专利名称：表达基因分析方法以及用于表达基因分析的探针试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用荧光能量转移的表达基因分析的方法以及用于表达基因分析的探针试剂盒。尤其特殊的是，本发明涉及使用与目的基因序列无关的探针可被普遍应用的表达基因分析的方法以及用于表达基因分析的探针试剂盒，其是通过引进一个与靶基因基本序列无关的序列来实现的。
背景技术：
以前，逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)是通过RNA的检测实现。在RT-PCR中，cDNA依据靶基因通过逆转录首先合成，然后再通过PCR(聚合酶链式反应)扩增，然后再检测PCR产物。以核酸序列为基础的扩增(NASBA)被认为是一种利用逆转录酶，核糖核酸酶H和T7RNA聚合酶在90-120分钟的反应中可以使靶基因从初始量扩增到至少1012的方法(J.ComptonNucleic acid sequence-based amplification，Nature，1991，350，pp.91-92)。由于NASBA是在41℃的恒温条件下进行，可以防止除了靶基因之外的基因组DNA发生热变性。因此，靶基因通过该反应比通过RT-PCR可以被更特异性地扩增。不同于PCR，该反应不需要任何热循环。因此，反应条件不需要根据靶基因序列作出调整。这使得可以利用具有简单结构的设备进行扩增。
当检测PCR产物的量时，荧光检测与电泳往往联合应用。通常，扩增产物的大小是首先通过电泳来确定，检测荧光的密度，然后确定扩增产物的量。最近，已报道几种方法可以不用电泳而通过实时荧光检测PCR产物的量(Pamela M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，August 1991，Vol.88，pp.7276-7280；S Tyagi，F R Kramer，Nature Biotechnology，1996，Vol.14，pp.303-308)。在这些方法中，被设计成为通过荧光能量转移杂交到PCR产物上发射荧光的探针(如TaqMan探针或分子信标(MolecularBeacon))用于实时检测。在实验过程中，PCR产物可以在每一个循环中检测到，因此，可以轻易地检测到PCR产物进行指数扩增的PCR循环的区域以及PCR产物到达平台期的PCR循环的区域。因此，RT-PCR中的工作减少，而这种方法作为一种用于表达基因分析的有效方法而迅速地广泛应用。
然而，在通过荧光能量转移检测PCR产物的方法中，用于检测靶基因的探针或引物必须针对每个靶基因单独设计。另外，这样的探针由于使用荧光能量转移没有成本集中的优势，而且还有设计方针要不同于一般引物的困难。
一种应用与靶基因序列无关可被广泛应用的分子信标用于核酸扩增的方法也已开发出来(USP No.6,090,552)。在这种方法中，NASBA应用于基因扩增。
相反，Whitcombe等公布使用与靶基因序列无关可被广泛应用的TaqMan探针用于PCR产物的荧光检测(Whitcombe D.et al.，ClinicalChemistry，1998，Vol.44，No.5，pp.918-932)。这种分析以基因组DNA为目标，目的在于单链核酸多态性(SNP)分类。在该方法中，一个模板非特异性探针序列和一个标签序列被导入到基因组DNA中。这可以实现使用该模板非特异性TaqMan探针进行分析。然而，此方法中用了两种类型的引物对，例如，一对用于导入的引物以及另一对与所合成的DNA的标签序列杂交从而扩增DNA的引物。这就必需两个不同的热循环，并导致了不可避免的副产物的产生。当实时检测在单一反应容器中进行，两种探针的反应特性由于其Tm值(退火温度)的不同而不可能被准确的控制在相同水平。因此，这种检测对于基因表达的定量检测是不方便的。
本发明的目的在于解决现有技术的问题并提供一个用于表达基因分析，与靶基因序列无关的可被广泛应用的全新试剂盒，以及一种利用该试剂盒用于表达基因分析的简单方法。
发明内容
为了达到上述目的，本发明提供以下方法用于表达基因分析一种表达基因分析方法包括使用与待分析基因特异性杂交的上游引物、导入引物、含有与第一碱基序列相同或互补的碱基序列并且一端用荧光团另一端用淬灭剂进行标记的探针、逆转录酶、RNA聚合酶、以及核糖核酸酶H和/或核酸外切酶，对待分析基因进行核酸扩增，所述导入引物包含一个比含有特异性与靶基因杂交的序列的第三碱基序列更靠近5’端的第一碱基序列以及包含一个比第一碱基序列更靠近5’端的第二碱基序列；在核酸扩增时，用核糖核酸酶H或核酸外切酶消化结合在第一碱基序列上的探针；以及检测释放的荧光团所发出的荧光，从而确定核酸扩增产物的量，其中待分析基因的制备是通过将第一碱基序列和含有RNA聚合酶启动子序列(其对于靶基因的碱基序列是非特异性的)的第二碱基序列导入靶基因，使得第二碱基序列结合位置比第一碱基序列更靠近5’端。
第一碱基序列和第二碱基序列通过导入引物导入靶基因中，导入引物由三个序列部分组成。导入引物包括第一碱基序列，其比含有特异性与靶基因杂交的序列的第三碱基序列更靠近5’端，和第二碱基序列，其比第一碱基序列更靠近5’端。第一部分是与检测探针相同或互补的序列，第二部分是包含启动子序列和RNA聚合酶转录起始位点的序列。第一，第二，和第三部分可以是连续的，或者也可以在两部分之间有连接部分。尽管第三序列依据靶基因序列而变化，但第一碱基序列不依赖靶基因序列而自由设计。第二碱基序列是与靶基因序列无关的不变序列(如T7启动子序列)。
上述提及的上游引物是用来扩增待分析基因或其中的一部分。它可以是杂交位置比导入待分析基因的第三部分更靠近3’端的任何寡核苷酸。
本发明中使用的RNA聚合酶没有特殊限制。任何RNA聚合酶，如T7RNA聚合酶，T3RNA聚合酶，或SP6RNA聚合酶，都可使用，优选T7RNA聚合酶。使用T7RNA聚合酶时，上述第二部分优选包含有T7启动子序列。
例如，当要检测具有特定靶基因的mRNA时，包含有上述三个序列部分的导入引物首先被作为逆转录引物来从靶RNA(mRNA)合成第一链cDNA。
该cDNA的功能就是作为待分析基因(单链cDNA)，通过将第一和第二碱基序列(RNA聚合酶的启动子序列)导入靶基因。随后，得到的待分析基因(cDNA)用作合成第二链cDNA的模板。因此，一个含有RNA聚合酶启动子序列的待分析基因(双链cDNA)就合成了。
包含有RNA聚合酶启动子序列的被分析合成基因按照以下方式扩增。
1)首先，待分析基因在RNA聚合酶的作用下转录到RNA。RNA聚合酶识别待分析基因中的启动子序列，转录靶基因mRNA的许多cRNAs(反义RNAs)。
2)随后，上述RNA在上游引物及逆转录酶或核糖核酸酶H的作用下逆转录，合成单链cDNA。
3)待分析基因然后在导入引物作用下由单链cDNA合成。合成可以通过添加额外的DNA聚合酶进行。替代地，由于通常具有DNA聚合酶活性，可以使用逆转录酶。
