一种生产7-氨基头孢烷酸的方法

专利名称：一种生产7-氨基头孢烷酸的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术特别是生物工程领域中一种生产7-氨基头孢烷酸的方法，特别涉及一种利用酶法生产7-氨基头孢烷酸的方法。
背景技术：
7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，7-ACA)是目前半合成头孢菌素的重要原料，主要由头孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)通过化学法或酶法裂解脱去7-位上的D-α-氨基己二酰侧链得到。
酶法替代传统的化学法裂解头孢菌素C生产7-ACA，具有工艺简单、效率高、成本低、安全、无污染及产品质量稳定等优点，在经济和环保上都具有很大的竞争力。近些年来，人们已对酶法生产半合成抗生素的研究和开发投入了大量资金和力量。用酶法裂解生产7-ACA，分为一步酶法和两步酶法。其中一步酶法，利用头孢菌素C酰化酶(Cephalosporin C acylase)直接催化CPC，脱去7-位上的D-α-氨基己二酰侧链，生成7-ACA。虽然该法步骤简单，但目前已发现的CPC酰化酶活力都十分低，远不能满足工业催化的需要。两步酶法是利用两个来源不同的酶进行催化，首先，CPC在D-氨基酸氧化酶(D-Amino Acid Oxidase，DAAO)的作用下，产生一个具酮基的中间体，这个中间体较不稳定，很容易被同时生产的H2O2化学氧化脱羧，转变成戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(Glutaryl-7-amidocephalosporanic Acid，GL-7-ACA)；然后在GL-7-ACA酰化酶的作用下脱去其侧链，生成7-ACA。
目前，利用两步酶法催化裂解CPC制造7-ACA的技术在国外已经工业化，国内也已经引进国外技术进行7-ACA试生产，但是都采用固定化酶或固定化细胞的方式进行7-ACA的生产，目的是使酶能够反复使用。但这种方法具有一定的缺点，例如在制备固定化酶之前需要对酶进行多步分离纯化，会造成酶的大量损失；固定化酶和固定化细胞都会增加底物和产物的扩散阻力，使催化反应速率下降；固定化酶和固定化细胞的酶活收率都较低，一般低于50％。在7-ACA生产领域，国内目前还没有自主生产的固定化酶，而进口的固定化酶价格昂贵，采用固定化酶生产的7-ACA成本甚至高于化学法的成本。因此，开发一条新的7-ACA生产工艺具有重要的经济意义。
在现代生物工程领域中，膜分离技术得到越来越多的关注。应用膜分离设备，可以将大分子物质(或细胞)和小分子物质进行很好的分离，而且作为催化剂的大分子物质(酶分子)和细胞的活性不会损失，可以进行反复使用。膜分离技术操作简单，成本较低，容易实现连续化操作。
随着中国加入WTO，国外先进技术生产的头孢菌素将大量涌入中国，国内抗生素工业将面临严峻的形势。因此，加紧开发具有先进水平的酶法生产7-ACA的技术，满足国内需求和增强国际市场竞争力已迫在眉睫。
发明创造内容本发明的目的是提供一种生产7-氨基头孢烷酸的方法。
本发明所提供的生产7-氨基头孢烷酸的方法，包括以下步骤1)培养并收集具有D-氨基酸氧化酶和戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶活性的游离细胞；2)将步骤1)中收集得到的游离细胞重悬于pH7.0-8.0缓冲溶液中，然后加入1-5％的头孢菌素C溶液，在20-35℃反应200-600min，得到7-氨基头孢烷酸。
步骤1)中具有D-氨基酸氧化酶和戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶活性的游离细胞可按培养出发细胞的条件进行培养条。
为了得到较高纯度的7-氨基头孢烷酸，上述方法中还包括分离和纯化步骤，所述分离纯化步骤为将上述步骤2)中得到的7-氨基头孢烷酸产物通过中空纤维滤膜，收集滤液，再将所述滤液的pH调至3.5，得到纯化的7-氨基头孢烷酸。
所述步骤1)中收集得到的具有D-氨基酸氧化酶和戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶活性的游离细胞可为以相对酶活比为1∶0.5-1∶2.5的具有D-氨基酸氧化酶活性的游离细胞和具有戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶活性的游离细胞的混合细胞。