学合成的农药制品来进行防治，尽管有一定效果，但长期大量使用，已对生态环境系统造成了很大的破坏，并且由于病原菌的多样性、变异性和抗药性，亦给真菌病害的化学防治带来了困难。
人们开始关注其他对环境友好的真菌病害防治方法，如开发防治植物真菌病害的生物农药、微生物农药等。国内外文献报道，细菌、真菌以及放线菌均能产生可以开发成生物农药的对环境友好的抗菌物质。
本发明人在对一株从新疆棉株上分离得到的细菌“坚强芽孢杆菌”的研究过程中发现，该菌株产生的一种抗菌物质一捷安肽素，对多种病原真菌，如疫霉菌(Phytophthora sp.)、棉苗立枯病菌(Rhizoctonia solani KChn)、水稻纹枯病菌(Thanatephorus cucumeris Donk)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichumgossypii Southw)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum schw.)、灰霉菌(Botrytis cinerea)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)等有很强的抑制作用，用于大田作物可以有效地防止植物真菌病害的发生。发明人在继续对捷安肽素的发酵制备方法，抗菌谱等进行了详细研究后，完成了本发明。发明采用“批次液体培养基流加补料工艺”发酵法，制备新型抗菌剂一捷安肽素，捷安肽素可以有效防治植物真菌病害。所用细菌为坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus，2003年4月21日交普通微生物中心保藏，菌种保藏号CGMCCNo.0924)。
发明内容
本发明的目的本发明的目的之一是提供一种“批次液体培养基流加补料工艺”发酵生产抗菌剂一捷安肽素；本发明的目的之二是提供一种用于生产捷安肽素的新菌株“坚强芽孢杆菌”(Bacillus firmus)；本发明的目的之三是提供一种适用于本发明的新的培养基；本发明的目的之四是提供从发酵液中提取捷安肽素的方法；本发明的目的之五是提供捷安肽素的化学组成。
更具体地说，本发明提供一种制备抗菌剂捷安肽素的方法，包含以下步骤将能够产生捷安肽素的坚强芽孢杆菌在一级液体培养基(例如，下文所述的培养基A)中培养，作为一级种子液，将一级种子液接种于第二级液体培养基(例如，下文所述的培养基B)中，培养一段合适的时间后，开始进行第二级液体培养基流加补料发酵培养。发酵结束后，从上述发酵培养液中收集捷安肽素。
本发明所采用的坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus，2003年4月21日交普通微生物中心保藏，菌种保藏号CGMCC No.0924)，是一种营腐生生活的革兰氏阳性细菌，在土壤、水体、植物表面和其它自然环境中广泛存在，易于获取，内生芽孢、抗逆能力强、繁殖速度快、营养要求简单、对农作物和环境安全，可以产生抗菌肽，对许多真菌均有较强的抑制作用。
本发明的具体实施方案是，采用产生捷安肽素的坚强芽孢杆菌，在液体培养基中进行二级发酵培养，在每级发酵阶段选用不同的培养基。在第二级发酵中，以适合于第二级发酵的液体培养基，例如下文所述的培养基B，作为发酵培养基，适合的温度下培养一段时间，例如，在26℃-32℃发酵培养10-30小时后，开始液体培养基流加补料。
第二级液体培养基(例如培养基B)流加补料方式可以采用连续(匀速或非匀速)流加和/或间歇式流加方式，连续流加方式是优选的。