被分析的合成基因在步骤1)中作为作为转录的模板，步骤1)到3)相继重复。这样，扩增继续下去。
这样扩增的双链cDNA使用含有与第一碱基序列相同或互补序列的TaqMan探针进行检测。TaqMan探针是DNA探针，其5’端用荧光团标记，3’端用可通过能量转移(淬灭)来淬灭荧光团所发射荧光的物质来标记。TaqMan探针通常状态不发射荧光，因为其5’端与3’端分别用荧光团和淬灭剂来标记。然而，扩增时，探针与靶序列杂交，然后探针被核糖核酸酶H或核酸外切酶消化。因此，产生自由的荧光团，从而发射荧光。
本发明用于表达基因分析的方法中，逆转录后的核酸扩增是在大致单一温度(恒温)下使用一对引物完成的。词组“大致单一温度”是指一个温度，在该温度下酶例如逆转录酶，核糖核酸酶H，RNA聚合酶，和核酸外切酶同时具有酶的活性。特别地，它是大约35℃到55℃，优选大约40℃到42℃。在这个温度下，逆转录，双链cDNA的合成，转录和探针的消化同时进行。然而，包含几百或更多的核苷的双链DNA(例如基因组DNA)在这个温度范围内通常不变性。因此，除了靶基因以外的基因组DNA在本发明用于表达基因分析的过程中不扩增。更为特殊的是，通过特定温度下简单地进行孵育，靶基因可以在不产生任何反应副产物的基础上被特异检测。
检测探针可以无关于靶基因序列进行自由设计。因此，它可以不用考虑靶基因的类型而被广泛应用。
根据本发明用于表达基因分析的方法，用两种或更多种类型的探针就可以在用于一个靶基因的单一反应容器中同时分析来源于单独或几个样品的两种或更多种靶基因。
例如，可以同时分析一个样品和标准取样来比较靶取样与样品的定量比率。在这样的分析中，上述探针的Tm值优选设定在大致相同水平来控制同一水平的每个探针的反应特性，从而进行精确的表达分析。
本发明也提供了一种用于表达基因分析的试剂盒。这个试剂盒包括具有与第一碱基序列相同或互补序列的探针，一端用荧光团标记，另一端用淬灭剂标记，其中第一碱基序列和比第一碱基序列靠近5’端的第二碱基序列对靶基因的碱基序列都是非特异的，并且都导入靶基因。
几种靶基因同时检测时，前面提到的试剂盒优选包含两种或更多类型的探针，这些探针的Tm值都大体相同。具有大体相同Tm值的两种或更多类型探针的例子可以是这样的探针，其由两三个模块序列组成，每个模块包括3或4个碱基，每个模块序列两个末端碱基(一个碱基在5’端，一个碱基在3’端)彼此相同，并且每个探针是通过重新排列具有相同末端碱基的模块序列而形成。
图1是表明使用本发明通用探针通过NASBA进行实时基因检测过程示意图。
图2是表明本发明的通用探针与逆转录引物之间的序列相关性的示意图。
图3是表明本发明的通用引物与靶核酸杂交，然后水解发射荧光的原理的示意图。
图4是表明两种类型的通用探针序列的示意图。
图5是表明使用两种类型的通用探针通过NASBA进行实时基因检测过程示意图。
图6是表明使用本发明通用探针实时NASBA检测结果曲线示意图，其中显示了相对于反应时间荧光信号水平的改变。
图7是表明DNA/RNA杂合探针结构的示意图，其为本发明通用探针的一个实施例。
图8是表明使用两种类型的通用探针通过实时NASBA检测结果的曲线示意图，其中显示了相对于反应时间荧光信号水平的改变。
图9是表明使用本发明方法在一个单独反应试管中病毒的碱基序列测定基因型的示意图。
图l0是一个图表，表明使用五种类型探针分类HCV病毒核心基因的结果，并表明每种荧光团的荧光强度。
图11是表明应用NASBA时扩增和发光过程的示意图。
图12是表明分子信标(Molecular Beacon)探针的发光机制示意图。
具体实施例以下结合附图，详细描述本发明。
1、导入引物的设计图1是显示本发明表达基因分析方法的示意图，其中，数字1表示样品靶RNA，数字11表示导入引物(逆转录引物)。导入引物11由与靶RNA杂交的序列部分12，比序列部分12更靠近5’端的并且含有与检测探针相同序列的序列部分13，和包含T7启动子序列比序列部分13更靠近5’端的序列部分14组成。
上述序列部分12，13，14可以是连续的，也可以在两部分之间有一个连接部分。序列部分12的长度没有特殊限制，优选18～25个碱基。序列部分13长度没有特别限制，优选18～30个碱基。序列部分14长度没有特别限制，优选20-25个碱基。虽然序列部分12是根据靶基因序列而变化，但序列部分13可以不考虑靶基因序列而自由设计。序列部分14也与靶基因序列无关，设计成包括RNA聚合酶转录起始所必需的启动子序列或转录起始位点。例如，当用来源于T7噬菌体的T7 RNA聚合酶作为RNA聚合酶时，必须设计一段包含有T7启动子序列的序列。
2.待分析基因的合成(逆转录成cDNA)上述导入引物被用作逆转录引物，cDNA由含有靶基因的mRNA合成。逆转录按照现有技术中的方法完成。上述引物，逆转录酶和底物添加到包含有靶RNA的反应溶液中，混合物在35-45℃孵育30-60分钟。任何逆转录酶没有特殊限制都可以使用，当从单链cDNA合成双链cDNA时，一种酶必须也具有DNA聚合酶的功能。其可以使用的例子包括M-MLV逆转录酶，AMV-逆转录酶，Omniscript-逆转录酶(QIAGEN)，和Sensiscript(QIAGEN)。
作为逆转录的结果，含有第一碱基序列13和第二碱基序列14的cDNA(其对靶基因序列是非特异的并且可以导入靶基因)可以作为待分析基因(第一链)而合成。
3、引物及通用探针的设计描述通过NASBA用于扩增上述合成的待分析基因的引物的设计以及用于表达基因分析的通用探针的设计。
如图1所示，与待分析基因杂交的上游引物10和导入引物11被用做扩增引物。
探针15，所含序列与导入待分析基因的序列部分13相同，被用做检测扩增产物的探针。探针15标记有图中表示为“F”的荧光团16和图中表示为“Q”的淬灭剂17。在最初状态时，荧光团16的荧光通过荧光能量转移而消除。然而，随着扩增过程，探针15释放出荧光团并使其发射光。所采用的荧光团的例子包括荧光素，四氯荧光素，六氯荧光素，罗丹明(rhodamine)，BODIPY，四甲基罗丹明，Cy2，Cy3，Cy3B，Cy5，Cy7，Texas Red，ROX，FAM，和VIC。淬灭剂的例子包括4-(4-二甲基氨基苯偶氮)苯甲酸(DABCYL)，Cy5Q，Cy7Q，NFQ，BHQ-0，BHQ-1，和BHQ-2。在上述荧光团中，当与另一种类型的荧光团接触会淬灭荧光的那些荧光团用做淬灭剂。
为了避免因逆转录酶或RNA聚合酶而被延伸，探针15的3’端应该磷酸化。
导入引物11(逆转录引物)与探针15之间的序列相关性如图2所示。在本图中，探针和引物的5’端都是在左边而3’端是在右边。
如图2(a)所示，导入引物11(逆转录引物)是由与靶RNA杂交的序列部分12，具有与探针15相同序列的序列部分13，和包含有RNA聚合酶启动子序列(如T7启动子序列)的序列部分14组成。序列部分14位于最靠近5’端，序列部分13比序列部分14更靠近3’端，序列部分12比序列部分13更靠近3’端。探针15在其5’端标有荧光团16，在3’端标有淬灭剂17。