所述具有D-氨基酸氧化酶活性的游离细胞和具有戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶活性的游离细胞可通过下述方法得到将D-氨基酸氧化酶的编码基因和戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶的编码基因分别连接入表达载体，筛选得到可表达上述两种酶的重组表达载体，并将其导入可作为所述表达载体的宿主的细胞，筛选得到具有D-氨基酸氧化酶活性的游离细胞和具有戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶活性的游离细胞。其中，所述表达载体可为pET、pKK、pUC、pPIC等，优选为pET；所述宿主可为大肠杆菌，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)等，优选为大肠杆菌。所述具有D-氨基酸氧化酶活性的游离细胞优选为BL21(DE3)/pET-DAAO；所述具有GL-7-ACA酰化酶活性的游离细胞优选为BL21(DE3)/pET-ACY。
所述步骤1)中收集得到的具有D-氨基酸氧化酶和戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶活性的游离细胞也可为含有具有戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶和D-氨基酸氧化酶活性的重组酶的游离细胞。所述具有D-氨基酸氧化酶和戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶活性的游离细胞可通过下述方法得到将具有戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶和D-氨基酸氧化酶活性的重组酶的编码基因连接入表达载体，筛选得到可表达所述重组酶的重组表达载体，并将其导入可作为所述表达载体的宿主的细胞，筛选得到具有D-氨基酸氧化酶活性和戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶活性的游离细胞。其中，所述表达载体可为pET、pKK、pUC、pPIC等，优选为pET；所述宿主可为大肠杆菌，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)等，优选为大肠杆菌。所述含有具有戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶和D-氨基酸氧化酶活性的重组酶的游离细胞优选为BL21(DE3)/pET-ALD。其中，所述重组酶及其编码基因以及BL21(DE3)/pET-ALD已在2003年11月17日提出的申请号为200310113563.3的中国专利申请中详细描述。
上述方法中，所述步骤2)中的缓冲溶液可为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液等，所述缓冲溶液的浓度可为0-1mol/L，所述缓冲溶液pH可为pH6.5-9；其中，所述缓冲溶液优选为pH8.0的0.1mol/L磷酸盐缓冲液。
上述方法中，所述中空纤维滤膜包括中空纤维超滤膜和中空纤维微滤膜；所述中空纤维滤膜的膜材料包括聚砜、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯和聚丙烯等有机高分子材料。所述中空纤维超滤膜的截留分子量为10,000-100,000；所述中空纤维微滤膜的孔径为0.1-0.45μm。
本发明的方法将具有D-氨基酸氧化酶和戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶活性的游离细胞作为生物催化剂代替固定化酶，进行头孢菌素C的催化，可以省去酶的分离、纯化和固定化的操作，不会因为分离而损失菌体的酶活，从而可以达到较高的酶活使用效率。在催化反应得到7-ACA后，采用膜分离的技术对反应产物进行分离，细胞与反应液可完全分离，作为催化剂的菌体细胞可以进行反复使用。研究结果表明，过滤液澄清透亮，其中产物7-ACA可全部通过膜，没有损失，且经膜法分离后制备的7-ACA可以达到较高的纯度和收率。
本发明应用超滤膜与生物反应体系的耦合，可以实现游离细胞催化反应及反应产物的分离过程，一定截留分子量的超滤膜在截留菌体和透过反应液的同时，也可以截留在反应过程中细胞产生的一些生物杂质，使分离得到的7-ACA达到较高的纯度。研究结果表明，游离细胞反应与膜分离耦合的新工艺具有操作简单、节约酶分离和固定化成本、产品质量好等优点，可以降低7-ACA的生产成本。本发明的游离细胞催化与膜分离耦合新工艺为7-ACA的酶法生产提供了一条新思路，将加快头孢菌素C催化生产7-ACA的工业化的步伐。


图1为用中空纤维滤膜分离头孢菌素C反应液的示意2a为实施例1中得到的CPC反应液的HPLC检测图谱图2b为用离心法分离的7-ACA的HPLC检测图谱图2c为7-ACA标准品(纯度＞98％)的HPLC检测图谱图2d为中空纤维膜分离的7-ACA的HPLC检测图谱具体实施方式