所述的连续(匀速或非匀速)流加方式，是以一定的流加速率(匀速或非匀速)将适合于第二级发酵的液体培养基(例如培养基B)连续流加入第二级发酵罐中，直至停止发酵(下罐)前大约12小时。
所述的间歇式流加方式，是以间隔一段时间加一次料的方式，间歇式将适合于第二级发酵的液体培养基(例如培养基B)流加入第二级发酵罐中。间歇时间优选为每隔3-24小时补料1-5次，更优选为大约间隔6小时补料1次。本领域技术人员也可以根据需要，采用其他的适合时间间隔补料。
发酵条件温度26℃-32℃，PH6-8发酵时间3-5天采用本发明工艺，在第二级发酵时，液体培养基只流加补料而不用出料。通过调节(升高或降低)发酵液碳氮比和溶解氧浓度，控制温度、泡沫等降低菌的新陈代谢，提高捷安肽素产率。
发酵结束后，除去菌体和其它固形物，用硫酸或盐酸调发酵液的pH值至2-5，或者用饱和度在40％-70％的硫酸铵进行盐析。收集沉淀，用低级醇溶解得到的沉淀，沉淀与低级醇溶剂的比例为1∶20至1∶40；该溶解液经浓缩后进行硅胶柱层析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作为洗脱溶剂，收集含捷安肽素的洗脱液，经浓缩后在静置和搅拌情况下，逐渐冷却，捷安肽素以固体形式析出，经收集，洗涤，干燥，即得捷安肽素产品。
本发明二级发酵所采用的培养基A、B，其具体组成如下培养基A葡萄糖0.5％-5.0％ 蛋白胨0.3％-5.0％牛肉膏0.1％-2.0％ 硫酸镁0.05％-1.0％磷酸二氢钾0.1％-1.0％培养基B
本发明所生产的捷安肽素是一种抗菌肽，其氨基酸组成奇特，经查新未见有报道类似氨基酸组成的抗菌肽。
本发明所生产的捷安肽素，其化学组成，即氨基酸组成为(按重量百分比含量计)天门冬氨酸40.1％ 丝氨酸8.1％ 谷氨酸14.6％ 甘氨酸0.1％异亮氨酸0.7％胱氨酸0.8％ 蛋氨酸0.9％ 亮氨酸0.2％苯丙氨酸0.3％酪氨酸18.0％ 赖氨酸0.2％ 脯氨酸9.6％缬氨酸0.9％ 氨5.5％本发明优选实施方案的发酵工艺全过程为将活化后的菌种接种于培养基A中，固体培养或装于三角瓶内26℃-32℃摇瓶培养10-24小时后，以5％-30％的接种量接种于已加有灭菌培养基B的发酵罐中进行发酵生产。坚强芽孢杆菌接种于发酵罐后于26℃-32℃，优选28℃-30℃发酵培养8-15小时后，开始培养基B流加补料。培养基B流加补料方式有两种，一种是连续(匀速或非匀速)流加，一种是间歇式流加，连续流加方式是优选的。
采用前一种方式时，以0.01-5.0L/h的速度连续(匀速或非匀速)流加培养基B，直至停止发酵(下罐)前约12小时。
采用后一种方式时，即间歇式流加培养基B，间歇时间可为每隔3-24小时补料1-5次，优选为大约间隔6小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.01％-1.0％，优选0.1％-0.5％。
发酵条件温度26℃-32℃，PH6-8发酵时间3-5天本发明的全工艺流程见附图1。
采用本发明工艺，在第二级发酵时，液体培养基只流加补料而不用出料。通过调节(升高或降低)发酵液碳氮比和溶解氧浓度，控制温度、泡沫等，使菌株以较高的底物转化率和产物合成速率生产捷安肽素，捷安肽素的产量可达5000单位。
发酵结束后，除去菌体和其它固形物，用硫酸或盐酸调发酵液的pH值至2-5，或者用饱和度在40％-70％的硫酸铵进行盐析。收集沉淀，用低级醇溶解得到的沉淀，沉淀与低级醇溶剂的比例为1∶20至1∶40；该溶解液经浓缩后进行硅胶柱层析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作为洗脱溶剂，收集含捷安肽素的洗脱液，经浓缩后在静置和搅拌情况下，逐渐冷却，捷安肽素以固体形式析出，经收集，洗涤，干燥，即得捷安肽素纯品。