如图2(b)所示，除了其上导入引物18(逆转录引物)与靶RNA杂交的序列部分12，具有与探针15相同序列的序列部分13，含有T7启动子序列的序列部分14之外，可能还存在一个序列19，其是两个序列部分之间的连接部分。连接部分的长度没有特殊限制，优选1-5个碱基。
探针15发射荧光的机制如图3所示。探针15在扩增中与DNA链3杂交，经过核酸外切酶或核糖核酸酶H水解而发射荧光。水解的结果是，产生游离的荧光团20并且发射荧光。与DNA链3杂交的探针15被具有5’→3’核酸外切酶活性的酶(如T7基因6核酸外切酶或Lamda核糖核酸酶)从探针15的5’端消化，被有3’→5’核酸外切酶活性的酶(如核酸外切酶III)从3’端消化，或被只消化DNA/RNA杂交链中RNA链的核糖核酸酶H消化。使用核糖核酸酶H时，探针15应当是具有RNA骨架的RNA探针或具有DNA/RNA杂合骨架的探针。
探针15的序列设计可以不考虑靶RNA的序列。当分析另一个靶RNA时，重新设计逆转录引物11中序列部分12和上游引物10的序列就已足够，探针15可用做通用探针。
4、扩增与荧光发射扩增是依据现有技术的已知方法完成，将待分析基因，上游引物，导入引物和探针放在一个反应试管中，使用逆转录酶，RNA聚合酶，核糖核酸酶H或核酸外切酶。
NASBA扩增过程和荧光发射过程如图1所示。开始，导入引物11与待分析基因1杂交，逆转录进行，然后合成第一链cDNA2。第一链cDNA2包括导入的第一序列部分13和第二序列部分14。第二序列部分14包含有T7启动子序列。随后，上游引物10与第一链cDNA2杂交，在逆转录酶的DNA聚合酶作用下合成第二链cDNA3，从而产生了含有T7启动子序列的双链cDNA。
双链cDNA含有T7启动子序列，因此，在T7RNA聚合酶的作用下转录许多RNAs(cRNAs)4。上游引物10与转录的RNA4杂交，逆转录开始进行，合成cDNA5。更进一步，导入引物11与cDNA5杂交，一条DNA链合成，新的双链cDNA6合成。
探针15与双链cDNA6中的第二链cDNA3杂交。探针15被核酸外切酶水解。水解的结果是荧光团16从探针15中释放出来，产生了游离的荧光团20，从而发射荧光。
图1说明探针15具有DNA骨架并被核酸外切酶水解的情况。当探针15是DNA/RNA杂合骨架时，检测可以类似进行。在这种情况下，探针15与第二链cDNA3杂交，得到的DNA/RNA杂交链中的RNA链被核糖核酸酶H水解。
图1显示了逆转录引物11包含有对靶基因非特异的第一序列部分13的一种情况。替代地，非特异的第一序列部分13比上游引物10更靠近5’端。
除了TaqMan探针，还可应用分子信标探针。导入引物181可以包含与靶RNA杂交的序列部分182(第三序列部分)，含有RNA聚合酶启动子序列的序列部分184(第二序列部分)。上游引物180可以包含与靶RNA杂交的序列部分179(第三序列部分)和含有探针序列相同序列的序列部分183(第一序列部分)。
如图11所示，导入引物181设计包括比第三序列部分182更靠近5’端的第二序列部分184。上游引物180设计包括比第三序列部分179更靠近5’端的第一序列部分183。
应用NASBA时扩增及发射荧光过程如图11所述。开始，导入引物181与待分析基因171杂交，逆转录开始，由此合成被第二序列部分184导入的第一链cDNA172。随后，上游引物180与第一链cDNA172杂交，然后在逆转录酶的DNA聚合酶的作用下合成被第一序列部分183导入的第二链cDNA173。作为结果，合成了被具有T7启动子序列的第二序列部分184和第一序列部分183导入的双链cDNA176。
由于双链cDNA176含有T7启动子序列，在T7RNA聚合酶的作用下，转录许多RNAs(cRNAs)174。上游引物180与转录的RNA174杂交，逆转录开始，从而合成cDNA175。更进一步，导入引物181与cDNA175杂交，合成一条DNA链，随后产生新的双链cDNA176。
分子信标探针185与导入双链cDNA176中的第一序列部分183的互补序列进行杂交。作为杂交的结果，分子信标探针185的环形结构被解离，消除了由淬灭剂引起的能量转移，从而分子信标探针185发射荧光。
如图12所示，分子信标探针185是由与靶RNA杂交的序列部分190和形成基础框架的序列部分191组成。当不存在靶RNA时，保持该探针的环形结构，并且因为荧光能量转移不发射荧光。存在靶RNA时，探针的环形结构解离，荧光团与淬灭剂之间的距离变大，由此因为能量转移的消除而导致发射荧光。
与图12所示情况类似，上游引物可以包括第一序列部分54或更靠近与其靶基因杂交的序列的5’端的第一序列部分74。
如前所述，探针15与在NASBA反应中产生的第二链cDNA3杂交，被核酸外切酶或核糖核酸酶H水解，然后发射荧光。因此，发射荧光的量随着所扩增的靶基因量的增加而增加。因此，样品中的靶基因的量就可以被分析出来。不同于PCR的是，NASBA反应是在恒温条件下进行(40℃～42℃)。所以，可以减少源于基因组DNA的扩增副产物。这可以改善测定靶基因的准确性。
5、几种靶核酸的同时检测描述一种同时检测几种靶基因的方法(对几种靶核酸的同时检测)，使用两种或更多种通用探针并且一个靶基因使用一个简单的反应容器。
5.1两种或更多种通用探针的设计图4示意表明了两种通用探针的结构，探针A(图4中30)和探针B(图4中40)，其可用来同时测定几种靶核酸。
探针A在其5’端标有荧光团31在图中标为“R1”，3’端标有淬灭剂32，其通过荧光能量转移淬灭源于R1的荧光。如同探针A的情况，探针B在5’端标有荧光团41在图中标为“R2”，3’端标有淬灭荧光的淬灭剂32。
标在探针B5’端的R2应该是以不同于R1的荧光波长发射光的荧光团。因此，基于R1和R2荧光波长的不同，荧光是否源于探针A或探针B都能被检测到。
而且，探针A和探针B设计成在相同的反应特性下与每个靶基因杂交。如图4所示，探针A的序列和探针B的序列都是由每个含有3-4个碱基的模块序列34～39组成。组成探针的模块序列的数目没有特殊限制。通常情况，优选5～8个。每个模块序列的两个末端碱基相同。探针B的序列是通过重排具有与探针A的序列相同的末端碱基的模块而形成的。由于重排具有相同末端碱基的模块，而探针A的模块之间连接部分的碱基序列与探针B的相同。探针A与探针B是由相同的模块组成。因此，探针A与探针B的热力学特性相同，根据最近邻域计算方法得到的探针A与探针B的Tm值也彼此相同。
特别地，探针A的全部序列不同于探针B的全部序列。然而，这些探针大致上有同样的Tm值，能够与具有相同反应特性的互补序列杂交，因此可以在相同反应试管中同时反应。所以，当这些探针用于定量分析时可以作出准确的分析。关于两种探针的设计如上所述。三种或更多种探针可以同样设计。