实施例1、DAAO和GL-7-ACA酰化酶混合菌体的催化用LB培养基对DAAO的基因工程大肠杆菌BL21(DE3)/pET-DAAO(三角酵母D-氨基酸氧化酶基因的EMBL genebank序列号为AY514426，基因扩增和质粒构建方法参见《分子克隆实验指南》，第二版，萨姆布鲁克T，科学出版社，1992。质粒图谱见2003年11月17日提出的申请号为200310113563.3的中国专利申请)进行培养和诱导表达，菌液在4℃下，6000r/min离心10min，离心收集菌体。将收获的菌体用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)在50mL三角瓶中重悬，菌浓度为OD600＝10。
用LB培养基对GL-7-ACA酰化酶的基因工程大肠杆菌BL21(DE3)/pET-ACY(GL-7-ACA酰化酶基因的EMBL genebank序列号为AY311488，基因扩增方法见2003年6月9日提出的申请号为03143198.4的中国专利申请，质粒构建方法参见《分子克隆实验指南》，第二版，萨姆布鲁克T，科学出版社，1992。质粒图谱见2003年11月17日提出的申请号为200310113563.3的中国专利申请)进行培养和诱导表达，菌液在4℃下，6000r/min离心10min，离心收集菌体。将收获的菌体用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)在50mL三角瓶中重悬，菌浓度为OD600＝10。
将重悬的BL21(DE3)/pET-DAAO菌液和BL21(DE3)/pET-ACY菌液按相对酶活比为1∶1.5进行混合，再加入用同样磷酸盐缓冲液溶解的3％头孢菌素C溶液，28℃摇床反应。用HPLC法检测反应产物。采用Shimadzu C18柱，流动相为7.5％乙腈-15％甲醇-1％乙酸，流速为1mL/min，检测波长为260nm。结果如图2a所示，表明经过混合菌体约300min的催化反应，CPC基本都转化生成7-ACA，说明用游离的混合菌体细胞可以成功的催化CPC。
实施例2、融合蛋白的菌体直接催化CPC用LB培养基对融合蛋白的基因工程菌BL21(DE3)/pET-ALD(2003年11月17日提出的申请号为200310113563.3的中国专利申请)进行培养和诱导表达，菌液在4℃下，6000r/min离心10min，离心收集菌体。将收获的菌体用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)在50mL三角瓶中重悬，菌浓度为OD600＝10。
在重悬的BL21(DE3)/pET-ALD菌液中加入用同样磷酸盐缓冲液溶解的3％CPC溶液，28℃摇床反应。用HPLC法检测反应产物。采用Shimadzu C18柱，流动相为7.5％乙腈-15％甲醇-1％乙酸，流速为1mL/min，检测波长为260nm。经过游离的融合蛋白的菌体约300min的催化反应，CPC基本都转化生成7-ACA，说明用游离的融合蛋白菌体细胞也可以成功的催化CPC。
实施例3、膜分离CPC催化产物将实施例1中得到的CPC的催化反应液，采用膜分离的方法进行细胞与产物的分离。选择中空纤维超滤膜(截留分子量30,000)，分离过程如图1所示。膜分离的反应液，采用6N HCl调节反应液的pH至3.5，使7-ACA进行等电结晶。经过减压过滤和真空干燥，得到白色的7-ACA晶体，产物可完全溶解。用HPLC法进行纯度检测，结果如图2d所示，表明纯度为93.1％，7-ACA产品中基本不含有在紫外下有吸收的杂质，其中的杂质可能为反应液中的部分无机盐。膜过滤法得到的7-ACA与7-ACA标准品(纯度＞98％，图2c)接近。
实施例4、膜分离工艺中菌体的重复使用将实施例3中经膜分离得到的菌体，按实施例1的条件再次催化3％的CPC溶液。
经过游离细胞约300min的催化反应，CPC基本都转化生成7-ACA。这说明，经过催化反应及膜分离的菌体细胞仍具有很好的催化活性，可以多次循环使用。
对比例、离心分离CPC催化产物将实施例1中得到的CPC的催化反应液，采用离心法进行细胞与产物的分离。在4℃下，6000r/min离心10min，离心得到上清液，采用6N HCl调节反应液的pH至3.5，使7-ACA进行等电结晶。经过减压过滤和真空干燥，得到淡黄色的7-ACA晶体。用HPLC法进行纯度检测，结果如图2b所示，纯度为80％。产物中有部分不溶物，可能是菌体碎片或蛋白。
权利要求