本发明具有以下优点一、本发明菌种产生独特的抗菌活性物质捷安肽素，发酵产率高，效果好。
二、二级流加补料发酵工艺生产捷安肽素产量高，培养基利用率高，杂菌污染率低；三、发酵、提取工艺流程简单，回收率高，操作方便。
四
附图为捷安肽素发酵生产的流程图。
由图中可以清楚的看出先用捷安肽素生产菌种按照所需条件进行二级发酵培养，在第二级发酵培养过程中再进行流加补料，然后对发酵产物进行后处理获得捷安肽素的过程。
五具体实施例方式
实施例1用1000mL三角瓶10个，每瓶装300mL培养基A(葡萄糖2.0％蛋白胨3.0％牛肉膏0.5％硫酸镁0.1％磷酸二氢钾0.2％。)于120℃灭菌，冷却后接种活化后的捷安肽素产生菌坚强芽孢杆菌菌液，置于30℃温度下，摇瓶培养18小时。将培养好的种子液按5％-10％的接种量接种于内装50L灭菌培养基B(淀粉1.0％ 糊精2.0％ 乳糖1.0％ 蔗糖2.0％ 甘油0.5％ 玉米粉1.0％废糖蜜3.0％ 葡萄糖2.0％ 蛋白胨5.0％ 硝酸铵1.0％ 硫酸铵0.5％ 花生饼粉2.0％ 黄豆饼粉0.5％ 生物氮素1.0％ 磷酸二氢钾0.5％ 硫酸锌0.5％ 氯化钠0.5％ 硫酸铁0.1％。)的100L发酵罐中，在28℃-30℃温度下，通气搅拌发酵8-15小时后，以0.1-1.0L/h的速度连续流加培养基B，直至停止发酵(下罐)前约12小时。发酵PH 6-8，发酵周期5天。
发酵结束后，除去菌体和其它固形物，用硫酸或盐酸调发酵液的pH值至2-5，或者用饱和度在40％-70％的硫酸铵进行盐析。收集沉淀，用低级醇溶解得到的沉淀，沉淀与低级醇溶剂的比例为1∶20至1∶40；该溶解液经浓缩后进行硅胶柱层析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作为洗脱溶剂，收集含捷安肽素的洗脱液，经浓缩后在静置和搅拌情况下，逐渐冷却，捷安肽素以固体形式析出，经收集，洗涤，干燥，即得捷安肽素产品。
经检测，经过5天发酵，捷安肽素产量可达到5000单位以上，产品回收率达80％以上。
实施例2用1000mL三角瓶100个，每瓶装300mL培养基A(葡萄糖3.0％ 蛋白胨2.0％ 牛肉膏0.8％ 硫酸镁0.1％ 磷酸二氢钾0.5％。)于120℃灭菌，冷却后接种活化后的捷安肽素产生菌坚强芽孢杆菌菌液，置于30℃温度下，摇瓶培养18小时。将培养好的种子液按10％-15％的接种量接种于内装250L灭菌培养基B(淀粉2.0％ 糊精2.0％ 乳糖1.0％ 蔗糖1.0％ 甘油0.5％ 玉米粉0.5％ 废糖蜜3.0％ 葡萄糖1.0％ 蛋白胨1.0％ 硝酸铵3.0％ 硫酸铵2.0％ 花生饼粉5.0％ 黄豆饼粉2.0％ 生物氮素3.0％ 磷酸二氢钾0.1％ 硫酸锌0.1％ 氯化钠0.5％ 硫酸铁0.5％。)的500L发酵罐中，在28℃-30℃温度下，通气搅拌发酵10-15小时后，以0.5-2.0L/h的速度连续流加培养基B，直至停止发酵(下罐)前约12小时。发酵PH6-8，发酵周期5天。
发酵结束后，除去菌体和其它固形物，用硫酸或盐酸调发酵液的pH值至2-5，或者用饱和度在40％-70％的硫酸铵进行盐析。收集沉淀，用低级醇溶解得到的沉淀，沉淀与低级醇溶剂的比例为1∶20至1∶40；该溶解液经浓缩后进行硅胶柱层析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作为洗脱溶剂，收集含捷安肽素的洗脱液，经浓缩后在静置和搅拌情况下，逐渐冷却，捷安肽素以固体形式析出，经收集，洗涤，干燥，即得捷安肽素产品。