5.2待分析基因的合成(逆转录cDNA)图5显示了在一个反应试管中用探针A和探针B经NASBA扩增检测两种靶基因(基因i和基因ii)的方法。首先，cDNA由靶基因(i)制备。数字51表示靶基因(i)，数字52表示逆转录引物。逆转录引物52是由与靶基因杂交的序列部分53，比序列部分53更靠近5’端并且具有与检测探针相同序列的序列部分54，和比序列部分54更靠近5’端并且包含有T7启动子序列的序列部分55组成。使用该引物按照上述4同样的方式完成逆转录。因此，得到含有导入的序列部分54和序列部分55的第一链cDNA56。
另一个源于靶基因(ii)的cDNA按照制备第一链cDNA56同样的方式合成。数字71代表基因(ii)，数字72代表逆转录引物。逆转录引物72是由与靶基因杂交的序列部分73，比序列部分53更靠近5’端并含有与检测探针相同序列的序列部分74，和比序列部分74更靠近5’端并含有T7启动子序列的序列部分55组成。同样地，靶基因(ii)也是通过逆转录得到含有序列部分74和在其上导入的序列部分55的第一链cDNA76。逆转录引物52的序列部分55与逆转录引物72的序列部分55彼此相同的。逆转录引物52的序列部分54与逆转录引物72的序列部分74分别与探针A和探针B相符合，如图4所示，它们有相同的Tm值。
5.3同时检测同时检测在图5中的图示描述。从反应试管中取出一部分产生的第一链cDNA56和一部分第一链cDNA76，取相同的量在一个新的反应试管中混合。合成物作为模板。如图5所示，第一链cDNA56和第一链cDNA76可以在各自的反应试管中制备。替代地，它们也可以在相同的反应试管中制备。可以使用与第一链cDNA56和第一链cDNA76杂交的上游引物65，逆转录引物52(也可以作为导入引物)，和逆转录引物72(也可以作为导入引物)。
探针57，其具有与导入第一链cDNA56中的序列部分54的相同序列，和探针77，其具有与导入第一链cDNA76中的序列部分74的相同序列，可以作为用于检测的通用探针。
探针57标有荧光团58，图中表示为“R1”，和淬灭剂59，图中表示为“Q”。探针77标有荧光团78，图中表示为“R2”，和淬灭剂79，图中表示为“Q”。如果这种淬灭剂能够分别淬灭荧光团58和78所发射的荧光，那么淬灭剂59和79可以是相同的。当探针57与探针77在最初状态时，荧光团58和78的荧光通过荧光能量转移而消除。
在逆转录酶的作用下第二链cDNA60由第一链cDNA56合成。从而产生含有T7启动子序列的双链cDNA61。第二链cDNA80由第一链cDNA76合成。从而，产生含有T7启动子序列的双链cDNA81。由于双链cDNA61和81含有T7启动子序列，所以在T7 RNA聚合酶的作用下转录RNA(cRNA)62和82。上游引物65与转录的RNA62杂交，逆转录开始，合成cDNA63。导入引物52与cDNA63杂交，由引物合成DNA，继而新合成双链cDNA61。同样地，上游引物75与转录的RNA82杂交，逆转录开始，合成cDNA83。更进一步，导入引物72与cDNA83杂交，由引物合成DNA，继而新合成双链cDNA81。
探针57与双链cDNA61的第二链cDNA60杂交。探针57被核酸外切酶水解。作为水解的结果，荧光团从探针57释放出来，产生游离荧光团64，从而发射荧光。探针77与双链cDNA81的第二链cDNA80杂交。探针77被核酸外切酶水解。作为水解的结果，荧光团从探针77释放出来，产生游离荧光团84，从而发射荧光。
在反应过程中产生的自由荧光团64与自由荧光团84的数量比依赖于反应开始前反应试管中存在的cDNA56与cDNA76的数量比。因此，比较这两种荧光团所发出的荧光信号的强度就可以分析cDNA56与cDNA76的量化比。特别地，几种靶基因可被同时检测。
图5显示了探针57和77具有DNA骨架时并被核酸外切酶水解的情况。当探针57和探针77是有DNA/RNA杂合骨架时，检测可以类似地进行。在这种情况下，探针57或77与第二链cDNA60或80杂交，并且只有DNA/RNA杂交链(探针)产生的RNA链才可以被核糖核酸酶H水解。
如前所述，本发明方法可以同时在一个样品中检测几种靶基因的量。在这种情况下，由于一次操作可以对一个诊断客体的几种项目进行检测，能够增强感染诊断中的检测准确性。
6.病毒碱基序列的基因型现在描述在一个反应容器中用两种或更多种通用探针对病毒碱基序列(病毒基因型)测定基因型的方法。
6.1两种或更多种通用探针的设计两种或更多种通用探针的设计按照5.1进行。
6.2待分析基因的合成(逆转录成cDNA)图9显示了一种通过NASBA在一个简单反应试管中用探针A，B，C，D，E对病毒碱基序列测定基因型的方法。图9表示在5种基因型中，第一基因型是靶基因。最初，cDNA由靶基因制备。数字101代表靶基因，数字112，122，132，142，和152代表逆转录引物。逆转录引物112是由与靶基因杂交的序列部分113，比序列部分113更靠近5’端并含有与检测探针序列相同序列的序列部分114，和比序列部分114更靠近5’端并含有T7启动子序列的序列部分115组成。同样地，逆转录引物122，132，142，和152各自独立地由与靶基因杂交的序列部分123，133，143和153，比序列部分123，133，143和153更靠近5’端并含有与检测探针相同序列的序列部分124，134，144和154，和比序列部分124，134，144和154更靠近5’端并含有T7启动子序列的序列部分115组成。
逆转录按照类似前面4描述的方式进行，使用这些逆转录引物来获得含有序列部分114和在其上导入115的第一链cDNA102。如上所述，图9举例说明该基因的第一基因型为靶基因。因此，图9显示了靶基因101与逆转录引物112反应的一种情况。当靶基因具有另一种基因型时，这个基因就可以与逆转录引物122，132，142，或152中的任何一种反应。因此，就可以得到含有序列部分124，134，144，154和在其上导入115的第一链cDNA。在随后的反应中，当靶基因具有另一种基因型时，与序列部分114等同的部分可以由序列部分124，134，144或154替代，并且与探针116等同的部分可以由探针126，136，146或156替代。
逆转录引物112，122，132，142，和152的序列部分115彼此相同。如图4所示探针A和探针B的情况，逆转录引物112，122，132，142，和152的序列部分114，124，134，144和154具有相同的Tm值。
6.3在一个反应容器中测定基因型在图9中显示了在单一反应容器中测定基因型的过程。将作为模板的获得的部分或全部第一链cDNA放在一个新的反应试管中。使用与第一链cDNA杂交的上游引物111，121，131，141和151，以及逆转录引物112，122，132，142，和152。上游引物111，121，131，141和151其中的一种与逆转录引物112，122，132，142，和152其中的一种，与第一链cDNA反应。图9表明一个例子，其中上游引物111和逆转录引物112与第一链cDNA 102反应。