1.一种生产7-氨基头孢烷酸的方法，包括以下步骤1)培养并收集具有D-氨基酸氧化酶和戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶活性的游离细胞；2)将步骤1)中收集得到的游离细胞重悬于pH7.0-8.0缓冲溶液中，然后加入1-5％的头孢菌素C溶液，在20-35℃反应200-600min，得到7-氨基头孢烷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述生产7-氨基头孢烷酸的方法中还包括分离和纯化步骤，所述分离纯化步骤为将所述步骤2)中得到的7-氨基头孢烷酸产物通过中空纤维滤膜，收集滤液，再将所述滤液的pH调至3.5，得到纯化的7-氨基头孢烷酸。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤1)中收集得到的具有D-氨基酸氧化酶和戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶活性的游离细胞是以相对酶活比为1∶0.5-1∶2.5的具有D-氨基酸氧化酶活性的游离细胞和具有戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶活性的游离细胞的混合细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述具有D-氨基酸氧化酶活性的游离细胞和具有戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶活性的游离细胞通过下述方法得到将D-氨基酸氧化酶的编码基因和戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶的编码基因分别连接入表达载体，筛选得到可表达上述两种酶的重组表达载体，并将其导入可作为所述表达载体的宿主的细胞，筛选得到具有D-氨基酸氧化酶活性的游离细胞和具有戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶活性的游离细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述具有D-氨基酸氧化酶活性的游离细胞为BL21(DE3)/pET-DAAO；所述具有戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶活性的游离细胞为BL21(DE3)/pET-ACY。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤1)中收集得到的具有D-氨基酸氧化酶和戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶活性的游离细胞是含有具有戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶和D-氨基酸氧化酶活性的重组酶的游离细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述含有具有戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶和D-氨基酸氧化酶活性的重组酶的游离细胞为BL21(DE3)/pET-ALD。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤2)中的缓冲溶液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液，所述缓冲溶液的浓度为0-1mol/L，所述缓冲溶液pH为6.5-9；所述缓冲溶液优选为pH8.0的0.1mol/L磷酸盐缓冲液。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述中空纤维滤膜包括中空纤维超滤膜和中空纤维微滤膜；所述中空纤维滤膜的膜材料包括聚砜、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯和聚丙烯。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述中空纤维超滤膜的截留分子量为10,000-100,000；所述中空纤维微滤膜的孔径为0.1-0.45μm。
全文摘要
本发明公开了一种生产7－氨基头孢烷酸的方法。本发明所提供的生产7－氨基头孢烷酸的方法包括以下步骤1)培养并收集具有D－氨基酸氧化酶和戊二酰基－7－氨基头孢烷酸酰化酶活性的游离细胞；2)将步骤1)中收集得到的游离细胞重悬于pH7.0－8.0缓冲溶液中，然后加入1－5％的头孢菌素C溶液，在20－35℃反应200－600min，得到7－氨基头孢烷酸。本发明通过游离细胞催化及膜分离的耦合，使7－ACA的生产工艺和设备得到简化，酶的利用率得到提高，使生产总成本降低。本发明的方法与传统的固定化酶或固定化细胞方法相比，具有明显的优势，展现了很好的工业应用前景。
文档编号C12P35/00GK1557962SQ20041003957
公开日2004年12月29日 申请日期2004年2月10日 优先权日2004年2月10日
发明者罗晖, 沈忠耀, 李强, 于慧敏, 罗 晖 申请人:清华大学