经检测，经过5天发酵，捷安肽素产量可达到5000单位以上，产品回收率达80％以上。
实施例3用1000mL三角瓶100个，每瓶装300mL培养基A(葡萄糖4.0％蛋白胨3.0％ 牛肉膏0.8％8 硫酸镁0.3％ 磷酸二氢钾0.4％。)于120℃灭菌，冷却后接种活化后的捷安肽素产生菌坚强芽孢杆菌菌液，置于30℃温度下，摇瓶培养18小时。将培养好的种子液按10％-15％的接种量接种于内装250L灭菌培养基B(淀粉2.0％ 糊精1.0％ 乳糖1.0％ 蔗糖2.0％ 甘油0.5％ 玉米粉0.5 废糖蜜0.5％ 葡萄糖3.0％ 蛋白胨5.0％ 硝酸铵0.5％ 硫酸铵0.5％ 花生饼粉1.0％ 黄豆饼粉2.0％ 生物氮素5.0％ 磷酸二氢钾1.0％ 硫酸锌0.1％ 氯化钠0.1％ 硫酸铁0.5％。)的500L发酵罐中，在28℃-30℃温度下，通气搅拌发酵10-15小时后，以间歇式流加培养基B，间歇时间为大约间隔6小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.1％-0.5％。发酵PH6-8，发酵周期5天。
发酵结束后，除去菌体和其它固形物，用硫酸或盐酸调发酵液的pH值至2-5，或者用饱和度在40％-70％的硫酸铵进行盐析。收集沉淀，用低级醇溶解得到的沉淀，沉淀与低级醇溶剂的比例为1∶20至1∶40；该溶解液经浓缩后进行硅胶柱层析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作为洗脱溶剂，收集含捷安肽素的洗脱液，经浓缩后在静置和搅拌情况下，逐渐冷却，捷安肽素以固体形式析出，经收集，洗涤，干燥，即得捷安肽素产品。
经检测，经过5天发酵，捷安肽素产量可达到5000单位以上，产品回收率达80％以上。
应用实例1 捷安肽素防治蔬菜真菌病害用1％的捷安肽素水剂稀释100倍-300倍，作田间喷施，防治植物真菌病害 应用实例2捷安肽素防治禾谷真菌病害用1％的捷安肽素水剂稀释100倍-300倍，作田间喷施，防治植物真菌病害。若将捷安肽素与一定浓度的ABA(脱落酸)一起喷施，可以提高防治效果与防治的持效性。
权利要求
1.一种生物抗菌剂的制备方法，其特征是将能够产生捷安肽素的坚强芽孢杆菌在一级液体培养基中培养，作为一级种子液，将一级种子液接种于第二级液体培养基中，培养一段合适的时间后，开始进行第二级液体培养基流加补料发酵培养，发酵结束后，从上述发酵培养液中收集捷安肽素。
2.权利要求1所述的能够产生捷安肽素的坚强芽孢杆菌Bacillus firmus，2003年4月21日交普通微生物中心保藏，菌种保藏号CGMCC No.0924。
3.根据权利要求1所述生物抗菌剂的制备方法，其特征是第一级液体培养基具体组成如下葡萄糖0.5％-5.0％蛋白胨0.3％-5.0％牛肉膏0.1％-2.0％硫酸镁0.05％1.0％磷酸二氢钾0.1％-1.0％。
4.根据权利要求3所述的生物抗菌剂的制备方法，其特征是第-级液体培养基优选组成如下葡萄糖2.0％-4.0％蛋白胨1.0％-3.0％牛肉膏0.5％-1.0％硫酸镁0.1％-0.5％磷酸二氢钾0.1％-0.5％。
5.根据权利要求1所述生物抗菌剂的制备方法，其特征是第二级液体培养基具体组成如下淀 粉0.1％-5.0％糊 精0.1％-3.0％乳 糖0.1％-3.0％蔗 糖0.1％4.0％甘 油0.1％-2.0％玉米粉0.1％-5.0％废糖蜜0.1％-8.0％葡萄糖0.1％-10.0％蛋白胨0.3％-10.0％ 硝酸铵0.1％-8.0％硫酸铵0.1％-7.0％花生饼粉0.1％-15.0％黄豆饼粉0.1％-15.0％生物氮素0.5％-15.0％磷酸二氢钾0.01％-5.0％硫酸锌0.01％-5.0％氯化钠0.01％-5.0％硫酸铁0.01％-5.0％。