探针116，126，136，146和156被用做检测用的通用探针。通用探针116，126，136，146和156具有分别与逆转录引物的序列部分114，124，134，144和154相同的序列。换言之，通用探针116，126，136，146和156中的一种具有与导入第一链cDNA中的逆转录引物的序列部分相同的序列。图9表明一个例子，其中序列部分114导入第一链cDNA102中。
探针116标有荧光团117，图中标为“R1”，和淬灭剂108，图中标为“Q”。探针126标有荧光团127，图中标为“R2”，和淬灭剂108，图中标为“Q”。探针136标有荧光团137，图中标为“R3”，和淬灭剂108，图中标为“Q”。探针146标有荧光团147，图中标为“R4”，和淬灭剂108，图中标为“Q”。探针156标有荧光团157，图中标为“R5”，和淬灭剂108，图中标为“Q”。当探针116，126，136，146和156在最初状态时，荧光团117，127，137，147，和157的荧光通过荧光能量转移而消除。
第二链cDNA103在逆转录酶的作用下由第一链cDNA102合成。这就合成了含有T7启动子序列的双链cDNA104。由于双链cDNA104包含T7启动子序列，在T7RNA聚合酶的作用下转录RNA(cRNA)105。上游引物111与转录的RNA(cRNA)105杂交，逆转录开始，然后合成cDNA106。进一步，逆转录引物112与cDNA106杂交，由引物合成一条DNA，继而新合成双链cDNA104。
探针116与双链cDNA104的第二链cDNA103杂交。探针116被核酸外切酶水解。作为水解的结果，荧光团从探针116释放出来，生成游离的荧光团107，从而发射荧光。
随着反应的进行生成源于探针116的游离荧光团107。由于被消化的探针依据靶基因的基因型而随之不同，游离荧光团的类型也改变。因此，对荧光团的类型和荧光强度可以判断靶基因的基因型。特别地，病毒在单一反应容器中测定基因型。
如前所述，样品中含有的病毒可以在单一反应容器中测定基因型。这使得可以同时测定几种项目并可以直接比较荧光团的类型和荧光强度。从而，提高测定基因型准确性。
7、试剂盒按照本发明方法，是将与靶基因序列无关的第一碱基序列和第二碱基序列导入靶基因。其可以提供普遍用于任何种类靶基因的TaqMan探针(通用探针)和分子信标(通用分子信标)。当用于检测另一种靶基因时，只需修正导入引物(逆转录引物)中与靶基因杂交部分的序列和上游引物的序列。
更特殊地，本发明提供一种用于表达基因分析包含普遍应用探针的试剂盒。这个试剂盒可用于检测单一基因，也可以用于同时检测几种基因。试剂盒的特性和基本要件构成和通用探针的特性和基本要件构成如上所述。
除了作为基本要件的通用探针，本发明的试剂盒还可以包含有其他酶，试剂或者对本发明用于表达基因分析方法是必要的类似物。其例子包括逆转录酶，RNA聚合酶，核糖核酸酶H，核酸外切酶，一个为酶反应提供适合条件的缓冲液，和其他用于检测合成产物的必需试剂。该试剂盒还可以包括上游引物或特殊靶基因的导入引物，或者可以提供一种试剂，其对反应是必须的，以分装的形式放在单一反应容器中。通用探针不局限于TaqMan探针，它也可以是分子信标(Molecular Beacon)。
结合以下试验例更为详尽的描述本发明，虽然本发明不局限于这些试验例。
试验例1、用通用探针检测人类乳头瘤病毒(1)检测方法从收集的子宫颈样品中提取DNA，用下列扩增人类乳头瘤病毒E6基因的上游引物和导入引物合成双链DNA。
上游引物5＇-AAGGG CGTAA CCGAA ATCGG T-3＇(SEQ ID NO1)导入引物5＇-AATTC TAATA CGACT CACTA TAGGG CCC TTCT CACTGTT CTC TCAT GTTTG CAGCT CTGTG CATA-3＇(SEQ ID NO2)双链DNA合成将15pmol的上游引物(SEQ ID NO1)，15pmol的导入引物(SEQ ID NO2)，提取的DNA，和逆转录酶(Superscript II逆转录酶)加到反应缓冲液中，混合物在41℃孵育30分钟。
通过NASBA的扩增和检测是使用序列检测系统(Sequence DetectionSystem 7900)(Applied BioSystems)完成。将上面合成的双链DNA，15pmol的上游引物(SEQ ID NO1)，15pmol的导入引物(SEQ ID NO2)，5pmol的5’端标有荧光团FAM，3’端标有淬灭剂DABCYL的探针(SEQ ID NO3)混合在20ul的反应溶液中。向其中加入逆转录酶，T7RNA聚合酶，T7基因6核酸外切酶，和底物dNTP和NTP，然后混合物在41℃孵育90分钟。探针序列如下所示探针5＇-(FAM)-CCC TTCT CAC TGTT CTC TCAT-(DABCYL)-3＇(SEQ ID NO3)(2)结果图6显示了在每一指定时间期间荧光检测结果。曲线的水平轴代表反应的时间，其中的垂直轴代表荧光强度(任意单位)。曲线图显示从含有由靶基因制备的双链DNA的样品中所发射出来的荧光信号强度的变化。扩增的产物被实时检测并且其发出的荧光信号的水平达到特定阈值时，就可以确定靶基因的检测。
试验例2、几种靶核酸的同时测定本试验例中根据本发明方法在单一反应容器扩增和检测几种靶基因。
(1)检查方法胰岛素基因的A链和B链区域进行逆转录，制备这些基因的第一链cDNA。下面列出了用于胰岛素基因A链区域的上游引物(SEQ ID NO4)和逆转录引物(SEQ ID NO5)，以及用于胰岛素基因B链区域的上游引物(SEQ ID NO6)和逆转录引物(SEQ ID NO7)。
A链区域的上游引物5＇-TGGTG CAGGC AGCCT GCA-3＇(SEQ IDNO4)A链区域的逆转录引物5＇-AATTC TAATA CGACT CACTA TAGGGCCC TTCT CAC TGTT CTC TCATTAGTT GCAGT AGTTC TCCAG-3＇(SEQ ID NO5)B链区域的上游引物5＇-CCAGC CGCAG CCTTT GTGA-3＇(SEQ IDNO6)
B链区域的逆转录引物5＇-AATTC TAATA CGACT CACTA TAGGGCACTCAT CTC TTCT CCC TGTT CAGGTCCTCT GCCTC CCGG-3＇(SEQ IDNO7)用于胰岛素基因A链区域和用于胰岛素基因B链区域的逆转录引物按照图5进行设计。特别地，尽管含有T7启动子序列的序列部分55共同存在，但是，都含有与检测探针相同序列并且位于3’端的序列部分54和序列部分74(划线部分)却是不同的。而且，位于3’端的序列部分53和序列部分73以及对每个基因区域的识别也是彼此不同的。
从反应试管中取出每个得到样品的等量cDNA，在新的反应管中混合。使用产生的混合物为模板，上游引物(SEQ ID NO4和6)，逆转录引物(SEQ ID NO5和7)和两种探针，从而进行NASBA。
以下DNA/RNA杂合探针(SEQ ID NO8和SEQ ID NO9)作为检测胰岛素A链的探针(探针A)和检测胰岛素B链的探针(探针B)。
探针A5＇-(FAM)-d(CCC TTCT)r(CAC UGUU)d(CTCTCAT)-(DABCYL)-3＇(SEQ ID NO8)探针B5＇-(VIC)-d(CAC TCAT)r(CUC UUCU)d(CCCTGTT)-(DABCYL)-3＇(SEQ ID NO9)按照图4所设计的两种探针的Tm值大致相同。探针A的5’端标有荧光团FAM，探针B的5’端标有荧光团VIC，两种探针的3’端分别标有淬灭剂DABCYL。如图7所示，在探针A和探针B中，组成探针的21个碱基的中间7个碱基是由RNA骨架93组成。DNA骨架92和94靠近RNA骨架的5’端和3’端。5’端标有荧光团R95，3’端标有淬灭剂96。因此当与靶杂交时，探针中间的7个碱基形成DNA/RNA杂合体，该杂合体被核糖核酸酶H消化，产生游离荧光团，发射出荧光，如图3所示。
通过NASBA的扩增和检测是使用序列检测系统7900(AppliedBioSystem)完成的。提取的RNA，10pmol的上游引物(SEQ ID NO4和5)，10pmol的导入引物(SEQ ID NO6和7)，5pmol的的5’端标有荧光团FAM或VIC以及3’端标有淬灭剂DABCYL的探针(SEQID NO8和9)混合在20ul的反应溶液中。然后，其中加入逆转录酶，T7 RNA聚合酶，核糖核酸酶H和底物，然后混合物在41℃孵育90分钟。
(2)结果图8显示用两种探针同时检测胰岛素基因的A链和B链区域的实验结果。曲线图的水平轴代表反应时间，垂直轴代表荧光团的相对荧光强度。图8曲线图显示了用探针A(用正方形图标表示)检测胰岛素基因A链的扩增产物和用探针B(用圆形图标表示)检测胰岛素基因B链的扩增产物时荧光信号强度的变化。从曲线图明显看到，探针A和探针B同时分别同时检测靶基因。
试验例3、检测病毒碱基序列的基因型接着，再提供一个按照本发明方法在单一反应试管中扩增和测定病毒碱基序列的基因型。C型肝炎病毒(HCV)主要通过血液传播，从而导致急性和慢性肝炎。HCV迅速的引起基因突变，已知5种基因型时主要的基因型，I/1a，II/1b，III/2a，IV/2b，和V/3a。干扰素的治疗效果的改变取决于这些基因型。通过测定HCV基因型，可以获到关于病理条件及其过程有用的临床信息。因此测定C型肝炎病毒的基因型是临床检验的一个主要指标。
(1)检查方法C型肝炎病毒(HCV)的核心基因是通过逆转录制备这些基因的第一链cDNA。以下引物是作为核心基因的上游引物(SEQ ID NO10-14)和逆转录引物(SEQ ID NO15-19)从样品血中提取的RNA属于I/1a，II/1b，III/2a，IV/2b，和V/3a中的任何一种，图9显示属于I/1a基因型的RNA。
核心基因的逆转录引物112，122，132，142，和152与基因型I/1a，II/1b，III/2a，IV/2b，和V/3a分别相对应，并且按照图9设计而成。特别地，尽管含有含T7启动子序列的序列部分115共同存在，但是包含有靠近3’端与检测探针相同序列的序列部分114，124，134，144，154并且识别各自基因区域的序列部分113，123，133，143，153是互不相同的。
核心基因I/1a的上游引物5＇-GGTCG CAACG TCGAG GTAGA-3＇(SEQ ID NO10)核心基因II/1b的上游引物5＇-CGCAA CCTCG TGGAA GGCGA-3＇(SEQ ID NO11)核心基因III/2a的上游引物5＇-CCCCC CGAGG TTCCC GTGCC-3＇(SEQ ID NO12)核心基因IV/2b的上游引物5＇-CTGTA CGGAA ACGAG GGTTG-3＇(SEQ IDNO13)核心基因V/3a的上游引物5＇-CGACG CGTAA AACTT CTCAA-3＇(SEQ ID NO14)基因型I/1a的逆转录引物5＇-AATTC TAATA CGACT CACTATAGGGCCC TTCT CAC TGTT CTC TCATGAGCC ATCCC GCCCACCAGC-3＇(SEQ ID NO15)基因型II/1b的逆转录引物5＇-AATTC TAATA CGACT CACTATAGGGCAC TCAT CTC TTCT CCC TGTTGAGCC ATCCT GYCCACGCYA-3＇(SEQ ID NO16)基因型III/2a的逆转录引物5＇-AATTC TAATA CGACT CACTATAGGGCTC TGTT CCC TCAT CAC TTCTCCTTA CCCAC GTTGCGCTAC-3＇(SEQ ID NO17)基因型IV/2b的逆转录引物5＇-AATTC TAATA CGACT CACTATAGGGCCC TTCT CTC TCAT CAC TGTTGGTCG GTGGG GCCCCAATTA-3＇(SEQ ID NO18)基因V/3a的逆转录引物5＇-AATTC TAATA CGACT CACTA TAGGGCAC TCAT CCC TGTT CTC TTCTAGGAC CGGCC TTCGC TCCG A-3 ＇(SEQ ID NO19)
用获得的部分cDNA作为模板，上游引物111，121，131，141和151(SEQ ID NO10，11，12，13和14)，逆转录引物112，122，132，142和152(SEQ ID NO15，16，17，18和19)，和5种用于检测核心基因116，126，136，146，和156(SEQ ID NO20，21，22，23和24)的探针，进行NASBA反应。
下列引物(SEQ ID NO20，21，22，23和24)被作为检测核心基因(探针A，B，C，D和E)的探针116，126，136，146，和156。
探针A5＇-(FAM)-CCC TTCT CAC TGTT CTC TCAT-(DABCYL)-3＇(SEQ IDNO20)探针B5＇-(TET)-CAC TCAT CTC TTCT CCC TGTT-(DABCYL)-3＇(SEQ IDNO21)探针C5＇-(HEX)-CTC TGTT CCC TCAT CAC TTCT-(DABCYL)-3＇(SEQ ID NO22)探针D5＇-(ROX)-CCC TTCT CTC TCAT CAC TGTT-(DABCYL)-3＇(SEQ IDNO23)探针E5＇-(Cy5)-CAC TCAT CCC TGTT CTC TTCT-(DABCYL)-3＇(SEQ IDNO24)所设计的探针有大致相同的Tm值，如图4所示。探针A，B，C，D，E在它们的5’端分别标有荧光团FAM，TET，HEX，ROX和CY5，在3’端分别标有淬灭剂DABCYL。因此，当与靶基因杂交时，它们被T7基因6核酸外切酶消化，产生游离荧光团，发射荧光，如图3所示。