6.根据权利要求5所述的生物抗菌剂的制备方法，其特征是第二级液体培养基优选组成如下淀粉0.3％-3.0％糊精0.5％-3.0％乳糖0.3％-3.0％蔗糖0.3％-3.0％甘 油0.5％-2.0％玉米粉0.5％-3.0％废糖蜜0.5％-5.0％葡萄糖1.0％-6.0％蛋白胨1.0％-8.0％硝酸铵0.5％-5.0％硫酸铵0.5％-5.0％花生饼粉0.5％-10.0％ 黄豆饼粉0.5％-10.0％生物氮素0.5％-12.0％磷酸二氢钾0.05％-3.0％硫酸锌0.05％-3.0％氯化钠0.05％-3.0％硫酸铁0.05％-3.0％。
7.根据权利要求6所述的生物抗菌剂的制备方法，其特征是第二级液体培养基最优选组成如下淀 粉0.5％-2.0％糊 精0.5％-2.0％乳 糖0.5％-2.0％蔗糖0.5％-2.0％甘 油0.5％-1.0％玉米粉0.5％-2.0％废糖蜜0.5％-3.0％葡萄糖1.0％-3.0％蛋白胨1.0％-5.0％硝酸铵0.5％-3.0％硫酸铵0.5％-3.0％花生饼粉0.5％-5.0％黄豆饼粉0.5％-5.0％生物氮素 1.0％-8.0％磷酸二氢钾0.05％-1.0％硫酸锌0.05％-1.0％氯化钠0.05％-1.0％硫酸铁0.05％-1.0％。
8.根据权利要求1所述生物抗菌剂的制备方法，其特征是流加补料可采取连续流加方式，连续流加的速率可以是匀速的也可以是非匀速的。
9.根据权利要求1所述生物抗菌剂的制备方法，其特征是流加补料还可采取间歇式流加方式。
10.根据权利要求1所述生物抗菌剂的制备方法，其特征是第一级发酵接种量5％-30％，26℃-32℃摇瓶培养10-24h。
11.根据权利要求1所述生物抗菌剂的制备方法，其特征是第二级发酵条件温度26℃-32℃，PH6-8，发酵时间3-5天。
12.根据权利要求1所述生物抗菌剂的制备方法，其中捷安肽素的提取方法为发酵结束后，除去菌体和其它固形物，用硫酸或盐酸调发酵液的pH值至2-5，或者用饱和度在40％-70％的硫酸铵进行盐析。收集沉淀，用低级醇溶解得到的沉淀，沉淀与低级醇溶剂的比例为1∶20至1∶40；该溶解液经浓缩后进行硅胶柱层析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作为洗脱溶剂，收集含捷安肽素的洗脱液，经浓缩后在静置和搅拌情况下，逐渐冷却，捷安肽素以固体形式析出，经收集，洗涤，干燥，即得捷安肽素产品。
13.本发明所生产的捷安肽素，其化学组成，即氨基酸组成按重量百分比含量计为天门冬氨酸 40.1％ 丝氨酸 8.1％谷氨酸 14.6％ 甘氨酸 0.1％异亮氨酸0.7％胱氨酸 0.8％蛋氨酸 0.9％ 亮氨酸 0.2％苯丙氨酸0.3％酪氨酸 18.0％ 赖氨酸 0.2％ 脯氨酸 9.6％缬氨酸 0.9％氨 5.5％。
全文摘要
本发明属于生物工程领域。针对目前真菌引起大量的植物病害，本发明公开了一种对植物真菌病害有较好防治效果的生物抗菌剂捷安肽素的制备方法。通过采用一株坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus，菌种保藏号CGMCC No.0924)在适宜条件下进行二级发酵培养，发酵结束后通过过滤、盐析和柱层析等后处理得到捷安肽素，本发明具有成本低、效率高等优点。
文档编号C12P13/00GK1699585SQ20041002256
公开日2005年11月23日 申请日期2004年5月20日 优先权日2004年5月20日
发明者谭红, 周金燕, 雷宝良, 李志东, 杨杰, 钟娟, 白冰如 申请人:中国科学院成都生物研究所