经NASBA扩增后，用荧光光度计来检测样品的荧光强度。将提取的RNA，10pmol的上游引物(SEQ ID NO10，11，12，13和14)，10pmol的逆转录引物(SEQ ID NO15，16，17，18和19)，5pmol的的5’端标有荧光团FAM，TET，HEX，ROX或CY5，3’端标有淬灭剂DABCYL的探针(SEQ ID NOs20，21，22，23和24)混合在20ul的反应溶液中。更进一步，其中混入逆转录酶，T7RNA聚合酶，核糖核酸酶H，T7基因6核酸外切酶和底物，然后混合物在41℃孵育90分钟用于扩增。分析得到的反应产物的荧光强度从而测定基因类型。
(2)结果图10表明了在单一反应容器中用5种探针测定HCV病毒的核心基因型的实验结果。
曲线的水平轴代表每种荧光团的类型，垂直轴代表荧光团的相对荧光强度(任意单位)。从图10明显看到，只有荧光团FAM的荧光强度几乎是其他四种荧光团的10倍。这就意味着探针A被消化。因此，可以确定HCV病毒的核心基因具有I/1a基因型。所以，通过测定在单一反应容器中检测到的荧光团的种类和荧光强度来完成核心基因的基因型的检测。
工业实用性本发明提供了一种用于表达基因分析的通用探针。由于其通用性，花费集中的探针不需要按照靶基因的碱基序列为每一种用途进行设计。而且，任何类型的靶基因都能在几乎同样的条件下被扩增和检测，并且分析可以简单完成。由于扩增在恒温条件下进行，可以减少副产物的生成，在高准确性下进行检测。由于本发明在单一反应容器中使用两种类型的通用探针，使得可以对几种靶基因同时进行实时检测。这就可以实现更准确的检测和病毒类型鉴定。
在此引用的所有出版物，专利，和专利申请整体上作为参考在此合并。
序列表<110>株式会社日立制作所<120>表达基因分析方法以及用于表达基因分析的探针试剂盒<130>PH-1932<140>
<141>
<150>JP 2003-114721<151>2003-04-18<160>24<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>发明人植松千宗；冈野和宣<220>
<223>人工序列说明在NASBA反应中并与人类乳头瘤病毒DNA杂交的上游DNA引物
<400>1aagggcgtaa ccgaaatcgg t21<210>2<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明 用于NASBA反应并与人类乳头瘤病毒DNA杂交的下游DNA引物<400>2aattctaata cgactcacta tagggccctt ctcactgttc tctcatgttt gcagctctgt 60gcata 65<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明用于实时检测扩增片段的DNA探针<400>3cccttctcac tgttctctca t21
<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明用于NASBA反应并与人类胰岛素基因杂交的上游DNA引物<400>4tggtgcaggc agcctgca 18<210>5<211>66<212>DNA<213>人工序列<220>
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<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明用于NASBA反应并与人类胰岛素基因杂交的上游DNA引物<400>6ccagccgcag cctttgtga19<210>7<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明用于NASBA反应并与人类胰岛素基因杂交的下游DNA引物<400>7aattctaata cgactcacta tagggcactc atctcttctc cctgttcagg tcctctgcct60cccgg65<210>8<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明用于实时检测扩增片段的DNA/RNA杂合探针<400>8cccttctcac uguuctctca t 21<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明用于实时检测扩增片段的DNA/RNA杂合探针<400>9cactcatcuc uucuccctgt t 21<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明用于NASBA反应并与C型肝炎病毒基因型I/1a的核心基因杂交的上游DNA引物<400>10ggtcgcaacg tcgaggtaga 20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明用于NASBA反应并与C型肝炎病毒基因型II/1b的核心基因杂交的上游DNA引物<400>11cgcaacctcg tggaaggcga20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明用于NASBA反应并与C型肝炎病毒基因型III/2a的核心基因杂交的上游DNA引物<400>12
ccccccgagg ttcccgtgcc20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明用于NASBA反应并与C型肝炎病毒基因型IV/2b的核心基因杂交的上游DNA引物<400>13ctgtacggaa acgagggttg20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明用于NASBA反应并与C型肝炎病毒基因型V/3a的核心基因杂交的上游DNA引物<400>14cgacgcgtaa aacttctcaa20
<210>15<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明用于NASBA反应并与C型肝炎病毒基因型I/1a的核心基因杂交的下游DNA引物<400>15aattctaata cgactcacta tagggccctt ctcactgttc tctcatgagc catcccgccc60accagc 66<210>16<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明用于NASBA反应并与C型肝炎病毒基因型II/1b的核心基因杂交的下游DNA引物<400>16aattctaata cgactcacta tagggcactc atctcttctc cctgttgagc catcctgycc60acgcya 66<210>17
<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明用于NASBA反应并与C型肝炎病毒基因型III/2a的核心基因杂交的下游DNA引物<400>17aattctaata cgactcacta tagggctctg ttccctcatc acttctcctt acccacgttg60cgctac 66<210>18<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明用于NASBA反应并与C型肝炎病毒基因型IV/2b的核心基因杂交的下游DNA引物<400>18aattctaata cgactcacta tagggccctt ctctctcatc actgttggtc ggtggggccc60caatta 66<210>19<211>65
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明用于NASBA反应并与C型肝炎病毒基因型V/3a的核心基因杂交的下游DNA引物<400>19aattctaata cgactcacta tagggcactc atccctgttc tcttctagga ccggccttcg60ctccga 66<210>20<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明检测扩增片段所用的DNA探针<400>20cccttctcac tgttctctca t 21<210>21<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明检测扩增片段所用的DNA探针<400>21cactcatctc ttctccctgtt21<210>22<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明检测扩增片段所用的DNA探针<400>22ctctgttccc tcatcacttc t 21<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明检测扩增片段所用的DNA探针<400>23cccttctctc tcatcactgtt21
<210>24<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明检测扩增片段所用的DNA探针<400>24cactcatccc tgttctcttc t2权利要求
1.用于表达基因分析的方法，包括使用与待分析基因特异性杂交的上游引物、导入引物、含有与第一碱基序列相同或互补的碱基序列并且一端用荧光团另一端用淬灭剂进行标记的探针、逆转录酶、RNA聚合酶、以及核糖核酸酶H和/或核酸外切酶，对待分析基因进行核酸扩增，所述导入引物包含一个比含有特异性与靶基因杂交的序列的第三碱基序列更靠近5’端的第一碱基序列以及包含一个比第一碱基序列更靠近5’端的第二碱基序列；在核酸扩增时，用核糖核酸酶H或核酸外切酶消化结合在第一碱基序列上的探针；以及检测释放的荧光团所发出的荧光，从而分析核酸扩增产物的量，其中待分析基因的制备是通过将第一碱基序列和含有对于靶基因的碱基序列是非特异性的RNA聚合酶的启动子序列的第二碱基序列导入靶基因，使得第二碱基序列结合位置比第一碱基序列更靠近5’端。
2.根据权利要求1所述的用于表达基因分析的方法，其中，待分析基因是cDNA，其包括第一碱基序列和在那里通过使用导入引物将靶基因的mRNA进行逆转录而导入的第二碱基序列，导入引物包括比含有与靶基因特异性杂交的序列的第三碱基序列更靠近5’端的第一碱基序列，和比第一碱基序列更靠近5’端的第二碱基序列。
3.根据权利要求1所述的用于表达基因分析的方法，其中，核酸的扩增通过顺次重复以下步骤1)至3)而进行的1)在RNA聚合酶的作用下，将待分析基因转录成RNA；2)通过使用上游引物和逆转录酶或核糖核酸酶H的RNA逆转录来合成单链cDNA；然后3)使用导入引物和DNA聚合酶，由单链cDNA合成待检测基因。
4.根据权利要求1所述的用于表达基因分析的方法，其中，核酸的扩增通过顺次重复以下步骤1)至3)而进行的1)在RNA聚合酶的作用下，将待分析基因转录成RNA；2)通过使用上游引物和逆转录酶或核糖核酸酶H的RNA逆转录来合成单链cDNA3)使用导入引物和逆转录酶，由单链cDNA合成待分析基因。
5.根据权利要求1所述的用于表达基因分析的方法，其中，核酸的扩增在几乎单一温度下进行。
6.根据权利要求5所述的用于表达基因分析的方法，其中，单一温度是在37℃～55℃之间。
7.根据权利要求1所述的用于表达基因分析的方法，其中所述RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶，并且第二碱基序列含有T7启动子序列。
8.根据权利要求1所述的用于表达基因分析的方法，其中，在单一反应容器中用两种或更多探针同时检测两种或更多靶基因。
9.根据权利要求8所述的用于表达基因分析的方法，其中，两种或更多探针的融化温度(Tm值)大致相同。
10.用于表达基因分析的试剂盒，包括至少一种探针，其含有与第一碱基序列相同或互补的碱基序列，并且一端标有荧光团及另一端标有淬灭剂，其中，第一碱基序列和含有RNA聚合酶启动子序列的第二碱基序列对靶基因的碱基序列都是非特异性的。
11.根据权利要求10所述的用于表达基因分析的试剂盒，其中，所述试剂盒包括具有大致相同Tm值的两种或更多探针。
12.根据权利要求11所述的用于表达基因分析的试剂盒，其中，两种或更多探针中的每个都包括若干含有3或4个碱基的模块序列，每个模块序列的两个末端碱基彼此相同，并且每个探针通过重新排列具有相同末端碱基的模块序列而构成。
13.根据权利要求10所述的用于表达基因分析的试剂盒，其中，第二碱基序列含有T7启动子序列。
全文摘要
本发明提供一种用于检测核酸的新试剂盒，其无关于靶核酸序列而可以被普遍使用，以及一种使用该试剂盒用于检测核酸的简单方法。该方法包括使用含有与靶基因或核酸特异性杂交的碱基序列的引物，和含有与第一碱基序列相同或互补碱基序列的TaqMan探针或分子信标(MolecularBeacon)，对待分析基因进行实时检测，其中待分析基因的制备是通过将第一碱基序列和含有T7启动子序列(其对靶基因或核酸的碱基序列是非特异性的)的第二碱基序列导入靶基因或核酸，使得第二碱基序列结合位置比第一碱基序列更靠近5’端。本发明还提供一种用于检测核酸的通用探针。本发明中两种通用探针的使用实现了在单一反应容器中同时进行几种靶基因的实时检测。
文档编号C12P19/34GK1537954SQ200410039338
公开日2004年10月20日 申请日期2004年1月19日 优先权日2003年4月18日
发明者植松千宗, 冈野和宣, 宣 申请人:株式会社日立制作所